蔡曉明，陳家榮，梁光紅

(1.福建農(nóng)林大學(xué)林學(xué)院，福建 福州 350002； 2.福州市林業(yè)局，福建 福州 350005；3.建甌市葉坑國有林業(yè)采育場，福建 建甌 353133)

蚧菌共寄生對馬尾松針葉POD活性的影響

蔡曉明1，2，陳家榮3，梁光紅1

(1.福建農(nóng)林大學(xué)林學(xué)院，福建 福州 350002； 2.福州市林業(yè)局，福建 福州 350005；3.建甌市葉坑國有林業(yè)采育場，福建 建甌 353133)

松突圓蚧與枯斑擬盤多毛孢菌都是嚴重危害福建省馬尾松的主要林業(yè)有害生物。由于二者可共寄生于馬尾松的松針，因此重點研究測定松針在二者共寄生條件下體內(nèi)過氧化物酶的活性變化，對于探析松突圓蚧-枯斑擬盤多毛孢菌-馬尾松針葉之間的互作關(guān)系具有重要作用。以5年生馬尾松有蟲有病(共寄生)、有蟲無病(獨寄生/蟲)、無蟲有病(獨寄生/病)、無蟲無病(健康針葉，對照)針葉為研究對象，采用紫外吸收法測定松針內(nèi)過氧化物酶的活性特征。結(jié)果表明，不同松針的POD酶活性大小順序為：有蟲有病>有蟲無病>無蟲有病>無蟲無病。顯然，病、蟲無論是共寄生還是獨寄生都會誘導(dǎo)POD活性上升；但有蟲有病、有蟲無病處理的POD活性分別是無蟲有病處理的POD活性的5.10、3.72倍，表明蟲害在POD活性誘導(dǎo)過程中占據(jù)了主導(dǎo)作用；共寄生處理的POD實際測定值為435.0 U·g-1·min-1，顯著高于二者單獨處理條件下POD的理論相加值402.8 U·g-1·min-1(P<0.05)，表明松突圓蚧、枯斑擬盤多毛孢菌在誘導(dǎo)POD活性上升過程中可能存在互惠共利關(guān)系并導(dǎo)致了聯(lián)合增效作用。因此，防治松突圓蚧時建議兼治松赤枯病，可進一步提升防控效果。

松突圓蚧；枯斑擬盤多毛孢；馬尾松；共寄生；過氧化物酶

松突圓蚧(HemiberlesiapitysophilaTakagi)屬同翅目(Homoptera)盾蚧科(Diaspididae)，是一種危險性極大的林業(yè)外來入侵害蟲，危害性極強。我國20世紀80年代初由珠海入侵，成為我國南部地區(qū)最具代表性的森林外來入侵物種之一。10 a間便快速擴張至廣東大部分地區(qū)，福建和廣西局部地區(qū)，在沿海地區(qū)危害猖獗[1-2]，并呈現(xiàn)向內(nèi)陸林區(qū)擴展蔓延的態(tài)勢，對福建省森林資源及國土生態(tài)安全構(gòu)成了嚴重的威脅[3-5]。松突圓蚧在福建沒有明顯的越冬現(xiàn)象，主要聚居在松針鞘內(nèi)通過刺吸松針進行危害，受害針葉出現(xiàn)黃化、死亡和早落，甚至導(dǎo)致松樹大面積枯死或衰退。而枯斑擬盤多毛孢(Pestalotiasfunereal)屬于半知菌亞門，黑粉菌目，是松赤枯病的病原真菌，被列入2003年國家林業(yè)局首次發(fā)布的林業(yè)危險性有害生物名單(檢防函[2003]14號)。該病原菌能浸染多種松屬植物，是中國長江以南森林內(nèi)廣泛存在的優(yōu)勢菌種。主要通過傷口、自然孔口侵入，常寄生在松針葉鞘，引起針葉萎黃病、死亡、早落等[5-6]。

2012年6月，通過野外調(diào)查發(fā)現(xiàn)，松突圓蚧與枯斑擬盤多毛孢在同一松針的共寄生比例最高達43%，特別在6—10月松突圓蚧種群密度較低的季節(jié)[4-5]，二者共寄生針葉松突圓蚧的存活蟲口數(shù)量顯著增多；它們還具有重疊的危害高峰期且主要借助風(fēng)力傳播。因此，推測共寄生的松突圓蚧和枯斑擬盤多毛孢可能有互相促進的作用，從而對植株產(chǎn)生更大的危害[6]，為此開展了系列生理生化試驗。本文以鄰甲氧基苯酚(即愈創(chuàng)木酚)為過氧化物酶的底物，采用紫外吸收法測定過氧化物酶的活性，探討松突圓蚧與枯斑擬盤多毛孢共寄生條件下的互作關(guān)系及二者的成災(zāi)機制，探索治理松突圓蚧新的輔助方法，具有一定的理論與實踐意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

采用接蟲法制備感蟲樣株。2013年3月中旬—4月中旬，從野外采集松突圓蚧危害的松枝(若蟲高峰期)，剪取嚴重受害的小枝掛放于5年生健康松苗上，定期檢查其若蟲固定及蚧殼形成，以此獲得感蟲條件基本一致的受害松苗。同時，采用噴霧法制備感病樣株。先采用PDA平板培養(yǎng)基培養(yǎng)菌絲，采用打孔器取直徑7 mm菌絲塊接種到100 mL的PD培養(yǎng)基(馬鈴薯和葡萄糖)培養(yǎng)，然后在25 ℃下靜置培養(yǎng)27 d，用雙層紗布濾去菌絲體，再用雙層濾紙過濾獲得液體代謝物備用。接種時將液體代謝物均勻噴霧到5年生健康松苗上，定期檢查松針的感病情況，以此獲得感病植株與樣品。

按照上述方法，10束待測松針分別來自：①有蟲有病(共寄生)，將攜有大量初孵若蚧的松枝掛放在5年生健康松苗上，5 d后采用噴霧法接入枯斑擬盤多毛孢菌，待松針出現(xiàn)初期癥狀后，選擇并標記有蟲有病的松針作為試驗材料；②有蟲無病(獨寄生/蟲)，按上述方法只接入松突圓蚧若蚧；③無蟲有病(獨寄生/病)，按上述方法只接入枯斑擬盤多毛孢菌；④健康松針，作為對照。同時，確保在同一時段和相同氣象條件下取樣。

1.2 粗酶液的制備

稱取待測松針樣品0.1 g，剪碎放入研缽中，分多次向研缽中加入適量的磷酸緩沖液研磨成勻漿。殘渣再用5 mL磷酸緩沖液提取1次，勻漿分裝倒入離心管。以4000 r·min-1低溫離心15 min，上清液即為粗酶液，用磷酸緩沖液定容至10 mL，收集上清液于4 ℃冰箱備用。

1.3 過氧化物酶活性測定

過氧化物酶活性測定采用紫外分光法[7-12]。

1.3.1 反應(yīng)時間的優(yōu)化 隨機抽取采集到的試驗針葉樣品0.1 g。取A、B 2支試管，隨機抽取粗酶液，按照表1配制反應(yīng)溶液。迅速將2支試管中的溶液混合均勻后倒入比色杯，置于分光光度計樣品室內(nèi)，立即開啟秒表記錄時間，于470 nm波長處測定吸光度值，每隔10 s讀數(shù)1次。一直讀取至250 s，并記錄數(shù)據(jù)。依據(jù)吸光值隨反應(yīng)時間的變化曲線即底物的反應(yīng)進度來確定反應(yīng)時間。

表1 預(yù)備試驗試劑添加量

1.3.2 過氧化物酶活性 測定時取A、B 2支試管，按照表1配制反應(yīng)溶液。然后將2支試管中的溶液混合均勻后倒入比色杯，置于分光光度計并在470 nm波長處測定吸光度值，每隔10 s讀數(shù)1次記錄數(shù)據(jù)直至2 min。每處理重復(fù)3次。

本試驗以鄰甲氧基苯酚(即愈創(chuàng)木酚)為過氧化物酶的底物，在該酶作用下，H2O2可將鄰甲氧基苯酚氧化成紅棕色的4-鄰甲氧基苯酚在470 nm波長處有最大光吸收，依據(jù)吸光度變化斜率即可確定過氧化物酶活性。

1.4 統(tǒng)計方法

各吸光值由3次重復(fù)樣品計算而得，采用Office Excel 2007進行數(shù)據(jù)標準變換和初步分析。計算公式參照研究文獻[9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 反應(yīng)時間的優(yōu)化

從圖1可以看出，吸光度值在0～2 min內(nèi)呈先小幅上升后緩慢下降，最終趨于一個臨界值。推測這一吸光值呈現(xiàn)大幅下降趨勢現(xiàn)象與底物反應(yīng)殆盡有關(guān)，反應(yīng)宜在前2 min內(nèi)完成效果最好，因此后續(xù)測定的反應(yīng)時間為2 min。

2.2 POD活性水平

從測定的POD活性水平看，所有處理組POD活性都明顯高于對照(圖2)，表明病、蟲無論是共寄生還是獨寄生都會誘導(dǎo)POD活性上升。但3種處理POD活性比較發(fā)現(xiàn)，共寄生的POD活性比松突圓蚧獨寄生略高，僅為其POD活性的1.37倍；共寄生POD活性卻是枯斑擬盤多毛孢菌獨寄生POD活性的5.10倍，相差349.7個酶活性單位；在各自獨寄生處理后，松突圓蚧獨寄生的POD活性水平是枯斑擬盤多毛孢菌獨寄生的POD活性的3.72倍，二者相差232個酶活性單位。表明松突圓蚧危害在誘導(dǎo)POD活性過程中具主導(dǎo)作用，而枯斑擬盤多毛孢菌的誘導(dǎo)作用相對較弱。

二者共寄生的POD實測值435.0 U·g-1·min-1；但若將獨寄生蟲、獨寄生病的POD活性進行簡單相加，得到POD活性的理論值為402.8 U·g-1·min-1，低于實測值。表明松突圓蚧、枯斑擬盤多毛孢菌在誘導(dǎo)POD活性上升過程中存在聯(lián)合增效作用或互惠共利效應(yīng)。

2.3 POD活性的變化過程與趨勢

從反應(yīng)過程來看，各處理的吸光值—時間的線性擬合斜率代表POD活性水平(圖3)。共寄生所誘導(dǎo)的吸光值明顯高于其他處理，且變化斜率最大(K=-0.0803)，反應(yīng)最為敏感；然后依次是有蟲無病(K=-0.0443)、無蟲有病(K=-0.0183)；無蟲無病(K=0.0018)的變化最為平緩，趨勢最小，表明不存在明顯的活性變化。比較數(shù)據(jù)趨勢及線性模擬的相關(guān)系數(shù)，有蟲有病(R2=0.8969，P<0.05)的數(shù)據(jù)波動最大，因而線性相關(guān)系數(shù)最小；無蟲有病(R2=0.9731，P<0.05)相關(guān)系數(shù)最高；有蟲無病(R2=0.9314，P<0.05)與無蟲無病(R2=0.9486，P<0.05)的相關(guān)系數(shù)較為接近。

3 結(jié)論與討論

3.1 病蟲共寄生比獨寄生具有更高的危害水平

一般地，寄主植物在遭受機械損傷或病蟲危害后，都會在形態(tài)上在其受傷部位形成愈傷組織，在生理上誘導(dǎo)防御反應(yīng)等，如改變植物體內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)和次生物質(zhì)的組成[13]；膜系統(tǒng)也會受到破壞并使電導(dǎo)率上升[14]，而體內(nèi)抗氧化酶系(POD、SOD、CAT、PPO、GSH)等的活性較大幅度增加可緩解逆境脅迫對膜系統(tǒng)的傷害[14-17]，這是植物對外界脅迫應(yīng)答的典型生理過程。松突圓蚧、枯斑擬盤多毛孢菌無論是單獨寄生還是共寄生馬尾松的松針，都會誘導(dǎo)其松針內(nèi)的POD活性增強；但從三者活性變化的程度來看，共寄生所誘導(dǎo)的POD活性呈現(xiàn)了“1+1>2”的特點，即當二者共存條件下，松針內(nèi)POD活性高于二者各自獨寄生條件下的理論總和，表明共寄生比獨寄生對松針具有更高的危害水平，可能是二者共同寄生松針誘導(dǎo)植物抗性的疊加效應(yīng)。

3.2 松突圓蚧在共寄生體系中對POD活性誘導(dǎo)具有主導(dǎo)作用

松突圓蚧與枯斑擬盤多毛孢菌無論是共寄生還是獨寄生都會誘導(dǎo)受害針葉POD活性上升，但上升的水平則各不相同。涉及蟲害的2種處理的POD活性明顯高于病原單獨寄生的處理，表明蟲害對POD活性誘導(dǎo)具有主導(dǎo)作用，而病害對POD活性誘導(dǎo)作用相對較小。與前人的研究相比，有關(guān)單一病害或蟲害對植株危害后誘導(dǎo)抗氧化酶系的研究頗多[14-20]，如濕地松經(jīng)松針褐斑病菌毒素處理后，PAL、PPO與SOD 活性呈現(xiàn)不同規(guī)律的變化[14]；毛白楊接種野生根癌農(nóng)桿菌后，會誘導(dǎo)POD等酶活性提高[12]；棉蚜取食可誘導(dǎo)棉花多酚氧化酶和過氧化物酶的活性增加[17]。但涉及二者共寄生及互作下的抗逆酶系研究較少，無法進行類似研究的比較。至于松突圓蚧在共寄生體系產(chǎn)生主導(dǎo)作用的機制，尚需進一步深入研究。

3.3 松突圓蚧與枯斑擬盤多毛孢菌在共寄生體系中具有互利關(guān)系

本研究表明，松突圓蚧與枯斑擬盤多毛孢菌在誘導(dǎo)POD活性上升過程中存在聯(lián)合增效作用或互惠共利效應(yīng)；野外調(diào)查還發(fā)現(xiàn)，枯斑擬盤多毛孢菌一般在新的松針抽生不久先行侵入葉鞘外部，而松突圓蚧待新抽生松針葉鞘松散后才大量侵入葉鞘內(nèi)部，可能與新抽松針葉鞘包裹緊密而不易侵入內(nèi)部有關(guān)。為此推測二者互利模式可能為：枯斑擬盤多毛孢菌侵入松針導(dǎo)致直接危害，還突破了松針的物理防御，為松突圓蚧侵入創(chuàng)造了便利條件；松突圓蚧侵入后具有更高的危害水平，進一步突破松樹的防御體系并減弱松樹長勢，隨后更有利于二者繼續(xù)危害松針并加劇危害程度。但有關(guān)其互利的分子機制還有待繼續(xù)研究。因此，在防治松突圓蚧過程中，應(yīng)考慮兼治松赤枯病，不但利于控制病害的蔓延危害，而且能減少松突圓蚧的侵入葉鞘內(nèi)的機率和降低危害程度，達到進一步提高松突圓蚧的防控效果。

當然，要揭示松突圓蚧與枯斑擬盤多毛孢菌在共寄生條件下互作的生理生化機制，還需要對松針的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化、植物營養(yǎng)物質(zhì)及次生物質(zhì)含量等進行測定[13]，抗逆酶的全面分析以及基因水平上的表達、松樹抗性和環(huán)境因子等方面開展更系統(tǒng)而深入的研究。

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Effect of Co-Parasitism byHemiberlesiapitysophilaandPestalotiafunereaon Peroxidase of Masson Pine Needles

CAI Xiao-ming1，2，CHEN Jia-rong3，LIANG Guang-hong1

(1.FujianAgricultureandForestryUniversity，F(xiàn)uzhou350002，F(xiàn)ujian，China； 2.FuzhouForestryBureauofFujianProvince，F(xiàn)uzhou350005，F(xiàn)ujian，China； 3.YekengState-ownedForestryFarm，Jianou353133，F(xiàn)ujian，China)

HemiberlesiapitysophilaandPestalotiasfunereaare most important species infested masson pine trees in Fujian Province.Both of them were founded frequently in the same pine needle which means they are likely to exist in the same needle.So we just focused on the Peroxidase of needles infested by both of them，one of them only to explore the relationship among the fungi，pest and host.The peroxidase was extracted from five-year old needle and measured based on ultraviolet absorption method with control of health needles.The results showed that activity order of Peroxidase was co-parasitism，H.pitysophilaonly，P.funereaand control.Peroxidase activity was always induced to increase after the needles were inoculated，no matter how the treatment was.But the treatment concerned withH.pitysophila，including co-parasitism andH.pitysophilaonly，were much higher than treatment ofP.funereaonly，namely，they were 5.10 and 3.72 times asP.funereaonly，which means pest infestation played more important role during the process of co-parasitism.Theoretical value of pest only and fungi only was still lower than that of co-parasitism，which means each of them played a mutually beneficial role which leads to superimposed effect.Therefore，to improve and enhance the control effect ofH.pitysophila，prevention ofP.funereais also needed to be taken into consideration.

Hemiberlesiapitysophila；Pestalotiasfunerea；Pinusmassoniana；co-parasitism；peroxidase

10.13428/j.cnki.fjlk.2016.02.016

2015-08-12；

2015-08-23

福建省自然科學(xué)基金(2011J01070)

蔡曉明(1975—)，男，福州永泰人，福州市林業(yè)局高級工程師，在職碩士，從事林業(yè)有害生物防治檢疫與林業(yè)科技推廣工作。E-mail：457118557@qq.com。

梁光紅(1975—)，男，福建農(nóng)林大學(xué)林學(xué)院副教授，碩士生導(dǎo)師，從事森林昆蟲學(xué)研究。E-mail：fjlhg@126.com。

S791.248；S763

A

1002-7351(2016)02-0085-05