武利勤 顧?？?王青 尚宏忠 劉桂君 包放

（北京市輻射中心，北京 100875）

石斛內(nèi)生甲基營養(yǎng)芽胞桿菌的拮抗和促生作用研究

武利勤 顧海科 王青 尚宏忠 劉桂君 包放

（北京市輻射中心，北京 100875）

從霍山石斛中分離內(nèi)生菌，旨在獲得具有廣譜抗菌活性和促生作用的內(nèi)生細(xì)菌。以石斛黑斑病菌為指示菌，用對(duì)峙培養(yǎng)法篩選具有抗菌活性的內(nèi)生菌；對(duì)篩選到的具有拮抗活性的菌株進(jìn)行抗菌譜和促生長(zhǎng)潛力的測(cè)定。結(jié)果顯示，從霍山石斛中分離獲得22株內(nèi)生細(xì)菌，其中菌株RA具有較強(qiáng)抑菌活性，根據(jù)16S rDNA 序列分析結(jié)果鑒定 RA為甲基營養(yǎng)芽孢桿菌 Bacillus methylotrophicus。菌株RA可以產(chǎn)生IAA、嗜鐵素、蛋白酶、表面活性劑和生物膜，RA對(duì) 8 種植物病原菌也具有較好的抑制作用，具有廣譜抗菌活性；并且可以顯著促進(jìn)玉米幼苗的生長(zhǎng)。RA菌株具有作為生防菌劑和生物肥料應(yīng)用的良好潛力。

霍山石斛；內(nèi)生細(xì)菌；甲基營養(yǎng)芽胞桿菌；抑菌活性；促生長(zhǎng)

研究表明，80％ 的植物病害是由植物病原真菌引起，目前用于防治植物病害的方法主要有化學(xué)防治和生物防治，化學(xué)農(nóng)藥防治嚴(yán)重污染環(huán)境和造成農(nóng)產(chǎn)品農(nóng)藥殘留，且在殺滅病原菌的同時(shí)，還對(duì)植株體內(nèi)和土壤中有益微生物群落造成嚴(yán)重破壞。因此，微生物肥料、微生物農(nóng)藥是未來農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要方向之一。

傳統(tǒng)生物防治是將拮抗菌導(dǎo)入土壤中，但由于土壤習(xí)居菌排斥作用，拮抗菌很難定殖并發(fā)揮作用［1］。植物內(nèi)生菌是指在其生活史的至少一個(gè)階段存活于植物組織內(nèi)部，而又不引發(fā)宿主植物表現(xiàn)出明顯感染癥狀的微生物類群［2］。植物內(nèi)生菌作為拮抗菌使用時(shí)，能夠定殖在植物體內(nèi)，優(yōu)先占領(lǐng)有利的物理學(xué)位點(diǎn)和生物學(xué)位點(diǎn)，造成對(duì)病原菌侵染的物理阻隔或生態(tài)排斥效應(yīng)，使病菌無法接近侵染位點(diǎn)而不能侵染寄主，因此利用內(nèi)生菌來源的拮抗微生物防治植物病害成為研究熱點(diǎn)之一。植物內(nèi)生菌作為一種新的微生物資源引起了廣泛關(guān)注，內(nèi)生細(xì)菌既可以產(chǎn)生促生物質(zhì)，直接促進(jìn)植物生長(zhǎng)［3］，也可以通過與病原菌競(jìng)爭(zhēng)空間或產(chǎn)生拮抗物質(zhì)而間接起到促生作用［4］。利用植物內(nèi)生細(xì)菌提高農(nóng)作物產(chǎn)量和品質(zhì)的研究已有較多報(bào)道［5-8］。

石斛是傳統(tǒng)的名貴中藥，具有益胃生津、滋陰清熱、明目利嗓等作用，其中霍山石斛（Dendrobium huoshanense C. Z. Tang et S. J Che）為石斛中的名貴品種。由于近年來過度挖掘，目前野生資源已瀕臨枯竭，具有一定栽培規(guī)模的石斛生產(chǎn)基地相繼建立。然而，隨著大面積的人工栽培，由細(xì)極鏈格孢（Alternaria tenuissima）引起的石斛黑斑病在移植苗上普遍發(fā)生，病原菌危害幼嫩的葉片，引起黑褐色病斑，病斑周圍葉片變黃，受害嚴(yán)重植株葉片全部脫落，是石斛栽培中的一個(gè)重要病害，給種植戶帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失［9］。另外，該病菌可產(chǎn)生寄主轉(zhuǎn)化性真菌毒素（ATC-toxin），而這些毒素涉及到動(dòng)物癌癥的發(fā)展［10］，對(duì)石斛藥材的安全性構(gòu)成了潛在的威脅。

本研究擬從霍山石斛植株中分離內(nèi)生菌，篩選對(duì)石斛黑斑病有較好拮抗活性的菌株，應(yīng)用該菌對(duì)其他重要病原菌的抑菌活性進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定拮抗菌的抑菌譜，并對(duì)菌株分泌的抑菌和促生物質(zhì)進(jìn)行初步研究，以期獲得具有廣譜抗菌活性的內(nèi)生菌，為石斛及其他植物病害的防治提供生物資源。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1供試菌株 石斛黑斑病菌（Alternaria tenuissima）、梨輪紋病菌（Botryosphaeria berengeriana f. sp. piricola）、棉花黃萎病菌（Verticillium dahliae Kleb）、白菜黑斑病菌（Alternaria brassicae（Berk.）Sace）、灰霉病菌（Botrytis cinerea）、辣椒立枯病菌（Rhizoctonia solani Kuhn）由本實(shí)驗(yàn)室分離保存；香蕉枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. sp. Cubense）、稻瘟病菌（Pyricularia oryzae）和禾谷鐮孢菌（Fusarium graminearum）購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院菌種保藏中心。

1.1.2植物材料 霍山石斛2014年4月采集于安徽六安霍山石斛種植基地。所采集的樣品置于已滅菌的自封袋中，4℃保存，并于2 d內(nèi)處理完。

1.1.3培養(yǎng)基 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，瓊脂20 g，水1 000 mL、pH 值7.4-7.6。用于細(xì)菌的分離和培養(yǎng)。馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂15 g、水1 000 mL，pH值自然。用于真菌的培養(yǎng)。121℃滅菌20 min。

1.2方法

1.2.1霍山石斛內(nèi)生細(xì)菌的分離和純化 霍山石斛植株用自來水沖洗干凈，然后流水沖洗 30 min。75％的乙醇表面消毒1 min，無菌水清洗3次，再放入0.1％氯化汞溶液中消毒1-3 min，無菌水沖洗4次，用無菌濾紙吸干。用無菌解剖刀將霍山石斛的根和葉片切成0.5 cm見方的小塊，置于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上30℃培養(yǎng)。待長(zhǎng)出菌落后重新于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板上劃線純化。純化的細(xì)菌接種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基斜面上，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2霍山石斛黑斑病拮抗內(nèi)生菌的篩選 拮抗內(nèi)生菌的篩選采用對(duì)峙培養(yǎng)法，直徑6 mm的霍山石斛黑斑病菌接種在直徑9 cm的PDA平板一側(cè)，相對(duì)的一側(cè)劃線接種不同的內(nèi)生菌株，兩接種點(diǎn)相距3-4 cm，病原菌單獨(dú)接種在PDA平板上做對(duì)照，均設(shè)3個(gè)重復(fù)，在25℃條件下培養(yǎng)，當(dāng)對(duì)照快要長(zhǎng)滿全皿時(shí)，測(cè)量菌落直徑和抑菌帶寬度，抑菌活性采用抑制率（％）=［（對(duì)照菌落半徑-處理菌半徑）/對(duì)照菌落半徑］×100％。

1.2.3拮抗內(nèi)生菌形態(tài)觀察與染色 將菌種接種到牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，30℃、150 r/min培養(yǎng)16 h后，革蘭氏染色，染色后用光學(xué)顯微鏡觀察菌體形態(tài)。將液體培養(yǎng)基稀釋涂平板，28℃恒溫培養(yǎng)5 d，觀察菌落形態(tài)。

1.2.4拮抗內(nèi)生菌16S rDNA序列分析 拮抗內(nèi)生菌RA 16S rDNA序列采用通用引物27F和 1492R［15］進(jìn)行擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后由北京三博遠(yuǎn)志公司測(cè)序。獲得的16S rDNA基因序列在 GenBank中進(jìn)行BLAST比對(duì)，用Clustal X軟件進(jìn)行序列相似性分析，采用MEGA 5軟件以 Neighbor-joining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，用Bootstrap（1 000 次重復(fù)）進(jìn)行檢驗(yàn)［16］。

1.2.5拮抗內(nèi)生菌抗菌譜分析 以梨輪紋病菌、棉花黃萎病菌、白菜黑斑病菌、灰霉病菌、辣椒立枯病菌、香蕉枯萎病菌、稻瘟病菌和禾谷鐮孢菌作為供試植物病原菌，研究篩選到的拮抗內(nèi)生菌的抗菌譜，方法同1.2.2。

1.2.6拮抗內(nèi)生菌對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)影響 在 PDA平板上對(duì)峙接種拮抗內(nèi)生菌和病原菌共同培養(yǎng)，待出現(xiàn)抑菌帶后，在抑菌帶邊緣挑取菌絲，鏡檢菌絲生長(zhǎng)狀況。

1.2.7拮抗內(nèi)生菌抗逆促生潛力的測(cè)定

1.2.7.1產(chǎn) IAA（吲哚乙酸）的檢測(cè) 拮抗內(nèi)生菌IAA的產(chǎn)生采用Patten等［11］描述的比色法檢測(cè)。

1.2.7.2溶磷能力檢測(cè) 拮抗內(nèi)生菌接種于解磷檢測(cè)培養(yǎng)基 Pikovskaya's（PVK）［12］，置于 28℃培養(yǎng)2 d。觀察菌落周圍透明圈大小可判斷菌株的磷溶解能力。

1.2.7.3產(chǎn)嗜鐵素能力的檢測(cè) 拮抗內(nèi)生菌嗜鐵素的產(chǎn)生采用CAS檢測(cè)平板法［13］，活性內(nèi)生菌在28℃培養(yǎng) 3 d 后，觀察菌落外圍黃色暈圈的大小。由于嗜鐵素競(jìng)爭(zhēng)培養(yǎng)基中的 EDTA 螯合的鐵離子，使培養(yǎng)基由藍(lán)色變?yōu)辄S色，因此菌落周圍黃色暈圈的可代表嗜鐵素的產(chǎn)生。

1.2.7.4產(chǎn)蛋白酶檢測(cè) 將拮抗內(nèi)生菌株接種于脫脂奶粉蛋白酶檢測(cè)培養(yǎng)基［14］，置于28℃培養(yǎng) 2 d。觀察菌落周圍透明圈大小可判斷菌株的蛋白質(zhì)水解能力。

1.2.7.5拮抗內(nèi)生菌生物膜成膜情況檢測(cè) 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基接種過夜活化后的供試菌株，30℃、150 r/min培養(yǎng)至對(duì)數(shù)中前期（OD600=1.0）。用新鮮的培養(yǎng)基洗滌離心后的菌體一次，將其重懸于等體積的培養(yǎng)基中。以1％的接種量加入到盛有培養(yǎng)基的小燒杯中，30℃靜置培養(yǎng)48 h，觀察菌株的成膜情況。

1.2.7.6產(chǎn)表面活性劑的檢測(cè) 將過夜培養(yǎng)的菌液取20 μL滴到parafilm上，利用液面坍塌法觀察表面活性劑的產(chǎn)生，如果液面坍塌，則該菌產(chǎn)生表面活性劑，對(duì)照為無菌牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液。

1.2.8拮抗內(nèi)生菌促生效應(yīng)研究 挑選顆粒飽滿的玉米種子進(jìn)行表面消毒，75％的乙醇表面消毒1 min，無菌水清洗3次，再放入2％次氯酸鈉溶液中消毒10 min，無菌水沖洗4次，用無菌濾紙吸干后置滅菌培養(yǎng)皿中28℃催芽。待種子發(fā)芽后，加入濃度為1×108CFU/mL的 RA 菌懸液浸泡 2 h，對(duì)照組用同體積的無菌液體培養(yǎng)基代替。然后將其播種至盛有栽培基質(zhì)（泥炭土∶蛭石=3∶1）的盆中，每盆1株，每組10盆，3次重復(fù)。處理后置于25℃的溫室中培養(yǎng)。分別于種植后40 d 測(cè)量玉米幼苗的生長(zhǎng)指標(biāo)。

1.2.9數(shù)據(jù)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel及SPASS13.0軟件進(jìn)行差異顯著性分析。

2　結(jié)果

2.1霍山石斛黑斑病拮抗菌的篩選

從霍山石斛葉片和根組織塊中，根據(jù)菌落形態(tài)和菌體形態(tài)差異，共獲得22株代表菌株。對(duì)峙培養(yǎng)法對(duì)分離到的22株內(nèi)生菌進(jìn)行抑菌活性篩選，結(jié)果（表1）發(fā)現(xiàn)菌株RA對(duì)石斛黑斑病菌表現(xiàn)出強(qiáng)烈的抑菌作用，抑菌率均達(dá)到70％。

2.2拮抗內(nèi)生菌RA菌體形態(tài)特征

拮抗菌RA在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d后形成圓形邊緣不規(guī)則的扁平狀菌落，表面有褶皺，乳白色不透明（圖1-A），而其在水溶液中培養(yǎng)，有生物膜、沉淀產(chǎn)生，溶液變渾濁（圖5-C）。革蘭氏染色后經(jīng)顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)菌株 RA成直桿狀，兩端鈍圓，革蘭氏染色后菌體呈紫色，為革蘭氏陽性菌（圖1-B）。

圖1　拮抗菌RA菌落形態(tài)（A）和革蘭氏染色形態(tài)（B）（1 000×）

2.3拮抗內(nèi)生菌RA 16S rDNA的系統(tǒng)發(fā)育

將獲得的 RA 菌株 16S rDNA 序列用 BLAST 與GenBank 中典型菌株進(jìn)行比對(duì)分析，選擇一些與測(cè)定序列同源性較高的序列作為參考序列，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果（圖2）顯示，菌株RA屬于芽孢桿菌屬Bacillus，與甲基營養(yǎng)芽孢桿菌B. methylotrophicus典型菌株EU194897聚為一簇，具有最近的親緣關(guān)系。

圖2　拮抗菌RA的16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4拮抗內(nèi)生菌RA的抑菌譜

菌株RA對(duì)其他8種供試植物病原真菌也表現(xiàn)出不同程度的抑制效果（表1、圖3）。表1結(jié)果顯示，菌株RA對(duì)梨輪紋病菌、棉花黃萎病菌、白菜黑斑病菌、灰霉病菌、禾谷鐮孢菌、稻瘟病菌具有強(qiáng)烈的抑制作用，其中RA對(duì)棉花黃萎病菌和禾谷鐮孢菌抑制效果最顯著，抑菌率為 80.1％和86.9％。

菌株 RA對(duì)辣椒立枯病菌和香蕉枯萎病菌的抑菌能力稍弱，抑菌率為54.8％和63.6％（表1、圖3）。菌株RA具有較廣譜的抑菌能力，有較大的開發(fā)潛力。

表1　拮抗內(nèi)生菌RA對(duì)不同植物病原菌的抑制結(jié)果

圖3　拮抗菌RA對(duì)不同植物病原真菌的抑制效果

圖4　拮抗菌RA處理后的植物病原真菌菌絲形態(tài)的變化（400×）

2.5拮抗內(nèi)生菌RA對(duì)病菌菌絲形態(tài)的影響

對(duì)峙生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)鏡檢結(jié)果表明，RA作用下病菌菌絲體絕大部分畸變，病原菌絲膨大成串珠狀，菌絲開始畸形、扭曲，有的生長(zhǎng)菌絲的頂端畸形，形成膨脹泡后破裂，細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)向外泄漏（圖4-B、4-D 和4-F），而對(duì)照組的病原菌菌絲形態(tài)生長(zhǎng)正常，菌絲體粗細(xì)均勻且表面光滑、生長(zhǎng)旺盛（圖4-A、4-C、4-E），表明拮抗菌 RA 對(duì)病原菌菌絲有明顯的破壞作用。

2.6拮抗內(nèi)生菌RA促生潛力的評(píng)價(jià)

對(duì)拮抗內(nèi)生菌RA進(jìn)行抗逆促生潛力的評(píng)價(jià)，菌株RA無溶磷能力，而具有較強(qiáng)的產(chǎn)嗜鐵素、蛋白酶和IAA能力，特別是在培養(yǎng)基中添加了L-色氨酸后，RA菌株IAA產(chǎn)量顯著增加（表2，圖5-A、5-B）。

表2　拮抗內(nèi)生菌RA促生長(zhǎng)特性

菌株RA在液體培養(yǎng)基中靜止培養(yǎng)，形成生物膜；過夜培養(yǎng)的菌懸液表面發(fā)生坍塌，說明其具有產(chǎn)生表面活性劑的能力（表2，圖5-C、5-D）。

圖5　拮抗內(nèi)生菌RA抗逆促生潛力分析

2.7拮抗內(nèi)生菌RA對(duì)玉米幼苗的促生效應(yīng)

表3表明，菌株RA 處理可以極其顯著增加玉米幼苗的株高和葉片數(shù)目，對(duì)根長(zhǎng)和地上部分干重的促進(jìn)作用也有顯著的作用，但是對(duì)根的干重效果不明顯。圖6顯示，用RA處理過的玉米幼苗明顯比對(duì)照的植株健壯，葉片大，葉色濃綠，對(duì)玉米幼苗的促生效果明顯；且經(jīng)RA 處理過的玉米幼苗的平均根長(zhǎng)顯著高于對(duì)照，更有利于植株后期的健康生長(zhǎng)。

表3　拮抗內(nèi)生菌RA對(duì)玉米幼苗生長(zhǎng)的促進(jìn)作用

圖6　拮抗內(nèi)生菌RA對(duì)玉米幼苗生長(zhǎng)的促進(jìn)作用

3　討論

內(nèi)生細(xì)菌作為可以產(chǎn)生在藥學(xué)和農(nóng)業(yè)上具有廣泛應(yīng)用前景的活性物質(zhì)的新資源，受到全世界研究者的關(guān)注［17-19］。具有促進(jìn)植物生長(zhǎng)和拮抗活性的內(nèi)生菌應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，可以減少化學(xué)農(nóng)藥和化肥的使用，從而降低環(huán)境污染和農(nóng)產(chǎn)品的農(nóng)藥殘留，對(duì)于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有重要的意義。以內(nèi)生細(xì)菌短小芽孢桿菌INR7為主要成分的生防產(chǎn)品已成功的應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，可以促進(jìn)植物的生長(zhǎng)和激發(fā)植物的系統(tǒng)抗性從而產(chǎn)生抗病性［20］。

本研究獲得的石斛內(nèi)生菌RA屬于甲基營養(yǎng)芽胞桿菌，對(duì)石斛黑斑病和多種常見植物病原菌具有強(qiáng)烈的拮抗能力，具有廣譜抗性，并且可以促進(jìn)玉米幼苗的生長(zhǎng)。趙智靈等［21］在人參中發(fā)現(xiàn)一株甲基營養(yǎng)芽孢桿菌B16，對(duì)7種人參病原菌均有較強(qiáng)抗性，與本研究結(jié)果一致。研究表明，生防菌株由于土壤習(xí)居菌的排斥作用而很難定殖并發(fā)揮作用［1］。本研究獲得的菌株RA具有形成生物膜的能力，因此作為生防菌株應(yīng)用時(shí)，可以利用植物體為微生物提供適宜的黏附表面形成生物膜，從而使之更加適應(yīng)周圍的環(huán)境而發(fā)揮其作用；同時(shí)，植物體也獲益于內(nèi)生菌的這種定殖方式帶來的多種生物學(xué)效應(yīng)［22］。

生防細(xì)菌通常以直接或間接的機(jī)制促進(jìn)植物的生長(zhǎng)［23］。直接機(jī)制包括合成生長(zhǎng)激素或增強(qiáng)植物的營養(yǎng)狀態(tài)，如增加礦質(zhì)營養(yǎng)P、N和Fe的生物可利用度，大多數(shù)植物促生菌可產(chǎn)生嗜鐵素，嗜鐵素對(duì)Fe3+有高度的絡(luò)合能力，大量結(jié)合根際或根圍土壤中的Fe3+，嗜鐵素-Fe3+復(fù)合物優(yōu)先被促生菌利用，植物也可以利用，使包括病原菌在內(nèi)的其他微生物因缺鐵元素而難以繁殖，從而使宿主免遭病菌侵染，并且提供鐵元素促進(jìn)宿主的生長(zhǎng)發(fā)育［24］；促進(jìn)植物生長(zhǎng)的間接機(jī)制包括通過競(jìng)爭(zhēng)鐵抑制病原菌的生長(zhǎng)，合成抗生素及產(chǎn)生殺菌劑如過氧化氫和細(xì)胞壁降解酶等。

本研究中內(nèi)生菌RA具有合成嗜鐵素和蛋白酶的能力，能夠通過與病原菌競(jìng)爭(zhēng)鐵營養(yǎng)和降解病菌細(xì)胞壁抑制病原菌的生長(zhǎng)，對(duì)多種植物病原菌具有良好的拮抗能力；且能夠合成表面活性劑，表面活性劑具有與去污劑相似的作用機(jī)理，通過與病原菌磷脂雙層相互作用形成離子通道，破壞膜的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致病原菌細(xì)胞內(nèi)容物的釋放而最終引起病原菌的死亡［25］。因此菌株RA能夠廣譜抑制植物病原菌，可以保護(hù)宿主免受病菌侵害從而間接促進(jìn)宿主的生長(zhǎng)發(fā)育。

同時(shí)，RA可以合成生長(zhǎng)激素IAA，且在色氨酸存在的情況下生長(zhǎng)激素的產(chǎn)量可以成倍的增加，因此接種植物時(shí)，RA菌株可以利用植物體內(nèi)的色氨酸，合成高濃度的IAA促進(jìn)植物生長(zhǎng)；RA 還可以通過產(chǎn)生嗜鐵素螯合土壤中Fe3+，提供給宿主改善其鐵營養(yǎng)狀態(tài)。因此RA可以通過促進(jìn)生長(zhǎng)素的合成和改善植物的礦質(zhì)營養(yǎng)狀態(tài)直接促進(jìn)其生長(zhǎng)。

4　結(jié)論

從霍山石斛內(nèi)生菌中篩選獲得一株具有抗石斛黑斑病菌的菌株RA，RA具有廣譜抗性且對(duì)玉米幼苗有顯著的促生長(zhǎng)作用。經(jīng)鑒定RA為甲基營養(yǎng)芽孢桿菌?？鼓娲偕鷿撃芊治霰砻?，RA 可以產(chǎn)生IAA、嗜鐵素、蛋白酶、表面活性劑和生物膜，具有良好的拮抗功能和促生功能，具備開發(fā)作為環(huán)保型生物源農(nóng)藥和生物肥料的條件。

［1］姚革， 張帆， 李舟. 土壤添加劑防治細(xì)菌性青枯病初報(bào)［J］.生物防治通報(bào)， 1994， 10（3）：106-109.

［2］Hallmann J， Quadt-Hallmann A， Mahaffee WF， et al. Bacterial endophytes in agricultural crops［J］. Canadian Journal of Microbiology， 1997， 43（10）：895-914.

［3］Surette MA， Sturz AV， Lada RR， et al. Bacterial endophytes in processing carrots（Daucus carota L. var. sativus）：their localization， population density， biodiversity and their effects on plant growth［J］. Plant and Soil， 2003， 253（2）：381-390.

［4］Nejad P， Johnson PA. Endophytic bacteria induce growth promotion and wilt disease suppression in oilseed rape and tomato［J］. Biological Control， 2000， 18（3）：208-215.

［5］暴增海， 馬桂珍， 張擁華， 等. 粘帚霉菌株對(duì)大豆促生及菌核病防效的研究［J］. 中國種業(yè)， 2007， 4：42-43.

［6］康慧穎， 王偉， 劉佳莉， 等. 兩株具促生作用的苜蓿內(nèi)生菌的分離純化與鑒定［J］. 微生物學(xué)通報(bào)， 2015， 42（2）：280-288.

［7］陳卓君， 吳毅歆， 毛自朝， 等. 蘿卜根內(nèi)生產(chǎn)酸克雷伯克氏菌的分離鑒定及其促生長(zhǎng)作用研究［J］. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 2014， 27 （4）：1645-1648.

［8］周怡， 毛亮， 張婷婷， 等. 大豆內(nèi)生芽孢桿菌的分離和促生菌株的篩選及鑒定［J］. 大豆科學(xué)， 2009， 28（3）：502-506.

［9］張敬澤， 鄭小軍. 鐵皮石斛黑斑病病原菌的鑒定和侵染過程的細(xì)胞學(xué)研究［J］. 植物病理學(xué)報(bào)， 2004， 34（1）：92-94.

［10］張敬澤， 方鈺蓉， 張海松， 等. 鐵皮石斛黑斑病菌室內(nèi)藥效試驗(yàn)［J］. 植物保護(hù)， 2005， 31（1）：44-47.

［11］Patten CL， Glick BR. Role of Pseudomonas putida indole-acetic acid in development of the host plant root system［J］. Applied and Environmental Microbiology， 2002， 68（8）：3795-3801.

［12］Pikovskaya RE. Solubilization of phosphorus in soil in connection with vital activity of some microbial species［J］. Mikrobiologiya，1948， 17：362-370.

［13］Alexander DB， Zuberer DA. Use of chrome azurol S reagents to evaluate siderophore production by rhizosphere bacteria［J］. Biology and Fertility of Soils， 1991， 12（1）：39-45.

［14］Smibert RM， Krieg NR. Phenotypic characterization［M］//Gerhardt P， Murray RGE， Wood WA， Krieg NR. Methods for general and molecular bacteriology. Washington， DC：American Society of Microbiology， 1994：607-654.

［15］Eden PA， Schmidt TM， Blakemore RP， et al. Phylogenetic analysis of Aquaspirillum magnetotacticum using polymerase chain reactionamplified 16S rRNA-specific DNA［J］. International Journal of Systematic Bacteriology， 1991， 41：324-325.

［16］Tamura K， Peterson D， Peterson N， et al. MEGA5：Molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood，evolutionary distance， and maximum parsimony methods［J］. Molecular Biology and Evolution， 2011， 28：2731-2739.

［17］Bhore SJ， Preveena J， Kandasamy KI. Isolation and identification of bacterial endophytes from pharmaceutical agarwood-producing Aquilaria species［J］. Phcog Res， 2013， 5：134-137.

［18］Brader G， Stephane C， Birgit M， et al. Metabolic potential of endophytic bacteria［J］. Curr Opin Biotechnol， 2014， 27：30-37.

［19］Christina A， Christapher V， Bhore SJ. Endophytic bacteria as a source of novel antibiotics：Anoverview［J］. Pharmacog Rev，2013， 7：11-16.

［20］Jeong H， Choi SK， Kloepper JW， Ryu CM. Genome sequence of the plant endophyte Bacillus pumilus INR7， triggering induced systemic resistance in field crops［J］. Genome Announc， 2014， 2 （5）：e01093-14.

［21］趙智靈， 劉學(xué)周， 魏曉雨， 等. 人參可利用內(nèi)生菌株的篩選和鑒定［J］. 中草藥， 2015， 46（14）：2143-2148.

［22］Danhorn T， Fuqua C. Biofilm formation by plant-associated bacteria［J］. Annual Review of Microbiology， 2007， 61：401-422.

［23］Blom D， Fabbri C， Connor EC， et al. Production of plant growth modulating volatiles is widespread among rhizosphere bacteria and strongly depends on culture conditions［J］. Environmental Microbiology， 2011， 13：3047-3058.

［24］ Gamalero E， Glick BR. Mechanisms used by plant growth-promoting bacteria［M］//Maheshwari DK. Bacteria in Agrobiology：Plant Nutriente Management. Berlin， Germany：Springer， 2011：17-46.

［25］Heerklotz H. Interactions of surfactants with lipid membranes［J］. Quarterly Reviews of Biophysics， 2008， 41（3-4）：205-264.

（責(zé)任編輯 馬鑫）

Antagonistic Efficacy and Growth-Promoting Effect of Bacillus methylotrophicus Isolated from Dendrobium huoshanense

WU Li-qin GU Hai-ke WANG Qing SHANG Hong-zhong LIU Gui-jun BAO Fang
（Beijing Radiation Center，Beijing 100875）

Isolating endophytic bacteria form Dendrobium huoshanense aimed to obtain endophytic bacteria that have broad-spectrum antimicrobial activity and plant growth-promoting trait. Plate confrontation method was applied to screen the endophytic bacteria with antimicrobial activities against the black spot disease of D. huoshanense，of which the antimicrobial spectrum and plant growth-promoting（PGP）traits were determined. Total 22 endophytes were isolated from D. huoshanense，and strain RA presented strong inhibitory activities against Alternaria tenuissima and it was identified as Bacillus methylotrophicus on the basis of 16S rDNA sequence analysis and was selected for further studies. Strain RA was capable of co-producing IAA，siderophore，protease，biosurfactant，and biofilm，and significantly inhibited 8 plant pathogens and had broad-spectrum antimicrobial effects. A significant improvement in corn seedlings growth was observed when seeds of corn were bacterized prior to sowing. In conclusion，results clearly suggest that strain RA is a potential candidate for use as biocontrol agent and in biofertilizer.

Dendrobium huoshanense；endophyte；Bacillus methylotrophicus；antagonistic efficacy；growth promotion

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.08.029

2015-11-09

北京市科學(xué)技術(shù)研究院改革與發(fā)展專項(xiàng)基金項(xiàng)目（92201306）

武利勤，女，博士，研究方向：微生物資源；E-mail：wulq@163.com