敖 敦，楊海峰，王 雷，馬月林

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010019)

沙柳組培技術(shù)初探

敖 敦，楊海峰，王 雷，馬月林

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010019)

以沙柳莖段為外植體，開展不同基本培養(yǎng)基，植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑ZT、NAA組合的篩選試驗(yàn)。結(jié)果表明，在ZT、NAA組合，沙柳幼芽高生長(zhǎng)最佳培養(yǎng)基為1/2 WPM+ZT 1.0 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1，沙柳最佳生根培養(yǎng)基為1/2 WPM+ZT 0.1 mg·L-1+NAA 2.0 mg·L-1。在參試的MS、WPM、B5、DCR、White 5種培養(yǎng)基中，最適合沙柳幼芽莖段誘導(dǎo)及生根的培養(yǎng)基為WPM，葉片較綠，根較長(zhǎng)，生長(zhǎng)較快。

沙柳；組織培養(yǎng)；幼芽生長(zhǎng)；生根率

沙柳(Salixpsammophila)別名北沙柳，為楊柳科落葉叢生直立灌木或小喬木。樹高3～5 m，枝細(xì)長(zhǎng)、有毛、后變光滑、帶紫色；芽銳尖，具有柔毛[1]。沙柳喜濕潤(rùn)，容易繁殖，適應(yīng)性廣[2]。同時(shí)，可用作燃料、優(yōu)質(zhì)的家畜飼料及纖維板、刨花板、紡織、造紙的重要原料[3]。沙柳廣泛分布于鄂爾多斯、東阿拉善、陜西北部及寧夏東部[4]，是防風(fēng)固沙的優(yōu)良樹種，是高速公路、鐵路等路基護(hù)坡、礦山植被恢復(fù)的主要樹種。沙柳具有抗逆性強(qiáng)，耐寒，耐旱，耐風(fēng)沙鹽堿等特點(diǎn)，是我國(guó)沙荒地區(qū)造林的優(yōu)良樹種之一，應(yīng)用前景十分廣闊。

沙柳人工豐產(chǎn)栽培及扦插育苗等方面的研究已有大量報(bào)道[5-10]。在柳樹組織培養(yǎng)方面，國(guó)外Gr?nroos等[11]曾利用雌蕊及花序作為外植體進(jìn)行愈傷誘導(dǎo)、體細(xì)胞胚胎發(fā)生的研究；還開展了不同基本培養(yǎng)基的對(duì)比試驗(yàn)[12-13]，認(rèn)為基本培養(yǎng)基對(duì)于某些特定基因型具有一定優(yōu)勢(shì)；在生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的篩選研究發(fā)現(xiàn)離體培養(yǎng)的形態(tài)發(fā)生效率更依賴于參試的基因型。國(guó)內(nèi)對(duì)柳屬的組織培養(yǎng)研究相對(duì)較多[14-19]，對(duì)沙柳的組織培養(yǎng)研究極少，杜喜梅等[3]采用1年生沙柳春季萌發(fā)嫩枝為外植體，篩選出較適宜的分化增殖培養(yǎng)基與繼代培養(yǎng)基；楊海峰[20]在沙柳組織培養(yǎng)研究中發(fā)現(xiàn)了適宜沙柳嫩枝誘導(dǎo)與根誘導(dǎo)的較適宜培養(yǎng)基及植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比，發(fā)現(xiàn)WPM更適宜沙柳嫩枝的組織培養(yǎng)，葉片較綠，根較長(zhǎng)，生長(zhǎng)較快。

本研究以沙柳休眠芽為外植體，誘導(dǎo)無菌嫩枝，采用ZT、NAA組合進(jìn)行植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度篩選及基本培養(yǎng)基的篩選，摸索適合沙柳無菌芽誘導(dǎo)的基本培養(yǎng)基類型及適合的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度。本研究可為沙柳優(yōu)良無性系組培快繁體系的建立，以及利用沙柳快繁體系展開沙柳的細(xì)胞遺傳學(xué)研究建立基因工程轉(zhuǎn)化提供參考。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試材采自內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)苗圃，種源納林河，樹皮顏色灰綠，雄株，編號(hào)：08-3。以沙柳休眠的1～2年生木質(zhì)化莖段為外植體。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 沙柳外植體休眠枝莖段消毒及誘導(dǎo) 將枝條用洗潔精在流水下清洗后剪成約2～3 cm莖段，每個(gè)莖段保留1～2個(gè)休眠芽放入燒杯中，洗潔精水浸泡30 min，再繼續(xù)清水沖洗3 h，不斷震蕩洗滌。莖段移入滅菌超凈工作臺(tái)，先用75%酒精消毒，再用2%次氯酸鈉加入幾滴吐溫，不停振蕩搖晃消毒2次，用無菌水清洗，期間轉(zhuǎn)入新無菌瓶中，減少污染幾率。無菌水清洗至沒有泡沫為止。然后將消毒后的莖段兩端切除3～5 mm插入培養(yǎng)基中，所有培養(yǎng)基均附加蔗糖20 g·L-1、植物凝膠3 g·L-1，調(diào)節(jié)pH至5.8，封口，置于25 ℃，16 h光照，8 h黑暗條件的光照培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。每天觀察記錄、拍照1次。培養(yǎng)30 d后對(duì)苗高進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.2.2 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑種類及濃度篩選 選1/2 WPM為基本培養(yǎng)基，植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑采用ZT、NAA，設(shè)置30個(gè)組合，ZT質(zhì)量濃度分別為0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 mg·L-1，NAA質(zhì)量濃度分別為0、0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 mg·L-1。接種選用無菌嫩枝為外植體，切成約2 cm帶芽莖段，接種至培養(yǎng)基。每個(gè)組合10瓶，每瓶接種2個(gè)外植體，4次重復(fù)。

1.2.3 基本培養(yǎng)基的篩選 選用MS、WPM、B5、DCR、White等5種基本培養(yǎng)基，均附加蔗糖20 g·L-1、植物凝膠3 g·L-1，添加NAA 2 mg·L-1+6-BA 0.05 mg·L-1后調(diào)節(jié)pH至5.8。每個(gè)組合10瓶，每瓶接種2個(gè)外植體，4次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 沙柳無菌苗誘導(dǎo)培養(yǎng)觀察

沙柳莖段培養(yǎng)第5天，葉腋處腋芽開始萌動(dòng)，鱗芽增大，長(zhǎng)出綠色芽點(diǎn)；隨后14 d左右，嫩枝基部可見紅色根尖，腋芽逐漸伸長(zhǎng)，深綠色幼嫩葉片逐漸展開；培養(yǎng)45 d時(shí)，側(cè)芽平均高度約為4 cm，平均根長(zhǎng)約為6 cm(圖1)。

2.2 ZT、NAA不同濃度組合對(duì)沙柳幼芽高生長(zhǎng)的影響

培養(yǎng)30 d后苗高統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表1。由表1可知：在ZT 0.1 mg·L-1時(shí)，隨NAA質(zhì)量濃度增大，苗高表現(xiàn)為降低→增高→再降低的趨勢(shì)；在ZT 0.5～1.0 mg·L-1時(shí)，隨NAA質(zhì)量濃度增大，苗高表現(xiàn)為先增高后降低的趨勢(shì)，苗高最高達(dá)到1.7 cm；在ZT 1.5～2.0 mg·L-1時(shí)，隨NAA質(zhì)量濃度增大，苗高表現(xiàn)降低的趨勢(shì)?？傮w而言，隨著ZT質(zhì)量濃度的增大，沙柳嫩枝高生長(zhǎng)呈現(xiàn)顯著下降趨勢(shì)，可見，ZT對(duì)沙柳幼苗的高生長(zhǎng)抑制效果顯著。最佳幼芽高生長(zhǎng)培養(yǎng)基為1/2 WPM+ZT 1.0 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1。

2.3 ZT、NAA不同濃度組合對(duì)沙柳嫩枝生根的影響

培養(yǎng)30 d后沙柳嫩枝生根率統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表1。從表1可以看出，隨著ZT濃度的增加，其生根率出現(xiàn)下降趨勢(shì)，在ZT為0.1～0.5 mg·L-1時(shí)，生根率隨著NAA的增加呈現(xiàn)增高趨勢(shì)，說明NAA對(duì)生根有促進(jìn)作用；在ZT為2.0 mg·L-1時(shí)，生根率均為0，說明高濃度的ZT對(duì)沙柳嫩枝生根的抑制作用顯著。最適宜的嫩枝生根培養(yǎng)基為1/2 WPM+ZT 0.1 mg·L-1+NAA 2.0 mg·L-1+pH 5.8。

2.4 不同基本培養(yǎng)基對(duì)沙柳幼芽莖段誘導(dǎo)及生長(zhǎng)的影響

在5種基本培養(yǎng)基培養(yǎng)9 d后，葉腋處腋芽部分開始萌動(dòng)，出現(xiàn)淡綠色芽尖，莖段基部部分開始出現(xiàn)紅色根尖。在WPM培養(yǎng)基上，沙柳生長(zhǎng)速度快，葉片比較綠，且沒有出現(xiàn)葉片黃化現(xiàn)象。在MS培養(yǎng)基，沙柳生長(zhǎng)速度較慢，葉片前期生長(zhǎng)比較綠，但后期逐漸黃化。而DCR、White、B5等培養(yǎng)基，沙柳生長(zhǎng)速度緩慢，而且均出現(xiàn)黃化現(xiàn)象。

2.5 不同基本培養(yǎng)基對(duì)沙柳嫩芽生根的影響

生根培養(yǎng)30 d后發(fā)現(xiàn)，WPM、MS、DCR等3種基本培養(yǎng)基上的嫩枝生根率達(dá)到了100%，而B5和White培養(yǎng)基上的嫩枝生根率只有達(dá)到40%。綜合沙柳莖段萌生嫩枝與長(zhǎng)勢(shì)及根的長(zhǎng)勢(shì)，認(rèn)為WPM培養(yǎng)基為沙柳幼芽莖段生根的最佳基本培養(yǎng)基。

3 結(jié)論與討論

在ZT、NAA組合中沙柳嫩枝幼芽高生長(zhǎng)最佳培養(yǎng)基為1/2 WPM+ZT 1.0 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1。沙柳嫩枝最佳生根培養(yǎng)基為1/2 WPM+ZT 0.1 mg·L-1+NAA 2.0 mg·L-1。選用的5種基本培養(yǎng)基中沙柳嫩枝生長(zhǎng)的最佳基本培養(yǎng)基為WPM。

細(xì)胞分裂素不僅能促進(jìn)植物細(xì)胞的分裂和擴(kuò)大，而且在芽分化的誘導(dǎo)、葉綠體的發(fā)育、養(yǎng)分的運(yùn)輸和分配、細(xì)胞衰老的抑制等方面都表現(xiàn)出顯著的效果[20]。生長(zhǎng)素能促進(jìn)根和莖的發(fā)育和生長(zhǎng)、器官的衰老、維管束組織的形成和分化發(fā)育，以及植物的向地和向光反應(yīng)等[21]。但不同種類的生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素對(duì)植物生長(zhǎng)的影響不一定相同。本研究發(fā)現(xiàn)隨著ZT濃度的增加幼芽的高生長(zhǎng)受抑制，其生根率也明顯下降。一般低濃度的細(xì)胞分裂素可促進(jìn)高生長(zhǎng)，而高濃度的細(xì)胞分裂素促進(jìn)側(cè)芽生長(zhǎng)而抑制高生長(zhǎng)，但在本研究中，即使低濃度的ZT也表現(xiàn)出對(duì)高生長(zhǎng)的抑制作用，其原因可能是沙柳對(duì)ZT非常敏感。在前期研究中[20]，發(fā)現(xiàn)低濃度6-BA對(duì)嫩枝高生長(zhǎng)和生根表現(xiàn)為促進(jìn)作用，高濃度時(shí)顯示出抑制作用，因此，6-BA可作為一種更適合的細(xì)胞分裂素應(yīng)用于沙柳的組織培養(yǎng)研究中，應(yīng)謹(jǐn)慎采用ZT。對(duì)于細(xì)胞生長(zhǎng)素的應(yīng)用，本研究主要采用了NAA，初步研究認(rèn)為NAA對(duì)沙柳幼苗生長(zhǎng)及生根均有較好的促進(jìn)作用，與前期研究結(jié)果一致[20]。在今后的研究中，可借鑒杜喜梅等[3]采用的6-BA與KT組合，有可能取得更好的培養(yǎng)效果。

表1 沙柳嫩枝在1/2 WPM+ZT+NAA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)狀況統(tǒng)計(jì)

*：同列不同小寫字母為0.05水平上差異顯著。下同。

表2 不同基本培養(yǎng)基上沙柳嫩枝莖段生長(zhǎng)狀況比較

基本培養(yǎng)基中含有植物生長(zhǎng)所需要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，是植物組織培養(yǎng)中不可缺少的基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，培養(yǎng)基的類型與組織培養(yǎng)的成功有很大關(guān)系。本研究采用MS、WPM、B5、DCR、White 5種基本培養(yǎng)基對(duì)沙柳嫩枝的組織培養(yǎng)差異較大。WPM是一種低鹽培養(yǎng)基，適應(yīng)木本植物生長(zhǎng)。本研究也發(fā)現(xiàn)該培養(yǎng)基比較符合沙柳的生長(zhǎng)，長(zhǎng)勢(shì)較好，生長(zhǎng)較快，這可能由于沙柳生長(zhǎng)在我國(guó)西北地區(qū)，生長(zhǎng)環(huán)境十分貧瘠，沙柳已適應(yīng)低養(yǎng)分的生長(zhǎng)環(huán)境。在高鹽培養(yǎng)基MS中培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，沙柳嫩枝長(zhǎng)勢(shì)低于WPM培養(yǎng)基，生長(zhǎng)較慢，所以MS培養(yǎng)基可能不適合沙柳的組織培養(yǎng)。在培養(yǎng)基B5中，沙柳生長(zhǎng)較慢，B5中含有較低的銨，這可能對(duì)沙柳的生長(zhǎng)有抑制作用。在低鹽培養(yǎng)基DCR、White等培養(yǎng)基中，沙柳生長(zhǎng)也較差，可能與培養(yǎng)基本身營(yíng)養(yǎng)成分的差異有關(guān)，如DCR中K元素含量低，而適宜沙柳生長(zhǎng)的WPM培養(yǎng)基中含有大量的K，可能是K、S等含量較低導(dǎo)致DCR對(duì)沙柳生長(zhǎng)作用不大。在杜喜梅等[3]對(duì)沙柳以及余如剛等[19]對(duì)旱柳的組培研究中發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)較好的基本培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，與本研究所發(fā)現(xiàn)WPM為適宜培養(yǎng)基有所差異，這有可能與采用的沙柳基因型以及外植體差異有關(guān)。

[1]丁志剛，任安海，蘇亮明.淺談沙柳的生物學(xué)特性，自然分布及平茬復(fù)壯技術(shù)[J].內(nèi)蒙古林業(yè)調(diào)查設(shè)計(jì)，2005，28(增刊)：36-39.

[2]李維向，劉朝霞，閆偉，等.沙柳優(yōu)良品系選育的研究[J].中國(guó)沙漠，2008，28(4)：679-684.

[3]杜喜梅，燕麗萍，王太明，等.沙柳組織培養(yǎng)快繁技術(shù)研究[J].山東林業(yè)科技，2006(6)：7-8.

[4]米志英，高永，弓彩霞，等.庫布齊沙漠沙柳林復(fù)壯更新技術(shù)措施研究[J].干旱區(qū)資源與環(huán)境，2008，22(6)：186-189.

[5]蒼久和.沙柳的人工栽培豐產(chǎn)技術(shù)[J].中國(guó)林副特產(chǎn)，2004，2(69)：34.

[6]王開芳，趙萍，侯立群，等.沙柳引種扦插育苗試驗(yàn)[J].山東林業(yè)科技，2006(3)：37-38.

[7]安保，白永祥，田志.沙柳生物學(xué)特性與造林技術(shù)研究[J].內(nèi)蒙古林業(yè)科技，2003(增刊)：24-26.

[8]何麗君，慈忠玲，李健軍.沙柳莖葉結(jié)構(gòu)的比較解剖學(xué)觀察[J].內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2000，21(1)：128-132.

[9]許鳳，鐘新春，孫潤(rùn)倉，等.沙柳的超微結(jié)構(gòu)及其木素微區(qū)分布的研究[J].中國(guó)造紙學(xué)報(bào)，2005，20(1)：6-9.

[10]寧明世，李奇，侯春艷.以無性系育種與等位酶技術(shù)對(duì)沙柳優(yōu)良無性系的選擇研究[J].內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，25(3)：18-23.

[11]Lotta Gr?nroos.Callus Production and Somatic Embryogenesis from Floral Explants of Basket Willow (Salix viminalis L.)[J].Journal of Plant Physiology，1989(134)：558-566.

[12]O.S.Mashkina.Method of Clonal Micropropagation of Different Willow.Species and Hybrids[J].Applied Biochemistry And MicrobioloGgy，2010，46(8)：769-775.

[13]Lottabergma.Effects of N6-benzyladenine on shoots of five willow clones(Salix spp.) cultured in vitro[J].Plant Cell Tissue Organ Culture，1985(4)：135-144.

[14]沈周高，項(xiàng)艷，蔡誠(chéng)，等.3個(gè)楊樹品種葉片再生體系的建立[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2006，22(11)：90-96.

[15]郭瑤，吳建慧.蒙古柳的組織培養(yǎng)與快速繁殖[J].植物生理學(xué)通訊，2009，45(12)：1211-1212.

[16]王向軍，陶晶，張士俊，等.鉆天柳腋芽組培快繁技術(shù)的研究[J].吉林林業(yè)科技，2006，35(2)：8-11.

[17]關(guān)亞麗，陳英，黃敏仁.簸箕柳組織培養(yǎng)初步研究[J].海南師范大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2009，22(2)：204-208.

[18]唐效蓉，李午平，黎玉才.雜交柳優(yōu)良無性系組培快繁技術(shù)研究[J].湖南林業(yè)科技，2002，29(4)：28-30.

[19]余如剛，杜雪玲，夏陽，等.旱柳Q106組織培養(yǎng)及快繁體系的建立[J].草原與草坪，2005(5)：57-59.

[20]楊海峰.沙柳休眠芽及嫩枝離體培養(yǎng)的初步研究[J].內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，35(2)：67-72.

[21]呂劍，喻景權(quán).植物生長(zhǎng)素的作用機(jī)制[J].植物生理學(xué)通訊，2004，40(5)：624-628.

The Initial Exploration on Tissue culture ofSalix

AO Dun，YANG Hai-feng，WANG Lei，MA Yue-lin

(CollegeofForestry，InnerMongoliaAgriculturalUniversityHohhot010019，Neimenggu，China)

Taking theSalixbuds as explants，screening experiment the different basic culture medium and ZT、NAA combination.The results showed that in the ZT、NAA combination，medium 1/2 WPM+ZT 1.0 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1is suitable for shoots growth and the best suitable rooting medium is 1/2 WPM+ZT 0.1 mg·L-1+NAA 2.0 mg·L-1.The results showed that WPM basic medium is suitable for shoots induction and rootage growth between the MS、WPM、B5、DCR、White five basic medium，buds with the green leaves，fast roots growth.

Salixpsammophila；tissue culture；shoots growth；rooting rates

2015-03-09；

2015-04-17

中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金(胡楊功能基因組研究平臺(tái)構(gòu)建和功能基因發(fā)掘，CAFYBB2011001)；國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(利用擬南芥突變體鑒定木材發(fā)育相關(guān)基因功能研究，31360187)；內(nèi)蒙古自治區(qū)高等學(xué)?？茖W(xué)研究項(xiàng)目(胡楊大片段DNA轉(zhuǎn)化擬南芥研究，NJZY13076)

敖敦(1989—)，女(蒙古族)，內(nèi)蒙古赤峰人，內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院碩士研究生，從事園林植物與人居環(huán)境研究。E-mail：aodun520@sina.cn。

楊海峰(1975—)，男(蒙古族)，內(nèi)蒙古呼和浩特人，內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院副教授，博士，從事林木遺傳育種、林木基因工程的研究與教學(xué)工作。E-mail：yang_hf888@163.com。

10.13428/j.cnki.fjlk.2016.01.018

S723.1+32.6

A

1002-7351(2016)01-0080-04