程丹丹，徐天虹，王　舒，趙玉婷，肖其敏

(1.浙江理工大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，杭州 310018；2.南京市第二十九中學(xué)，南京 210036；3.東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物工程學(xué)系，南京 210009)

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固定化重組大腸桿菌細(xì)胞催化合成靛藍(lán)

程丹丹1，徐天虹2，王舒3，趙玉婷3，肖其敏2

(1.浙江理工大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，杭州 310018；2.南京市第二十九中學(xué)，南京 210036；3.東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物工程學(xué)系，南京 210009)

為提高表達(dá)黃素單加氧酶(FMO, E.C.1.14.13.8)的重組菌E.coliBL21(pET28a-fmo)轉(zhuǎn)化吲哚的效率，采用包埋法對(duì)重組菌進(jìn)行了固定化研究。采用常規(guī)的固定化方法，分別使用卡拉膠、明膠、聚乙烯醇、海藻酸鈉對(duì)重組大腸桿菌進(jìn)行包埋并分析各自對(duì)吲哚的轉(zhuǎn)化效果，確定了海藻酸鈉是較好的固定化載體。隨后對(duì)海藻酸鈉固定化條件進(jìn)行研究，得到合適的條件是：海藻酸鈉濃度為2.0%，CaCl2濃度為2.0%，固定化時(shí)間8 h，細(xì)胞包埋量50 g/L。采用該方法制備的固定化細(xì)胞靛藍(lán)的轉(zhuǎn)化率為58.6%，固定化后重組E.coli細(xì)胞的耐熱性明顯提高，且具有較好的操作穩(wěn)定性，重復(fù)催化第8次的轉(zhuǎn)化率為第1次的29.5%，說明固定化細(xì)胞轉(zhuǎn)化法確實(shí)提高了重組細(xì)胞的轉(zhuǎn)化吲哚合成靛藍(lán)的效率。

重組大腸桿菌；固定化；生物合成；靛藍(lán)

0　引　言

靛藍(lán)是最早發(fā)現(xiàn)也是使用量最大的染料之一，在紡織、食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域具有廣泛的運(yùn)用。微生物合成靛藍(lán)工藝以其高效、環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)備受關(guān)注[1]。早在1929年就有微生物合成靛藍(lán)的報(bào)道，但是野生型的菌株合成靛藍(lán)的效率低、副產(chǎn)物多。1983年，Ensley等[2]首次使用表達(dá)萘雙加氧酶的基因工程菌進(jìn)行靛藍(lán)生物合成，利用重組氧化酶轉(zhuǎn)化合成靛藍(lán)成為研究熱點(diǎn)[3]。該研究表明，通過雙加氧、單加氧或環(huán)氧化途徑均可催化吲哚合成靛藍(lán)?；蚬こ碳夹g(shù)和分子進(jìn)化技術(shù)可以獲得一些轉(zhuǎn)化率高、純度高的酶，但是由于底物吲哚在水中的溶解度低、對(duì)微生物的毒性以及對(duì)催化法反應(yīng)的抑制作用等原因，終產(chǎn)物靛藍(lán)的濃度始終維持在較低水平，與工業(yè)化生產(chǎn)有一定的距離。

固定化細(xì)胞技術(shù)使得生物催化劑可以重復(fù)利用，提高了轉(zhuǎn)化效率。通過包埋、交聯(lián)、吸附等手段，固定化技術(shù)將游離的微生物細(xì)胞固定于載體孔徑之間，有利于產(chǎn)物的分離，提高了生物轉(zhuǎn)化的穩(wěn)定性[4]。固定化細(xì)胞轉(zhuǎn)化靛藍(lán)的報(bào)道，目前有兩例：陸悅飛[5]利用中空海藻酸鈉微膠囊固定重組P450 BM3工程菌制備靛藍(lán)，取得了30mg/L培養(yǎng)基的靛藍(lán)產(chǎn)出，得率45.56%。曲媛媛等[6]將固定化技術(shù)與兩相反應(yīng)體系相結(jié)合，既可以使水相中的吲哚保持在一個(gè)適宜的濃度，也可以將產(chǎn)生的靛藍(lán)萃取出來。這不僅降低了吲哚的毒害作用和終產(chǎn)物的反饋抑制，還有利于靛藍(lán)的分離和純化。目前靛藍(lán)生物合成產(chǎn)業(yè)化最大的瓶頸之一，是底物的溶解性低，轉(zhuǎn)化得到的靛藍(lán)終濃度也不高，產(chǎn)量上受到很大的限制。固定化細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)的優(yōu)點(diǎn)，在于完成一次催化過程后，可以及時(shí)和產(chǎn)物分開，再進(jìn)入下一輪催化過程，這樣生物催化劑得到反復(fù)利用，提高了重組細(xì)胞的催化效率，靛藍(lán)的累積產(chǎn)量也得以增加。影響重組菌轉(zhuǎn)化吲哚合成靛藍(lán)效率的因素有很多，如：工程菌FMO誘導(dǎo)表達(dá)的條件、固定化條件、固定化顆粒的理化性質(zhì)、轉(zhuǎn)化過程中底物的濃度、時(shí)間、pH、溫度、輔助因子的再生等。黃素單加氧酶(flavin-containing monooxygenase, FMO)是轉(zhuǎn)化靛藍(lán)的一個(gè)重要的酶種，其工藝研究僅限于游離細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。本文僅對(duì)表達(dá)黃素單加氧酶的重組工程菌E.coliBL21(pET28a-fmo)的固定化條件進(jìn)行了研究。

1　實(shí)　驗(yàn)

1.1材料

1.1.1菌種

工程菌E.coliBL21(pET28a-fmo)菌株，攜帶黃素單加氧酶表達(dá)質(zhì)粒，由東南大學(xué)生物工程實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨 10，酵母抽提物 5，NaCl 10。

1.1.3 試劑

無水氯化鈣、氯化鉀、硼酸、吲哚、正辛烷、己二胺、戊二醛、反丁烯二酸、N,N-二甲基甲酰胺等均為國產(chǎn)分析純?cè)噭?。Tris-HCl(0.05 M, pH 7.0)緩沖液、磷酸鹽緩沖液(0.1 M, pH 7.4)、異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)、卡拉膠、明膠、海藻酸鈉、聚乙烯醇等購自南京生興生物技術(shù)有限公司。

吲哚顯色劑：準(zhǔn)確稱取3.725g對(duì)二甲氨基苯甲醛，溶于47.4mL無水乙醇中，再加入2.6mL 98%濃硫酸，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2方法

1.2.1 重組大腸桿菌細(xì)胞的培養(yǎng)和制備

培養(yǎng)方法見文獻(xiàn)[7]。挑取工程菌E.coliBL21(pET28a-fmo)單菌落于3mL LB液體培養(yǎng)基(含卡那霉素50μg/mL，下同)中，于37 ℃、200 r/min震蕩培養(yǎng)過夜，將過夜培養(yǎng)物1 mL轉(zhuǎn)移至100 mL液體LB培養(yǎng)基中，于37 ℃、200 r/min下振蕩培養(yǎng)至OD600值為0.6～0.8，加入IPTG至終濃度0.2 mmol/L，溫度調(diào)節(jié)到30 ℃，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，離心收集菌體，并用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液清洗，于3 000 r/min、4 ℃離心3 min，洗滌，稱重，每1 g濕菌體加5 mL緩沖液重懸制備菌懸液，備用。

1.2.2重組大腸桿菌的固定化

分別采用以下四種不同包埋方法固定重組大腸桿菌細(xì)胞，并以此為生物催化劑，按照1.2.4對(duì)吲哚溶液進(jìn)行轉(zhuǎn)化。固定后測(cè)定靛藍(lán)轉(zhuǎn)化效率時(shí)，在底物濃度、反應(yīng)濃度、pH等反應(yīng)條件相同下，檢測(cè)不同固定化材料制備的重組大腸桿菌對(duì)吲哚的轉(zhuǎn)化效率。

固定化方法參考文獻(xiàn)[8]，略有改動(dòng)，具體操作如下。

卡拉膠包埋法：用生理鹽水配制5%卡拉膠溶液，取15 mL卡拉膠溶液與制備好的菌懸液5 mL(含1 g濕菌體，下同)混合，用注射針頭將混合液滴入15 ℃、0.3 mol/L的KCl溶液，形成的顆粒在KCl溶液中浸泡0.5 h后，轉(zhuǎn)移到85 mmol/L己二胺溶液，5 ℃下?lián)u動(dòng)10 min，加入0.3 mol/L戊二醛溶液，5 ℃下?lián)u動(dòng)30 min，再用0.3 mol/L的KCl溶液洗滌，放入1.0 mol/L的反丁烯二酸溶液，37 ℃下活化。

明膠包埋法：配制10%的明膠溶液，取15 mL冷卻至室溫，加入前面制備好的菌懸液5 mL，充分混合后倒入平板，凝固后切塊，稱重，加入0.5%戊二醛溶液交聯(lián)2h，洗滌，去除多余的戊二醛。

聚乙烯醇包埋法：聚乙烯醇溶于熱水制備10%PVA溶液，取15 mL與5 mL制備好的菌懸液混合均勺，將混合液倒入已滅菌的培養(yǎng)皿中，緩慢加入飽和硼酸溶液，浸泡6h，濾出固定化顆粒，用生理鹽水洗凈，備用。

海藻酸鈉包埋法：海藻酸鈉加熱溶于水制備成2%溶液，取15 mL與制備好的5 mL菌懸液混合，用注射器針管將混合液滴入3%CaCl2溶液中，4 ℃放置10 h，濾出顆粒，用生理鹽水洗凈，備用。

1.2.3海藻酸鈉包埋條件的的選擇

按照1.2.2中“海藻酸鈉包埋法”以及1.2.4中“固定化細(xì)胞對(duì)吲哚的轉(zhuǎn)化”的方法，通過其它條件不變時(shí)，分別比較不同海藻酸鈉濃度、CaCl2濃度、鈣化時(shí)間以及包埋菌體濃度對(duì)靛藍(lán)轉(zhuǎn)化的影響。

1.2.4固定化細(xì)胞對(duì)吲哚的轉(zhuǎn)化

將按上述固定化方法制備的固定化大腸桿菌細(xì)胞(均含1 g濕菌體)放入50 mL Tris-HCl (0.05M, pH7.4)緩沖液中，加入吲哚至最終濃度為50 mg/L，35 ℃、200 r/min下?lián)u瓶培養(yǎng)16 h，按照1.2.6用比色法對(duì)靛藍(lán)進(jìn)行定量分析。

1.2.5固定化細(xì)胞熱穩(wěn)定性與操作穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)：按照1.2.4中“固定化細(xì)胞對(duì)吲哚的轉(zhuǎn)化”的方法，逐步升高反應(yīng)溫度進(jìn)行吲哚轉(zhuǎn)化，計(jì)算每一反應(yīng)溫度下的靛藍(lán)轉(zhuǎn)化率。

操作穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)：按照1.2.4中“固定化細(xì)胞對(duì)吲哚的轉(zhuǎn)化”的方法，進(jìn)行吲哚轉(zhuǎn)化。第一次反應(yīng)結(jié)束后，離心收集固定化顆粒，測(cè)定反應(yīng)體系中靛藍(lán)轉(zhuǎn)化率。使用Tris-HCl (0.05M, pH7.4)緩沖液洗滌顆粒3次，再加入反應(yīng)液進(jìn)行下一輪轉(zhuǎn)化反應(yīng)。如此反復(fù)，計(jì)算每一批次的靛藍(lán)轉(zhuǎn)化率。

1.2.6靛藍(lán)和吲哚的定量分析

靛藍(lán)和吲哚的定量分析均采用比色法[9-12]。

靛藍(lán)分析：取轉(zhuǎn)化液5mL，于12 000 r/min離心5 min，上清部分用于吲哚分析，沉淀部分用于靛藍(lán)分析。沉淀用重蒸水洗兩遍，再用2 mL N,N-二甲基甲酰胺溶解，再離心，取上清液于610 nm處測(cè)定吸光值，和標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)照即得到靛藍(lán)濃度。

吲哚分析：取上清液2.0 mL，加入吲哚顯色劑2.0 mL，加水定容至5 mL，沸水浴10 min，冷卻后加水定容至10 mL，于568 nm波長下測(cè)吸光值，和標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)照即得到吲哚濃度。

靛藍(lán)轉(zhuǎn)化率的計(jì)算[13]，靛藍(lán)和吲哚的濃度單位均為mg/L。轉(zhuǎn)化率(%)=[靛藍(lán)濃度/(吲哚初始濃度-吲哚最終濃度)]×100.

2　結(jié)果與討論

2.1固定化載體的選擇

采用的4種固定化方法均含有1g重組大腸桿菌濕菌的細(xì)胞，以此為生物催化劑，按方法1.2.4對(duì)吲哚溶液進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化。固定后測(cè)定靛藍(lán)轉(zhuǎn)化效率時(shí)，在底物濃度和反應(yīng)濃度、pH等反應(yīng)條件相同下，檢測(cè)等量重組細(xì)胞在4種固定化載體中的轉(zhuǎn)化得率，結(jié)果如表1所示。

表1　不同載體制備的固定化細(xì)胞轉(zhuǎn)化吲哚的效率

聚乙烯醇有一定的細(xì)胞毒性，這也許是其轉(zhuǎn)化率較低的原因。同時(shí)，聚乙烯醇凝膠、卡拉膠和明膠網(wǎng)格較緊密，擴(kuò)散性能降低，影響了底物分子的傳質(zhì)過程，導(dǎo)致其催化活性降低。海藻酸鈉具有對(duì)微生物毒性小、固定化細(xì)胞密度高等優(yōu)點(diǎn)，從實(shí)際效果來看海藻酸鈉的固定化轉(zhuǎn)化率也最高。

2.2海藻酸鈉固定化條件的選擇

2.2.1海藻酸鈉濃度的影響

海藻酸鈉的濃度對(duì)靛藍(lán)轉(zhuǎn)換的影響結(jié)果如圖1所示。

圖1　海藻酸鈣的濃度對(duì)靛藍(lán)轉(zhuǎn)換的影響

海藻酸鈉的濃度直接影響固定化細(xì)胞的機(jī)械強(qiáng)度，同時(shí)也是底物擴(kuò)散的影響因子。隨著海藻酸鈉濃度的升高，顆粒的機(jī)械強(qiáng)度增加，固定化顆粒的破損率減少。但海藻酸鈉的濃度超過2%后，凝膠網(wǎng)格空隙變小，產(chǎn)物進(jìn)入和底物擴(kuò)散的阻力都增加，也會(huì)影響到微生物的轉(zhuǎn)化效率。

2.2.2 CaCl2濃度的影響

CaCl2濃度對(duì)靛藍(lán)轉(zhuǎn)化率的影響，如圖2所示。當(dāng)CaCl2濃度為2%時(shí)，可以得到較高的轉(zhuǎn)化率。

圖2　CaCl2濃度對(duì)固定化效果的影響

海藻酸鈉不能形成熱可逆性凝膠，通常是在其溶液中加入Ca2+等二價(jià)離子，通過Ca2+取代Na+來形成凝膠網(wǎng)絡(luò)，CaCl2濃度對(duì)固定化細(xì)胞的機(jī)械強(qiáng)度有直接影響。當(dāng)CaCl2濃度較低時(shí)，固定化細(xì)胞顆粒的機(jī)械強(qiáng)度低，穩(wěn)定性差，易膨脹破裂，導(dǎo)致其轉(zhuǎn)化效果偏低；隨著CaCl2濃度的增大，則會(huì)導(dǎo)致局部凝膠化，形成不連續(xù)的凝膠結(jié)構(gòu)，降低擴(kuò)散性能，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化效率降低。也可能由于鹽的滲析作用，引起細(xì)胞脫水，致使部分微生物活性喪失。綜合的結(jié)果是CaCl2濃度為2%時(shí)制備的固定化顆粒轉(zhuǎn)化率較高。

2.2.3鈣化時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響

鈣化時(shí)間對(duì)固定化細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率的影響如圖3所示。

圖3　鈣化時(shí)間對(duì)靛藍(lán)轉(zhuǎn)化效率的影響

鈣化時(shí)間較短時(shí)，外層凝膠網(wǎng)格過于稀疏，固定化顆粒外層鈣化膜稀薄，強(qiáng)度低，重組細(xì)胞吸水膨脹易破裂，導(dǎo)致催化活力不高。隨著鈣化時(shí)間的延長，固定化顆粒的機(jī)械強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，靛藍(lán)的轉(zhuǎn)化效率也不斷提高，并在8h達(dá)到最大值。但進(jìn)一步延長鈣化時(shí)間，固定化顆粒外層鈣化膜致密，不利于重組細(xì)胞對(duì)底物的吸收，也不利于產(chǎn)物的擴(kuò)散，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化率降低。因此，鈣化時(shí)間8 h較為合適。

2.2.4包埋菌體濃度對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響

包埋菌體濃度對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響如表2所示。

表2　包埋菌體濃度對(duì)靛藍(lán)轉(zhuǎn)化效率的影響

一般而言，固定化顆粒的催化能力和包埋的微生物細(xì)胞數(shù)量成正比，但固定化顆粒的機(jī)械強(qiáng)度卻與包埋的微生物細(xì)胞數(shù)量成反比。包埋的細(xì)胞數(shù)量增加，也會(huì)導(dǎo)致顆粒低破損率即菌體的損失增加，進(jìn)而降低催化活力。從轉(zhuǎn)化的效果看，50 g/mL為最適菌體包埋量。

2.3固定化細(xì)胞催化吲哚轉(zhuǎn)化靛藍(lán)

按以上最優(yōu)條件，即海藻酸鈉濃度2.0%，CaCl2濃度2.0%，固定化時(shí)間8 h，細(xì)胞包埋量50 g/L，制備的固定化細(xì)胞。將固定化的大腸桿菌細(xì)胞放入Tris-HCl(pH7.4)緩沖液中，加入吲哚至最終濃度為50 mg/L，35 ℃、200 r/min下?lián)u瓶培養(yǎng)16 h，

比色法分析靛藍(lán)濃度，計(jì)算出最后的的轉(zhuǎn)化率為58.6%。

2.4固定化細(xì)胞的熱穩(wěn)定性

細(xì)胞經(jīng)固定化后對(duì)溫度穩(wěn)定性的變化如圖4所示。

圖4　固定化細(xì)胞的熱穩(wěn)定性

由圖4可知，在40 ℃以下，游離細(xì)胞和固定化細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效果無顯著差別。溫度升至45℃時(shí)，游離細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率迅速降低，溫度升至55℃時(shí)，游離細(xì)胞幾乎完全失活，而固定化還10%左右的轉(zhuǎn)化效率，海藻酸鈉固定化細(xì)胞有效提高了菌體的溫度穩(wěn)定性。

2.5固定化細(xì)胞的操作穩(wěn)定性

固定化細(xì)胞和游離細(xì)胞重復(fù)利用過程中細(xì)胞催化活力均會(huì)逐漸下降，用該重復(fù)批次的轉(zhuǎn)化率和第1次轉(zhuǎn)化率的比值來衡量各自的操作穩(wěn)定性，結(jié)果如表3所示。

表3　固定化細(xì)胞的操作穩(wěn)定性

當(dāng)重復(fù)利用到第6批時(shí)，游離細(xì)胞已經(jīng)基本沒有檢測(cè)到轉(zhuǎn)化活性，而固定化細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率為初始轉(zhuǎn)化率的57.8%。固定化細(xì)胞重復(fù)利用到第8批時(shí)，仍有相對(duì)初始的29.5%活力。固定化細(xì)胞顆粒容易回收，菌體損失少，鈣化膜也可以降低底物的毒害，這都提高了固定化顆粒的操作穩(wěn)定性。

3　結(jié)　論

本文以海藻酸鈉為載體，研究其固定化細(xì)胞的最優(yōu)條件為：海藻酸鈉濃度2.0%，CaCl2濃度2.0%，固定化時(shí)間8 h，細(xì)胞包埋量50 g/L；且固定化后顆粒具有較好的熱穩(wěn)定性和操作穩(wěn)定性，轉(zhuǎn)化吲哚為靛藍(lán)的轉(zhuǎn)化率為58.6%，在靛藍(lán)生物合成工業(yè)化過程中具有重要作用。

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(責(zé)任編輯： 許惠兒)

Biosynthesis of Indigo Catalyzed by Immobilized RecombinantE.coli

CHENGDandan1,XUTianhong2,WANGShu3,ZHAOYuting3,XIAOQiming2*

(1.School of Life Science, Zhejiang Sci-Tech University, Hangzhou 310018,China; 2. Nanjing No.29 High School, Nanjing 210036, China;3.School of Medical Science, Southeast University, Nanjing 210009, China)

In order to enhance the indigo conversion rate in recombinant bacteriaE.coliBL21 (pET28a-fmo) of a flavin-containing monooxygenase (FMO, E.C.1.14.13.8), the immobilization of recombinant bacteria is studied by means of embedding method. The conventional immobilization method is used and the recombinantE.coliis embedded by carrageenan, gelatin, polyvinyl alcohol and sodium alginate respectively to analyze their indigo conversion effets respectively It is determined that sodium alginate is a good carrier for immobilization. Then, the immobilized conditions of sodium alginate are studied. The results show that the optimal operating conditions are: 2.0 % of the concentration of sodium alginate, 2.0 % of CaCl2concentration, 8h of immobilization time, 50 g/L of quantity of embedded cells. The indigo conversion rate of immobilized cells prepared with this method is 58.6%; after immobilization, the heat resistance of recombinantE.coliis significantly improved and such recombinantE.colihas good operational stability. The conversion rate of the 8threpeated catalization is 29.5% of the first time. It indicates that the immobilized cell conversion method really enhances the efficiency of converting indole to synthesizing indigo by recombinant cells.

recombinantE.coli; immobilization; biosynthesis; indigo

10.3969/j.issn.1673-3851.2016.05.020

2015-11-16

國家重大新藥創(chuàng)制項(xiàng)目(2012ZX09102301-009)

程丹丹(1990-)，女，浙江湖州人，碩士研究生，主要從事生物制藥方面的研究。

肖其敏，E-mail：xiao_qimin@126.com

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1673- 3851 (2016) 03- 0439- 05 引用頁碼： 050702