楊靜　孫兆偉　張渝

[摘要]目的：監(jiān)測梅毒患者外周血CD4⁺、CD8⁺調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的表達(dá)水平，考察其在臨床的參考價(jià)值。方法：將2014年12月至2015年9月，我院收治并確診的32例梅毒患者作為研究對象。其中，Ⅰ期、Ⅱ期、潛伏期梅毒患者分別有11例、15例和6例。采用細(xì)胞免疫芯片檢測（淋巴細(xì)胞CD4⁺、CD8⁺絕對數(shù)檢測）技術(shù)檢測并計(jì)算患者外周血中的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞CD4⁺、CD8⁺表達(dá)水平及CD4⁺、CD8⁺的比值。并與同期就診我科的30例非梅毒患者的相應(yīng)指標(biāo)數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。結(jié)果：與非梅毒患者比較，梅毒患者外周血中CD4⁺、CD8⁺細(xì)胞絕對值計(jì)數(shù)均顯著下降（P<0.05）；CD4⁺、CD8⁺比值顯著低于非梅毒患者組（P<0.05）。在Ⅰ期、Ⅱ期、潛伏期梅毒患者間CD4⁺、CD8⁺絕對值計(jì)數(shù)均值水平的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：在梅毒患者外周血中CD4⁺、CD8⁺表達(dá)水平及CD4⁺、CD8⁺比值均顯著降低，而在梅毒感染的不同疾病發(fā)展時(shí)期CD4⁺、CD8⁺表達(dá)水平也有著顯著的差異。

[關(guān)鍵詞]梅毒；外周血；調(diào)節(jié)性T細(xì)胞；CD4⁺；CD8⁺

[中圖分類號]R759.1 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

目前臨床針對梅毒的診療已有確定的診斷標(biāo)準(zhǔn)和治療方案。梅毒的疾病轉(zhuǎn)歸中面臨的主要臨床難題在于梅毒復(fù)發(fā)和再感染問題。有觀點(diǎn)認(rèn)為，梅毒患者內(nèi)部免疫系統(tǒng)對感染的防御中存在包括調(diào)節(jié)性T細(xì)胞CD4⁺、CD3⁺、CD8⁺等參與的免疫反應(yīng)。本研究中著重對梅毒患者外周血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞CD4⁺、CD8⁺的表達(dá)水平進(jìn)行監(jiān)測和探討，擬考察其在臨床的實(shí)踐意義。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

將2014年12月至2015年9月，我院收治并確診的32例梅毒患者作為研究對象。其中，男21例，女11例。年齡19～56歲。其中，Ⅰ期、Ⅱ期、潛伏期梅毒患者分別有11例、15例和6例。患者均符合國內(nèi)對梅毒的診斷標(biāo)準(zhǔn)（2002年）。無心、肝、肺、腎等其他系統(tǒng)的嚴(yán)重合并癥。其中，12例合并有非梅毒相關(guān)的感染。選擇同期本科室就診的非梅毒患者30例作為對照。受試者均經(jīng)梅毒螺旋體特異抗體測定（抗-TP）、梅毒甲苯胺紅不加熱血清反應(yīng)素試驗(yàn)TRUST等非特異性梅毒篩查試驗(yàn)，結(jié)合其它非梅毒專項(xiàng)檢查方法確診或排除梅毒。不同時(shí)期梅毒患者間、梅毒患者與非梅毒患者間，其在年齡、性別比例等臨床資料比較的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。但梅毒患者更易合并非梅毒性感染（P<0.05）。見表1。受試者均經(jīng)知情同意。

1.2 研究方法

采用細(xì)胞免疫芯片檢測技術(shù)。環(huán)境要求：室溫20～30℃；濕度：35%-65%；血樣要求：新鮮全血（8h內(nèi)）K2 EDTA抗凝；嚴(yán)禁冷藏。常規(guī)采集新鮮血液20μL，K2 EDTA抗凝。操作流程：（1）稀釋加樣：子彈頭加入380μL鱗酸鹽緩沖液，反吸法取20μL靜脈血樣加至380μL鱗酸鹽緩沖液中，充分混勻。（2）加樣孵育：充分混勻，反吸法取5uL稀釋血，加入玻片方框區(qū)域中央；濕盒內(nèi)加入室溫水，水平放置，孵育40min。（3）洗染計(jì)數(shù)：1）依次清洗：①1包鱗酸鹽粉+400mL蒸餾水?dāng)嚢杈鶆蛐D(zhuǎn)提拉至無色透明；②1包過氧化酶粉+500mL95%乙醇攪拌均勻（避光保存，12h后可使用）浸泡1min；③1000μL過氧化氫+400mL蒸餾水?dāng)嚢杈鶆蚪?min；④400mL 75%乙醇旋轉(zhuǎn)提拉至無色透明。2）干燥機(jī)吹干6min：1包復(fù)染粉+500mL 75%乙醇攪拌均勻（避光保存，12h后可使用），浸泡1min：5000mL蒸餾水浸泡30s后提拉出來，小于15片提拉3次，大于15片提拉5次，（每次更換）。3）干燥機(jī)吹干，自動(dòng)計(jì)數(shù)。通過以上方法檢測并計(jì)算受試者外周血中的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞CI4⁺絕對數(shù)、CD8⁺絕對數(shù)、CD4⁺/CD8⁺的表達(dá)水平。在2h內(nèi)完成標(biāo)本檢測。檢測的試劑盒購自上海匯中生物科技有限公司。所有檢測試劑盒均在有效期內(nèi)，嚴(yán)格按照其說明書進(jìn)行操作。采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SSPS17.0對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析。比較不同時(shí)期的梅毒患者間、梅毒患者與非梅毒患者的差異。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

計(jì)量數(shù)據(jù)用（x±s）表示，用F檢驗(yàn)或t檢驗(yàn)：計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)用x²檢驗(yàn)：計(jì)量資料的比較用t檢驗(yàn)，多個(gè)變量的均值比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CD4²調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表達(dá)水平的比較

經(jīng)t檢驗(yàn)，梅毒患者（包括Ⅰ期、Ⅱ期、潛伏期）外周血中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞CD4⁺的表達(dá)水平，與非梅毒患者比較均顯著降低（P<0.05）。經(jīng)Kurskal-Walis檢驗(yàn)，不同疾病分期梅毒患者中的該指標(biāo)均值水平的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

2.2 CD8⁺調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表達(dá)水平的比較

經(jīng)t檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，梅毒患者（Ⅰ期、Ⅱ期、潛伏期）外周血中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞CD8⁺的表達(dá)水平，與非梅毒患者比較均顯著降低（P<0.05）。經(jīng)Kurskal-Walis檢驗(yàn)，不同疾病分期梅毒患者中的該指標(biāo)均值水平的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表3。

2.3 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞CD4⁺/CD8⁺比值的比較

經(jīng)t檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，梅毒患者調(diào)節(jié)性T細(xì)胞CD4⁺/CD8⁺的比值，與非梅毒患者比較顯著降低（P<0.05）。經(jīng)Kurskal-Walis檢驗(yàn)，不同疾病分期梅毒患者中的該指標(biāo)均值水平的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表4。

3 討論

調(diào)節(jié)性T細(xì)胞是具有獨(dú)立功能的T細(xì)胞亞群。大量研究結(jié)果表明，CD4⁺、CD3⁺、CD8⁺等調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定、抗自身免疫性疾病、抗感染和抗腫瘤免疫等方面有重要作用。通常情況下調(diào)節(jié)性T細(xì)胞與其效應(yīng)細(xì)胞處于相對平衡，以維持機(jī)體正常的生理狀態(tài)。CD4⁺細(xì)胞為輔助性T淋巴細(xì)胞，CD8⁺是抑制性T淋巴細(xì)胞，CD4⁺、CD8⁺以及CD4⁺/CD8⁺直接協(xié)調(diào)一致的表達(dá)水平，才能維持機(jī)體具有正常的免疫應(yīng)答反應(yīng)。如CD4⁺、CD8⁺等T細(xì)胞的調(diào)節(jié)失衡或比例過高，則可能引起自身免疫性疾病的發(fā)生。資料顯示，如機(jī)體感染梅毒螺旋體，則外周血中CD4⁺的表達(dá)水平下降：而CD8⁺的表達(dá)水平增加，將可能導(dǎo)致遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)，臨床表現(xiàn)為Ⅱ期梅毒、潛伏期梅毒的持續(xù)狀態(tài)。CD8⁺淋巴細(xì)胞的表達(dá)異常，還將抑制梅毒螺旋體一抗體的形成，使梅毒螺旋體病毒得以繁殖與擴(kuò)散。而梅毒患者體內(nèi)CD4⁺/CD8⁺T細(xì)胞比例失衡，被認(rèn)為與血清固定現(xiàn)象有關(guān)。推測可能在患者接受系統(tǒng)、規(guī)范的抗生素治療的過程中，CD4⁺/CD8⁺T細(xì)胞調(diào)節(jié)失衡，故機(jī)體的細(xì)胞免疫功能受到了抑制，而此時(shí)體內(nèi)卻仍有少量的梅毒螺旋體菌感染的持續(xù)存在。此時(shí)如患者繼續(xù)接受抗生素治療，也無法再提高臨床效果。有資料表明，早期梅毒患者皮損的浸潤細(xì)胞中多有T淋巴細(xì)胞的優(yōu)勢表達(dá)。其中，I期梅毒患者CD4⁺淋巴細(xì)胞的表達(dá)占優(yōu)勢：Ⅱ期梅毒患者CD4⁺、CD8⁺淋巴細(xì)胞的絕對值數(shù)量相差不大。而在血清固定的梅毒患者，其外周血CD4⁺細(xì)胞表達(dá)水平顯著降低（P<0.05）。本研究結(jié)果中，梅毒患者外周血中CD4⁺細(xì)胞絕對值計(jì)數(shù)顯著下降（P<0.05），考慮為血清固定現(xiàn)象所致。

梅毒螺旋體等病毒侵入人體可損害患者的免疫系統(tǒng)，直接攻擊CD4⁺T淋巴細(xì)胞，所以CD4⁺T淋巴細(xì)胞數(shù)絕對值可以一定程度上反映人體的免疫功能情況。資料表明，CD4⁺T細(xì)胞計(jì)數(shù)若小于200，或CD4⁺/CD8⁺比值小于0.20，則（多種）機(jī)會性感染的幾率也顯著增加。臨床上，CD4⁺<250，CD4⁺/CD8⁺<0.7的患者視為細(xì)胞免疫嚴(yán)重低下，強(qiáng)烈建議進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)治療。本研究中，梅毒患者更易合并非梅毒性感染（x²=7.14，P<0.05）。這一點(diǎn)與文獻(xiàn)報(bào)道一致。

因CD4⁺細(xì)胞數(shù)絕對值可能隨生理波動(dòng)而有較大的波動(dòng)，故目前認(rèn)為，CD4⁺/CD8⁺的比值更能客觀反映患者的感染情況。感染患者，其體內(nèi)的CD4⁺/CD8⁺比值多在0.5以下。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與非梅毒患者比較，梅毒患者CD4⁺/CD8⁺比值顯著降低（P<0.05）。在梅毒感染的不同疾病發(fā)展時(shí)期，T淋巴細(xì)胞CD4⁺/CD8⁺的比值均有顯著的變化。本研究如上結(jié)果與文獻(xiàn)資料的報(bào)道也是一致的。

總之，梅毒患者外周血中CD4⁺、CD8⁺淋巴細(xì)胞的絕對值計(jì)數(shù)以及CD4⁺/CD8⁺比值均異常降低，且在梅毒感染的不同疾病發(fā)展時(shí)期CD4⁺、CD8⁺淋巴細(xì)胞的絕對值計(jì)數(shù)也有著顯著的變化。提示如上指標(biāo)在梅毒的疾病發(fā)生、發(fā)展中有著重要的臨床意義。

（收稿日期：2015-10-26）