吳秉奇 劉淑杰 陳福明 周楚瑩

（深圳清華大學(xué)研究院 深圳環(huán)境微生物資源開發(fā)與應(yīng)用工程實(shí)驗(yàn)室，深圳 518057）

海洋石油降解菌的篩選及復(fù)合菌系的構(gòu)建

吳秉奇 劉淑杰 陳福明 周楚瑩

（深圳清華大學(xué)研究院 深圳環(huán)境微生物資源開發(fā)與應(yīng)用工程實(shí)驗(yàn)室，深圳 518057）

為采用生物法治理海洋石油污染，以原油為唯一碳源，從深圳海域5個采樣點(diǎn)取樣，通過富集、涂布平板分離高效石油降解菌，并以復(fù)配、正交等方式構(gòu)建石油降解復(fù)合菌系；通過生理生化實(shí)驗(yàn)和16S rRNA 基因序列分析對菌株進(jìn)行鑒定；采用單因素實(shí)驗(yàn)對復(fù)合菌系降解石油的條件進(jìn)行優(yōu)化，并使用氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）研究其對石油的降解特性。結(jié)果顯示，共分離得到22株高效石油降解菌，對石油的降解率為34.5％-52.2％；由S1-30、S1-38和S2-13構(gòu)建了復(fù)合菌系SQ1，對石油降解率可達(dá)68.3％，3株菌分別鑒定為棒桿菌（Corynebacterium sp.）、迪茨氏菌（Dietzia sp.）和拉布倫茨氏菌（Labrenzia sp.）；經(jīng)優(yōu)化，SQ1在最適條件下（30℃、pH7.6、石油濃度20 g/L），11 d內(nèi)對石油的去除率高達(dá)73.5％；GC-MS結(jié)果表明，復(fù)合菌系SQ1對石油總烷烴的去除率為91.7％，對較難降解的C21-C35烷烴組分的降解率接近100％。研究表明，復(fù)合菌系SQ1在海洋石油污染的生物修復(fù)中具有較強(qiáng)的應(yīng)用潛力。

石油降解菌；復(fù)合菌系；降解率；鑒定；條件優(yōu)化

石油是一種重要的戰(zhàn)略性資源，近年來，隨著海洋石油開采業(yè)的發(fā)展和遠(yuǎn)洋運(yùn)輸業(yè)的繁榮，海上溢油事故時有發(fā)生，嚴(yán)重污染了海洋環(huán)境，給海洋生態(tài)平衡帶來了嚴(yán)重的威脅［1］。2010年，美國墨西哥灣鉆井平臺“深水地平線”發(fā)生爆炸，使墨西哥灣沿岸生態(tài)環(huán)境遭遇了“滅頂之災(zāi)”；同年，我國大連新港“7.16”爆炸事故導(dǎo)致上萬噸原油泄漏進(jìn)入渤海灣，這是我國歷史上發(fā)生的最為嚴(yán)重的海上溢油事故［2，3］。據(jù)統(tǒng)計(jì)聯(lián)合國環(huán)境規(guī)劃署報告，每年流入海洋的石油約為2×106-2×107t，海洋石油污染已成為一個世界性的環(huán)境問題［4］。

治理海洋石油污染主要有物理方法、化學(xué)方法及生物方法，其中，生物修復(fù)法是利用微生物對污染物的降解作用達(dá)到去除油污的目的，具有成本低廉、無二次污染、可原位修復(fù)等顯著優(yōu)點(diǎn)［5，6］，篩選優(yōu)良的微生物資源用于石油污染的修復(fù)，已受到人們的廣泛關(guān)注。Hassanshahiand等［7］分離到一株柴油食烷菌（Alcanivorax dieselolei）PG-12；郭平等［8］從表層海水分離到一株廈門棲東海菌（Donghicola xiamenensis）HD-1；姜肸等［9］從南海篩選到6株石油降解菌，分屬于芽孢桿菌（Bacillus）、假單胞菌（Pseudomonas）、交替單胞菌（Alteromonas）等菌屬，均表現(xiàn)出良好的石油降解效果。但由于石油是由各類烷烴、芳烴及其他成分構(gòu)成的復(fù)雜混合物，不同的菌株對不同碳鏈的烷烴、芳烴的降解情況差別較大［10］，利用菌株間的共生、協(xié)同等作用構(gòu)建復(fù)合菌，則可擴(kuò)大對石油類底物的利用范圍和效率，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對污染物的高效降解［11，12］。張海玲等［13］采用4株細(xì)菌構(gòu)建了石油降解菌系；Van Hamme 等［14］將假單胞菌與紅球菌混合培養(yǎng)構(gòu)建復(fù)合菌系；Li等［15］富集得到了菌群KO5-2，相比于單一菌株，均顯著提高了原油的生物降解率。目前，采用復(fù)合菌系修復(fù)海洋石油污染的過程中，尚缺乏對環(huán)境因素作用的系統(tǒng)分析；單一菌株與復(fù)合菌系降解特性比較方面的研究也相對較少。

近岸海域與人類的關(guān)系較為密切，該區(qū)域內(nèi)的石油降解菌較遠(yuǎn)洋中可能存在較大的差別，目前尚未有專門針對該區(qū)域的石油降解復(fù)合菌系的研究。本研究即是以原油為唯一碳源，從深圳近岸海域篩選高效石油降解菌，采用復(fù)配、正交試驗(yàn)等方法構(gòu)建石油降解復(fù)合菌系，并對其降解特性展開充分的研究，旨在為工業(yè)化菌劑的開發(fā)及應(yīng)用提供參考及借鑒。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1海水及石油樣品 海水樣品取自深圳市蛇口港和鹽田港，在113.9°E-114.2°E，22.4°N-22.5°N范圍內(nèi)5個不同位點(diǎn)取樣；實(shí)驗(yàn)用油為惠州大亞灣石化工業(yè)區(qū)提供的原油，25℃下密度約為0.9 g/mL。

1.1.2培養(yǎng)基及試劑 MMC培養(yǎng)基［16］（g/L）：NaCl 24，MgSO4·7H2O 7，NH4NO31，KCl 0.7，KH2PO42，Na2HPO43，pH7.4，1.0×105Pa滅菌30 min。補(bǔ)加微量元素混合液（g/L）：CaCl20.02，F(xiàn)eCl3·6H2O 0.5，CuSO40.005，MnCl2·4H2O 0.005，ZnSO4·7H2O 0.1。固體培養(yǎng)基另加瓊脂15-20 g。平板表面均勻涂抹一層原油，制備成油平板。

2216E培養(yǎng)基（g/L）（用于菌種的培養(yǎng)）：蛋白胨5，酵母膏1，檸檬酸鐵0.10，NaCl 19.45，MgCl25.98，CaCl23.24，KCl 0.55，Na2CO30.16，KBr 0.080，SrCl2·6H2O 0.034，H3BO30.022，Na2SiO3·9H2O 0.004，NaF 0.002 4，NaNO30.001 6，Na2HPO40.008，pH 7.4-7.8，固體培養(yǎng)基另加瓊脂15-20 g。

石油培養(yǎng)基（用于降解菌的富集、降解率的測定試驗(yàn)）：每100 mL MMC培養(yǎng)基中加入1 g原油作為唯一碳源。

兔血平板培養(yǎng)基（用于表面活性劑的定性檢測）：固體2216E培養(yǎng)基融化后冷卻至50℃，加入2-3滴無菌兔血搖勻后倒平板。

本研究所用的酶、dNTP等分子生物學(xué)試劑購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；GC-MS實(shí)驗(yàn)所用流動相、標(biāo)準(zhǔn)品等購自國藥集團(tuán)；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2方法

1.2.1石油降解菌的篩選及產(chǎn)表面活性劑測定 取5 mL海水樣品加入100 mL石油培養(yǎng)基中，30℃、180 r/min培養(yǎng)7 d，取5 mL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接至新鮮的石油培養(yǎng)基，重復(fù)以上步驟，連續(xù)轉(zhuǎn)接富集培養(yǎng)4次，培養(yǎng)基中原油量依次提升至1.0、1.5和2.0 g。將乳化現(xiàn)象明顯的樣品梯度稀釋，取0.1 mL涂布于石油平板，30℃培養(yǎng)3-5 d，挑取周圍有透明圈的菌落于2216E平板純化、待測。

將各菌株用無菌牙簽依次挑至兔血平板培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)2-3 d，根據(jù)菌落周圍透明圈的大小判斷表面活性劑的濃度［17］。將活化后的菌株以5％的比例接種到石油培養(yǎng)基中，以不接菌的培養(yǎng)基作為空白對照，30℃、180 r/min培養(yǎng)5 d。采用鉑金環(huán)式表面張力測定儀測定培養(yǎng)液的表面張力。

1.2.2石油降解率的測定 石油濃度的測定采用紫外法，參考蔣瑞萍［18］的方法制作吸光度-石油濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，略有改動。在一系列50 mL的容量瓶中加入不同量的原油母液（1 g/L），用二氯甲烷定容，260 nm處測定吸光度。為保證結(jié)果準(zhǔn)確，加標(biāo)回收率控制在95％-105％之間。

各菌株接至2216E培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)期，離心收集菌體，用無菌MMC洗滌2次，平板涂布法測定細(xì)胞數(shù)目并稀釋濃度≈108CFU/mL，以5％的比例（V/V）接種至石油培養(yǎng)基中，30℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)7 d，以未接菌的培養(yǎng)基作為對照。向各樣品中加入50 mL二氯甲烷，200 r/min振蕩20 min，再于40℃下超聲15 min萃取其中的殘余油污，離心去除菌體碎片。從二氯甲烷相吸取0.2 mL 溶液定容于50 mL容量瓶，260 nm處測定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中殘余的石油濃度：

其中，C1為對照中石油濃度，C2為樣品中石油濃度。每個樣品3次重復(fù)，下同。

1.2.3石油降解復(fù)合菌系的構(gòu)建 根據(jù)降解率和產(chǎn)表面活性劑情況，優(yōu)選5株細(xì)菌分別接種至2216E中培養(yǎng)至對數(shù)末期，種子液離心、洗滌后用平板涂布法調(diào)節(jié)為一致的濃度（108CFU/mL）。各菌以等比例隨機(jī)配伍的方式接至石油培養(yǎng)基中，總接種量為5％（體積比），30℃、180 r/min培養(yǎng)7 d后測定石油降解率。選擇降解率最高的1個組合，通過3水平（0.5％、1.0％和2.0％）的正交實(shí)驗(yàn)確定各菌株的接種量。

1.2.4菌株的鑒定 生理生化實(shí)驗(yàn)及16S rRNA基因序列分析參照吳秉奇等［19］方法，PCR產(chǎn)物由上海生工生物工程有限公司測序，結(jié)果提交GenBank獲取登錄號，采用MEGA軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.5石油降解條件的優(yōu)化 在石油培養(yǎng)基中接種復(fù)合菌系，搖床培養(yǎng)7 d，設(shè)置不同的培養(yǎng)條件。（1）培養(yǎng)溫度：22、26、30、34和38℃；（2）培養(yǎng)基初始pH值：6.4、7.0、7.6、8.2和8.8；（3）搖床轉(zhuǎn)速：160、180、200、220和240 r/min；（4）初始油濃度：1.0、5.0、10.0、20.0和40.0 g/L。石油降解率的測定方法同1.2.2。

將以上因素設(shè)置為最佳條件，定時取樣測定復(fù)合菌系對石油的降解情況，同時采用平板計(jì)數(shù)法對培養(yǎng)液中細(xì)菌進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

1.2.6復(fù)合菌系對石油的降解特性 采用GC-MS法測定石油生物降解后各烷烴組分的殘留情況。將復(fù)合菌系以最佳接種量接種至石油培養(yǎng)基，30℃、180 r/min條件下培養(yǎng)7 d。培養(yǎng)液前處理同1.2.2，取待測液用干燥無水Na2SO4脫水，再經(jīng)0.22 μm有機(jī)系濾膜過濾，氮?dú)獯蹈珊笥枚燃淄橹匦氯芙?。GC-MS運(yùn)行條件：全掃描模式；色譜柱為RYX-5 （30 m×0.25 mm×0.25 μm）；柱溫45℃，以 5℃/min的速度升至300℃，停留20 min；進(jìn)樣口、離子源、四級桿溫度分別為250、230和150℃；載氣為氦氣；進(jìn)樣量1 μL。數(shù)據(jù)分析用安捷倫5975-7890A工作站。

1.2.7數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析 使用SPSS 18.0和ORIGIN 8.6軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行整理；采用新復(fù)極差法，在0.05水平上分析差異顯著性（P＜0.05）。菌株16S rRNA基因序列通過DNAMAN 7.02拼接后進(jìn)行BLAST分析，利用MEGA 6程序的Neighbor-joining算法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2　結(jié)果

2.1石油降解菌的篩選及產(chǎn)表面活性劑情況

對5個取樣點(diǎn)的樣品進(jìn)行馴化，選擇乳化現(xiàn)象較為明顯的樣品分離細(xì)菌，共獲得68株石油降解菌，分別測定各菌株對石油的降解率及培養(yǎng)液的表面張力。如圖1所示，共有22株細(xì)菌對石油的去除情況較好，接種7 d后，菌株S1-3A、S1-12、S1-38等3株細(xì)菌對石油的降解率超過50％，其中S1-38可達(dá)52.2％。同時發(fā)現(xiàn)，菌株S1-5、S1-12、S1-22、S1-30、S1-37、S1-41B和S2-13等7株細(xì)菌在兔血平板上可產(chǎn)生較為明顯的透明圈，其培養(yǎng)液的表面張力相比于對照也有大幅下降，最高達(dá)44.6％，初步推斷以上菌株能夠產(chǎn)生表面活性劑，促進(jìn)石油的乳化、分散；其余接菌處理培養(yǎng)液的表面張力也有不同程度的降低。

圖1　菌株對石油的降解率及培養(yǎng)液表面張力測定

2.2石油降解復(fù)合菌系的構(gòu)建

根據(jù)降解石油及產(chǎn)表面活性劑情況，排除菌株間的拮抗作用，選擇S1-3A、S1-12、S1-30、S1-38、S2-13等5株細(xì)菌，通過等比例接種的方式分別構(gòu)建二階至五階復(fù)合菌系，共計(jì)25種組合，測定各組合對石油的降解率，結(jié)果見表1。

結(jié)果（表1）顯示，復(fù)合菌對石油的降解率在53.4％-63.7％之間，均高于單一菌株；凡同時接種S1-38和S2-13的組合均具有較高石油降解率，由S1-38、S1-30、S2-13等3株細(xì)菌構(gòu)成的復(fù)合菌系對石油的去除情況最好，7 d內(nèi)對石油降解率可達(dá)63.7％。設(shè)計(jì)3因素3水平的正交實(shí)驗(yàn)對該組合中各菌株的接種量加以優(yōu)化，結(jié)果見表2。

表1　各組復(fù)合菌系對原油的降解效果

表2中R值顯示，接種量對S1-38的影響最大，其次為 S1-30，對S2-13的影響較??；當(dāng)S1-30取2.0％水平，S1-38取1.0％水平，S2-13取1.0％水平時，各自具有最高的K值，理論上采用該接種量時，復(fù)合菌應(yīng)該具有最高的石油降解率。按此接種量制備復(fù)合菌系，培養(yǎng)7 d測得其對石油的降解率為68.3％，高于正交實(shí)驗(yàn)中的任一組合，與預(yù)期相符，將該菌系命名為SQ1。

2.3石油降解菌的鑒定

3株細(xì)菌在2216E 平板上培養(yǎng)48-72 h后，S1-30呈不透明的淡黃色圓形菌落，直徑0.5-1.5mm，表面光滑、凸起、濕潤；鏡檢為（1 000×）G+，菌體呈短桿狀，（0.3-0.6）×（1.0-4.0）μm，單生或簇生。S1-38呈淡紅色圓形菌落，直徑0.2-1.0 mm，表面光滑、凸起，有黏液，邊緣整齊；鏡檢為G+，菌體呈球狀，（0.5-1.0）×（0.5-1.0）μm。S2-13呈灰白色不規(guī)則圓形菌落，直徑2.0-3.0 mm，凸起；鏡檢為G-，菌體呈桿狀，（0.5-1.0）×（1.0-5.0）μm，單生。生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3　3株細(xì)菌的生理生化特征

采用通用引物擴(kuò)增3株細(xì)菌的16S rRNA基因序列，得到大小約為1 400-1 500 bp的片段，測序后將序列與GenBank中近緣模式種進(jìn)行BLAST分析，選擇相似度較高的菌株序列采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，以Methanococcus vannielii作為外群，結(jié)果見圖2。

圖2　基于16S rRNA基因的菌株系統(tǒng)發(fā)育樹

由圖2可見，菌株S1-30與棒桿菌屬（Corynebacterium）下的幾種細(xì)菌模式種聚為一個類群，與菌株Corynebacterium variabile DSM 44702T、Corynebacterium sp. CMH010.H4.1和Corynebacterium variabilis DSM 20132T的相似度均為99％；S1-38與迪茨氏菌屬（Dietzia）下幾種細(xì)菌模式種聚為同一類群，與Dietzia timorensis ID05-A0528T、Dietzia sp. Ac4等菌株的相似度均為99％；S2-13與拉布倫茨氏菌屬（Labrenzia）細(xì)菌聚為同一類群，與菌株Labrenzia sp. MBTDCMFRIMab26的相似度達(dá)100％。結(jié)合生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將菌株S1-30鑒定為棒桿菌，將S1-38鑒定為迪茨氏菌，將S2-13鑒定為拉布倫茨氏菌；GenBank登錄號分別為KP114217、KP114218、KP114219。

2.4SQ1降解石油條件的優(yōu)化

通過單因素實(shí)驗(yàn)，測定培養(yǎng)溫度、搖床轉(zhuǎn)速（通氣量）、初始pH值、初始石油濃度等4種因素對復(fù)合菌系SQ1降解石油的影響，結(jié)果見圖3。

圖3　環(huán)境因素對SQ1降解石油的影響

如圖3-A所示，30℃是SQ1降解石油的最適溫度，降解率為67.2％；過低或過高的溫度對SQ1降解石油均具有負(fù)面影響，22℃和38℃時的去除率僅為45.4％和50.5％。石油濃度（圖3-B）對SQ1降解石油的影響同樣顯著，當(dāng)石油濃度為1 g/L時，其生物降解率僅為31.4％；隨著濃度的提升，SQ1對石油的去除率也逐漸升高，當(dāng)濃度為20 g/L時，其降解率可達(dá)67.3％；但當(dāng)石油的濃度進(jìn)一步升至40 g/L時，SQ1對石油的降解率出現(xiàn)明顯的下降。圖3-C所示，初始pH方面，SQ1在pH為7.0-8.8范圍內(nèi)對石油均有較高的降解率（＞60％），當(dāng)pH為7.6時，SQ1對石油的降解率最高，可達(dá)67.6％。通氣量（圖3-D）對石油去除率的影響較小，當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速達(dá)到180 r/min以上時，SQ1對石油的降解情況無顯著差別。

2.5培養(yǎng)過程中石油降解及菌系SQ1的變化

根據(jù)2.4的結(jié)果，將溫度、pH、轉(zhuǎn)速和石油濃度分別調(diào)節(jié)至 30℃、7.6、200 r/min和20 g/L，定時取樣測定SQ1對石油的降解和反應(yīng)體系中各細(xì)菌的生長情況。

結(jié)果（圖4）顯示，復(fù)合菌系SQ1對石油表現(xiàn)出持續(xù)的降解能力。接種后1-7 d內(nèi)，石油的降解情況呈指數(shù)增長，此后石油的生物降解速率有所下降，培養(yǎng)11 d時，石油的去除率達(dá)到最高（73.5％）。在石油的降解的過程中，復(fù)合菌系SQ1中3種細(xì)菌的生長狀況差異較大，S1-38在培養(yǎng)1-5 d內(nèi)大量生長，7 d后活菌數(shù)呈不斷下降的趨勢；S2-13在培養(yǎng)3-9 d內(nèi)活菌激增，此后有小幅下降；S1-30的生長速度較其他2株菌慢，但其活菌數(shù)始終處于增長狀態(tài)，表現(xiàn)出持續(xù)的石油降解能力。

圖4　培養(yǎng)時間對石油降解及細(xì)菌生長的影響

2.6殘油組分的GC-MS分析

采用GC-MS法對石油生物降解后的殘留組分定量分析，結(jié)果見圖5。

圖5 降解后石油中烷烴含量

圖5顯示，菌株S1-30、S1-38、S2-13和復(fù)合菌系SQ1對石油總烷烴的去除率分別為87.55％、73.11％、87.55％和91.69％，均能夠降解C10-C35之間的大部分正構(gòu)烷烴，其中對C10-C13、C21-C24、C27、C30、C32、C33等烷烴的降解率為100％。相比于單一細(xì)菌，復(fù)合菌系SQ1降解烷烴的能力更強(qiáng)，對C10-C16和C21-C35之間（除C25）烷烴的降解率也達(dá)到了100％，對本研究中較難以降解的C16-C20之間烷烴的去除效果也要好于單一細(xì)菌。

3　討論

已有報道表明，海洋環(huán)境中存著數(shù)百種微生物能夠參與石油烴類的降解，其中大部分為細(xì)菌，如：不動桿菌（Acinetobacter）、假單胞菌、紅球菌（Rhodococcus）、嗜鹽單胞菌（Halomonas）、食烷菌（Alcanivorax）、海桿菌（Marinobacter）和 微桿菌（Microbacterium）等［7，20，21］。本研究從深圳近海分離到的22株石油降解菌，對石油的降解率最高為52.4％，與其他已報道的菌株相比，其降解能力處于中間水平［8，9，22］，但本研究分離到菌株廣泛分布于副球菌（Paracoccus）、拉布倫茨氏菌、鞘氨醇盒菌（Sphingopyxis）、假單胞菌以及迪茨氏菌等菌屬，其中，拉布倫茨菌在海洋石油降解方面的作用為首次報道。

研究表明，分泌表面活性劑是一些菌株能夠高效利用石油烴的重要因素，例如：菌株P(guān)seudomonas sp. BP10即是通過產(chǎn)表面活性劑降低了培養(yǎng)液表面的張力，提高了對石油的攝取作用［23］；Bacillus methylotrophicus USTBa不僅能夠分泌表面活性劑，其產(chǎn)物對某些細(xì)菌還具有一定的拮抗作用［24］。依據(jù)在血平板上產(chǎn)生透明圈的大小和培養(yǎng)液的表面張力降低幅度，本研究將S1-12等7株細(xì)菌初步判定為表面活性劑高產(chǎn)菌，但7株細(xì)菌中S1-12、S1-30和S2-13等3株菌的石油降解能力明顯強(qiáng)于另外4株，這說明除了產(chǎn)表面活性劑外，菌株的生長狀態(tài)、分泌的降解酶系等因素與石油降解能力也密切相關(guān)。有報道表明，細(xì)菌產(chǎn)表面活性劑的多少與降解石油的能力呈正相關(guān)［25，26］，但本研究的結(jié)果卻有所不同，如：S1-3A和S1-38雖然表面活性劑的產(chǎn)生特征不明顯，但對石油的降解能力卻較強(qiáng)，這可能與其細(xì)胞表面特性有關(guān)，也可能是分泌的其他代謝產(chǎn)物的緣故。由于培養(yǎng)條件、底物濃度等外界因素與細(xì)菌產(chǎn)表面活性劑息息相關(guān)［24］，本研究菌株所產(chǎn)表面活性劑的類型及產(chǎn)量還需通過紅外法、薄層層析法等手段做進(jìn)一步分析。

依據(jù)對石油的降解能力和產(chǎn)表面活性劑的情況，本研究選擇5株石油降解菌進(jìn)行復(fù)配，并通過正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化接種量，構(gòu)建了由棒桿菌S1-30、迪茨氏菌S1-38和拉布倫茨氏菌S2-13組成的復(fù)合菌系SQ1。結(jié)果顯示，SQ1對石油的降解率可達(dá)68.3％，相比于單一細(xì)菌至少高出16.1％，GC-MS結(jié)果也表明SQ1對石油的去除效果要好于單一菌株。與其他報道的復(fù)合菌系相比，SQ1的降解能力略低于Bao等［27］采用蒼白桿菌（Ochrobactrum sp.）和類短短芽孢桿菌（Brevibacillus parabrevis）構(gòu)建的四元復(fù)合菌系（79％）；在2％的原油濃度下，與Sathishkumar［28］構(gòu)建的四元菌系降解能力相近（72％-76％）；高于張海玲等［12］構(gòu)建的復(fù)合菌系（61.3％）。但SQ1對石油總烷烴的去除率可達(dá)91.7％，對石油組分降解情況較為特殊。一般來說，石油中的短鏈和中鏈組分更易于生物降解［29，30］，但SQ1對石油中C21-C35等長鏈烷烴的降解率幾乎為100％，對C10-C16等中鏈烷烴的降解卻不是很徹底，這可能是由于SQ1中的3株細(xì)菌含有長鏈烷烴降解需要的特殊酶系基因［31］。此外，3株細(xì)菌表現(xiàn)出明顯的協(xié)同作用，一方面是由于菌株S1-30和S2-13通過產(chǎn)生表面活性劑，提高了S2-13對各種碳源的利用，也可能是3株細(xì)菌在底物利用和代謝途徑上具有互補(bǔ)性［32］。

本研究發(fā)現(xiàn)，反應(yīng)體系的溫度、石油濃度及pH 對SQ1降解石油的影響較為顯著。溫度不僅可以影響微生物本身的代謝活性，對石油的物理狀態(tài)、化學(xué)組成也具有一定的影響，直接關(guān)系到石油的生物降解率；而作為唯一碳源，石油濃度過低則養(yǎng)分不足，過高又會對微生物產(chǎn)生毒害；pH是通過對微生物的代謝及酶活性的調(diào)節(jié)產(chǎn)生影響［28，33］?？傮w來看，SQ1適于在中等溫度、較高的石油濃度以及偏弱堿性的環(huán)境下發(fā)揮降解作用，這與我國南方的海洋環(huán)境較為接近。此外，微生物生物量的增長與石油污染的降解密切相關(guān)［2，34］，從體系中3株細(xì)菌在生長情況來看，迪茨氏菌S1-38在培養(yǎng)初期即大量生長，這可能是因?yàn)槠渌?株細(xì)菌通過產(chǎn)表面活性劑乳化了石油，刺激了S1-38的快速攝取利用，推測其在石油降解初期發(fā)揮主要作用；此后拉布倫茨氏菌S2-13和棒桿菌S1-30進(jìn)入對數(shù)期；9 d后，由于細(xì)菌進(jìn)入穩(wěn)定期和衰亡期，石油降解產(chǎn)物也可能對細(xì)菌產(chǎn)生反饋抑制，反應(yīng)體系中石油的降解較為緩慢，但由于S1-30生物量始終處于增長狀態(tài)，對復(fù)合菌系SQ1持續(xù)降解石油起到一定的作用。

本研究分離到的石油降解菌全部來自近岸海域，與人類活動的關(guān)系更為密切，其環(huán)境適應(yīng)能力較強(qiáng)。構(gòu)成菌系SQ1的3株細(xì)菌中，棒桿菌和迪茨氏菌在海洋石油降解方面的作用已有所報道［22，35］，但有關(guān)拉布倫茨氏菌的報道主要集中于降解利用氨基酸、產(chǎn)酶等方面［36，37］，本研究是首次發(fā)現(xiàn)其在海洋石油降解方面的作用，有關(guān)3株細(xì)菌在復(fù)合菌系SQ1中的具體作用及代謝規(guī)律等，還需要做進(jìn)一步研究。另外，由于海洋環(huán)境的復(fù)雜性，SQ1對石油污染的修復(fù)效果也有待現(xiàn)場試驗(yàn)加以證實(shí)。

4　結(jié)論

從深圳近岸海域篩選得到22株高效石油降解菌，分布于副球菌、拉布倫茨氏菌、鞘氨醇盒菌、假單胞菌以及迪茨氏菌等菌屬，實(shí)驗(yàn)室條件下，7 d內(nèi)對石油的降解率最高為52.2％。

采用棒桿菌S1-30、迪茨氏菌S1-38和拉布倫茨氏菌S2-13由構(gòu)建了高效石油降解復(fù)合菌系SQ1，對石油的降解率可達(dá)68.3％，比接種單菌高出16.1％。

SQ1的最適環(huán)境因素為30℃、石油濃度20 g/L、pH7.6。SQ1可降解石油大部分的烷烴組分，對長鏈烷烴的去除率幾乎達(dá)到100％，在海洋石油污染修復(fù)中具有較強(qiáng)的應(yīng)用潛力。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

Screening of Marine Crude Oil-degrading Bacteria and Construction of Microbial Consortium

WU Bing-qi LIU Shu-jie CHEN Fu-ming ZHOU Chu-ying
（Research Institute of Tsinghua University in Shenzhen，Shenzhen Environmental Microbiology Resources Development and Application Engineering Laboratory，Shenzhen 518057）

For the purpose of controlling marine oil contamination by biological treatment technology，using crude oil acting as sole carbon source and enrichment and spread plate method，high-performance oil-grading bacteria were isolated from five sampling points in the sea near Shenzhen，and bacterial consortium was constructed by mixing and orthogonal experiments. Physiological and biochemical experiments and 16S rRNA gene sequence analysis were used to identify the strains. Single-factor experiment was employed to optimize the conditions of oil biodegradation by the consortium，and gas chromatography and mass spectrum（GC-MS）were utilized to analyze its biodegradation characteristics. The results showed that 22 strains of high-performance oil-degrading bacteria were isolated，and the degrading rates varied from 34.5％ to 52.2％. The degrading rate by microbial consortium SQ1 composed of S1-30，S1-38，and S2-13 strains reached 68.3％. These three strains were identified as Corynebacterium sp.，Dietzia sp. and Labrenzia sp. SQ1 was able to degrade the oil by 73.5％ in 11 days under optimized conditions，referring to 30℃，pH7.6，oil concentration 20 g/L. The GC-MS results showed that consortium SQ1 was able to degrade the total alkane by 91.7％，and the more refractory C21-C35 by nearly 100％. The study shows that consortium SQ1 has great application potential of bioremediation for marine oil contamination.

oil-degrading bacteria；microbial consortium；degradation rate；identification；condition optimization

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.08.027

2015-10-22

深圳市科技計(jì)劃項(xiàng)目（JCYJ20120817102941279）

吳秉奇，男，碩士，研究方向：環(huán)境微生物；E-mail：wubingqi@163.com

劉淑杰，女，碩士，研究方向：環(huán)境保護(hù)技術(shù)；E-mail：10734452@qq.com