鐘云平，姚晨雪， 宋國龍，賴　文，陳　岑，解純剛，孔祥東

(浙江理工大學(xué)，a. 生命科學(xué)學(xué)院；b. 材料與紡織學(xué)院，杭州 310018)

?

納米羥基磷灰石攜載lefty-1基因?qū)θ巳橄侔┘?xì)胞的殺傷效應(yīng)

鐘云平a，姚晨雪a， 宋國龍a，賴文b，陳岑a，解純剛a，孔祥東a

(浙江理工大學(xué)，a. 生命科學(xué)學(xué)院；b. 材料與紡織學(xué)院，杭州 310018)

采用聚乙烯亞胺為調(diào)控劑，氯化鈣和磷酸氫二鈉為原料，共沉淀法合成一種長梭狀納米羥基磷灰石。通過場發(fā)射掃描電鏡、X射線粉末衍射、紅外吸收光譜和熱重分析儀對材料性能進(jìn)行表征。體外降解實(shí)驗(yàn)表明羥基磷灰石顆粒具有可降解性，在弱酸性條件下更容易降解，具有pH值響應(yīng)性。顆粒與質(zhì)粒DNA體外負(fù)載曲線及基因釋放曲線結(jié)果表明，長梭狀羥基磷灰石顆粒能夠有效地?cái)y載并且表現(xiàn)對質(zhì)粒DNA的持續(xù)釋放。體外轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)證實(shí)顆粒攜載pEGFP-C1-lefty-1質(zhì)粒后在細(xì)胞中成功表達(dá)綠色熒光蛋白。MTT結(jié)果表明所制備的羥基磷灰石顆粒對人乳腺上皮細(xì)胞表現(xiàn)極低的細(xì)胞毒性，具有良好的生物相容性，攜載pEGFP-C1-lefty-1質(zhì)粒后對人乳腺癌細(xì)胞具有良好的殺傷效果。

羥基磷灰石；lefty-1；人乳腺癌細(xì)胞；殺傷效應(yīng)；聚乙烯亞胺

0　引　言

羥基磷灰石(hydroxyapatite, HAp)是人體骨骼和牙齒的主要無機(jī)成分，具有良好的生物相容性而不會引起機(jī)體的免疫反應(yīng)[1]。通過某些蛋白質(zhì)，例如絲素蛋白等調(diào)控合成納米HAp[2-3]，負(fù)載藥物時具有負(fù)載率高、緩釋性好等藥物載體性能[4]；作為基因載體，納米HAp具有生物可降解性、易于實(shí)現(xiàn)靶向性和保護(hù)DNA等的優(yōu)勢[5-6]。通常質(zhì)粒DNA進(jìn)入細(xì)胞后很快被核酸酶消化降解，但HAp顆粒有保護(hù)DNA功能，能夠與質(zhì)粒DNA形成致密的結(jié)構(gòu)，使質(zhì)粒DNA不被核酸酶消化降解[7]。HAp顆粒的表面電荷和粒徑是影響轉(zhuǎn)染效率的重要因素[8-9]。Chen等[10]用12-氨基十二烷酸對顆粒進(jìn)行修飾使其表面帶有正電荷，轉(zhuǎn)染成骨細(xì)胞時發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染效率明顯提高。Gao等[11]發(fā)現(xiàn)粒徑小于40 nm的顆粒，由于細(xì)胞直接吞噬作用，其轉(zhuǎn)染效率有了明顯的提高。采用聚乙烯亞胺(PEI)對HAp顆粒進(jìn)行表面修飾，可提高其攜載質(zhì)粒DNA的能力[12]和轉(zhuǎn)染效率[13]。Murankami等[14]在HAp顆粒表面包裹上PEI涂層，發(fā)現(xiàn)顆粒對ADP、AMP和ATP的吸附力明顯提高。Peng等[15]以聚乙二醇(PEG)和PEI為調(diào)控劑，共沉淀法合成一種PEG-PEI/Fe3O4磁性納米顆粒，發(fā)現(xiàn)對質(zhì)粒DNA具有高負(fù)載效率。

乳腺癌的發(fā)病率近年來不斷提高，2013年美國乳腺癌的新發(fā)病例達(dá)到了23萬例[16]；在中國乳腺癌的年齡標(biāo)化發(fā)病率(ASR)為21.6例/10萬人，并且新發(fā)病增長率是世界水平的2倍[17]。乳腺癌的發(fā)生是一個多因素、多基因參與的過程。Strizz等[18]發(fā)現(xiàn)乳腺癌中Nodal蛋白的表達(dá)量增加。Kirsammer等[19]發(fā)現(xiàn)Nodal信號在乳腺癌中呈高水平表達(dá)，通過激活ERK信號，促進(jìn)腫瘤的浸潤性和轉(zhuǎn)移性。Lefty基因表達(dá)的lefty蛋白由lefty-1和lefty-2蛋白組成[20]，在腫瘤組織中呈極低水平表達(dá)；研究證明兩種蛋白均抑制Nodal信號通路[21-22]，促進(jìn)惡性腫瘤細(xì)胞的凋亡，顯示出抗腫瘤活性。

本文通過采用氯化鈣和磷酸氫二鈉為原料、PEI為調(diào)控劑，通過共沉淀法合成出一種納米HAp顆粒，研究其攜載lefty-1基因后對人乳腺癌細(xì)胞的殺傷效應(yīng)。

1　材料與表征方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料與儀器

材料：聚乙烯亞胺、氯化鈣(CaCl2)和磷酸氫二鈉(Na2HPO4)購自于sigma公司，pEGFP-C1-lefty-1質(zhì)粒由上海捷瑞生物工程有限公司合成，無水乙醇為市售分析純，去離子水由Milipore純水儀制備。

儀器：Nicolet 5700傅立葉變換紅外光譜儀(Thermo Electron公司)，ARL-X’TRA型X-射線粉末衍射儀(美國熱高公司)，ZEISS-ULTRA55場發(fā)射掃描電鏡(日本Hitachi公司)，Pyris 1 TGA熱重分析儀(美國鉑金-埃爾默公司)，集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(杭州惠創(chuàng)儀器設(shè)備有限公司)，ELx 800酶標(biāo)儀(BioTek公司)，Nanodrop 2000(Thermo公司)，INTEGRA真空安全吸液器(VACUSAFE公司)。

1.2P-HAp顆粒的合成

P-HAp顆粒的制備方法按照以下步驟：

a) 分別配制0.1 mM的CaCl2、Na2HPO4溶液和0.1 mM的PEI水溶液；

b) 在30 mL Na2HPO4溶液中加入210 mL去離子水，200 r/min勻速攪拌10min，反應(yīng)在70 ℃集熱式恒溫加熱磁力攪拌器里進(jìn)行；

c) 加入10 mL PEI水溶液，用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值為10，200 r/min攪拌30 min；

d) 滴加50 mL CaCl2溶液，速度為20滴/min，滴加過程中調(diào)節(jié)反應(yīng)溫度、攪拌速度，pH值保持不變；

e) 滴加完畢后，繼續(xù)攪拌反應(yīng)4 h，將反應(yīng)完成后的顆粒8 000 r/min沉淀離心收集，再用去離子水和無水乙醇分別洗滌3次；

f) 將離心后得到的沉淀以兩種方式保存，一種保存在無水乙醇溶液中，以備后續(xù)的FE-SEM等測試；另一種60 ℃恒溫干燥箱中干燥48 h后收集，以備后續(xù)的FT-IR，XRD，TGA等測試；將合成的顆粒記為P-HAp。

1.3P-HAp顆粒的表征測試

1.3.1場發(fā)射掃描電鏡(FE-SEM)

將保存在無水乙醇中的P-HAp顆粒超聲分散后滴加一滴至清洗干凈的硅片表面，待無水乙醇揮發(fā)后將硅片粘貼到導(dǎo)電膠上，采用FE-SEM(加速電壓為3.0 kV)對顆粒形貌進(jìn)行觀察。

1.3.2X射線粉末衍射儀(XRD)

將干燥后的P-HAp顆粒研磨成粉末狀，均勻地置于載玻片表面，采用X-射線粉末衍射儀(管電壓40 kV，管電流35 mA，掃描速度為5 °/min，掃描范圍2θ=10°～60°)進(jìn)行物相和結(jié)晶性能分析。

1.3.3紅外吸收光譜儀(FT-IR)

采用溴化鉀壓片法，將干燥后的P-HAp顆粒研磨成粉末與溴化鉀混合，質(zhì)量比約為1∶100，充分研磨后將混合物進(jìn)行壓片(30 MPa，45s)。利用傅立葉變換紅外光譜儀(掃描范圍為4500～400 cm-1)對樣品進(jìn)行分析。

1.3.4熱重分析儀(TGA)

將干燥后的P-HAp顆粒研磨成粉末狀，采用熱重分析儀(加熱速度10℃/min，升溫范圍為20～800℃)對水分和有機(jī)物含量進(jìn)行分析。

1.4P-HAp顆粒體外降解實(shí)驗(yàn)

1.4.1P-HAp顆粒的降解

將磷酸鹽緩沖液(PBS溶液)設(shè)置4個不同pH值，pH值分別為4.5、5.6、6.5和7.4。將50 mg P-HAp顆粒重懸于10 mL的PBS溶液中，使P-HAp懸液濃度達(dá)到5 mg/mL。4組顆粒懸液放置在水浴恒溫振蕩器中，振蕩速率為120 r/min，溫度為37℃；分別在降解1、3、5、7、14、21、28、35、42、49、56、63、70、77、84 d和91d后，10 000 r/min離心5 min收集上清液，并重新補(bǔ)足10 mL PBS溶液，振蕩重懸，繼續(xù)降解。

1.4.2鈣離子濃度測定方法

鈣離子濃度測定操作方法參照鈣離子濃度試劑盒(DICA-500，Bioassay Systems)，取5 μL樣品加入到96孔板中，加入200 μL工作液，充分混合，室溫孵育3 min，用酶標(biāo)儀讀取OD 612 nm的值，對照鈣離子濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出對應(yīng)的鈣離子濃度，最后計(jì)算出P-HAp顆粒的降解百分比。

1.5P-HAp顆粒與pEGFP-C1-lefty-1質(zhì)粒負(fù)載曲線

將干燥后的P-HAp顆粒于超凈工作臺紫外滅菌24 h后，配制濃度為0.1、0.5、1、5、10 mg/mL的懸液，并室溫下30 kHz的頻率超聲5 min。將100 μg pEGFP-C1-lefty-1質(zhì)粒加入到200 μL不同濃度的P-HAp懸液，混合均勻后，37℃水浴條件下孵育2 h；將形成的P-HAp-pEGFP-C1-lefty-1復(fù)合物4℃條件下10 000 r/min離心5 min，收集上清液，Nanodrop 2000測量上清液中DNA濃度，計(jì)算出不同濃度P-HAp懸液對pEGFP-C1-lefty-1質(zhì)粒的負(fù)載效率。

1.6P-HAp-pEGFP-C1-lefty-1的基因釋放曲線

按照步驟1.5取1 mg/mL P-HAp懸液組，離心吸取上清液后，在沉淀中分別加入200 μL pH值為5.6和7.4的PBS溶液，置于37℃水浴條件下，分別在0.5、1 、2 、12、24 、48 、72、96 、120、144 、168 h后吸取5 μL上清液，同時補(bǔ)足等量的PBS。Nanodrop 2000測量上清液中DNA濃度，計(jì)算出在不同時間段質(zhì)粒DNA釋放百分比。

1.7P-HAp-pEGFP-C1體外轉(zhuǎn)染細(xì)胞

在2 mL無血清DMEM培養(yǎng)基中加入25 μL 1 mol/L的CaCl2溶液，使培養(yǎng)基中的Ca2+濃度達(dá)到10 m mol/L，再分別加入500 μL 400 μg/μL質(zhì)粒DNA和200 μL 1 mg/mL的HAp懸液，混合均勻置于37℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育20 min后備用。將處于對數(shù)生長期的MCF-7細(xì)胞(人乳腺癌細(xì)胞株)和MDA-MB-231細(xì)胞(人乳腺癌細(xì)胞株)，以每孔2×104個細(xì)胞的密度接種24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入1 mL培養(yǎng)基，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，將配置好p-HAp-pEGFP-C1-lefty-1復(fù)合物加入到24孔板中，每孔加入200 μL，繼續(xù)培養(yǎng)48 h和72 h后熒光倒置顯微鏡觀察并拍照。

1.8P-HAp顆粒生物相容性

將處于對數(shù)生長期的Hs 578bst細(xì)胞(人乳腺上皮細(xì)胞株)以每孔5 000個細(xì)胞的密度鋪于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，將96孔板置于細(xì)胞培養(yǎng)箱下培養(yǎng)24 h后，每孔加入10 μL不同濃度梯度的P-HAp懸液，在分別培養(yǎng)24 、48 、72 h后，每孔加入20 μL 5 mg/mL的MTT(3-(4, 5-二甲基噻唑-2)-2, 5-二苯基四氮唑溴鹽)溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后用真空安全吸液器吸去培養(yǎng)液，每孔加入150 μL二甲基亞砜溶液(DMSO)，平板振蕩器上振蕩10 min后，酶標(biāo)儀OD 490 nm處讀取各孔的吸光值，按照公式：

細(xì)胞生存率= (OD實(shí)驗(yàn)組-OD調(diào)零孔)/(OD對照組-OD調(diào)零孔)×100%

(1)

計(jì)算出細(xì)胞生存率，以顆粒濃度為橫坐標(biāo)、細(xì)胞生存率為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長活力圖。

1.9P-HAp-pEGFP-C1-lefty-1對乳腺癌細(xì)胞的殺

傷效應(yīng)

將處于對數(shù)生長期的MCF-7、MDA-MB-231和Hs 578bst細(xì)胞鋪于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，細(xì)胞密度為5 000個每孔；將96孔板置于細(xì)胞培養(yǎng)箱下培養(yǎng)24 h后，每孔加入20 μL P-HAp-pEGFP-C1-lefty-1復(fù)合物，分別培養(yǎng)24 、48 、72 h后，每孔加入20 μL 5 mg/mL的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后用真空安全吸液器吸去培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO溶液，平板振蕩器上振蕩10 min后，酶標(biāo)儀OD 490 nm處測量各孔的吸光值，按照步驟1.8中的公式計(jì)算出細(xì)胞生存率。

2　實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1P-HAp顆粒的表征

圖1為P-HAp顆粒在的場發(fā)射掃描電鏡圖。從圖中可以觀察到，所合成的P-HAp顆粒形貌呈兩端細(xì)長，中間較粗的長梭狀結(jié)構(gòu)；顆粒長度為300～400 nm，中間長度為30～40 nm，顆粒的分散性好，粒徑大小比較均勻。

圖1　P-HAp顆粒場發(fā)射掃描電鏡照片

圖2(a)為P-HAp顆粒的X射線粉末衍圖。通過與HAp的標(biāo)準(zhǔn)粉末衍射數(shù)據(jù)(JCPDS#9-432)進(jìn)行衍射峰對比分析，制備的P-HAp顆粒主要晶型為羥基磷灰石。

圖2(c)為P-HAp顆粒的X射線能譜圖(EDS)。從圖中可以觀察到，鈣、磷和氧元素都被檢測出來，這與羥基磷灰石的元素組成相符合；少量鈉元素被檢測出來，說明合成原料磷酸氫二鈉有殘留；碳元素也被檢測出來，說明合成過程中空氣中的CO2參與的反應(yīng)，生成了部分的CaCO3沉淀。

圖2(d)為P-HAp顆粒的熱重分析結(jié)果。圖中曲線表明P-HAp顆粒熱失重分為兩步，第一步是150℃以下質(zhì)量比為2.55%的熱失重，其原因是結(jié)合水的失去；第二步為150～600℃質(zhì)量比為8.96%的熱失重，其原因是有機(jī)物PEI的分解，說明所合成的P-HAp顆粒中有機(jī)物PEI的含量為8.96%。

圖2　P-HAp顆粒材料性能表征結(jié)果

2.2P-HAp顆粒的體外降解曲線

P-HAp顆粒體外降解曲線選取降解天數(shù)為橫坐標(biāo)，降解百分比為縱坐標(biāo)，如圖3所示。在pH值為 4.5的PBS溶液中，P-HAp顆粒降解速度最快，降解百分比最大，降解91 d后，其降解百分比達(dá)到56.7%；隨著pH值的增大，顆粒的降解速度逐漸變小，降解百分比也變??；在pH值為5.6的條件下，91 d后顆粒的降解百分比達(dá)到40.6%；而在pH值為6.5和7.4的條件下，91 d后顆粒的降解百分比分別為28.5%和18.2%，表明P-HAp顆粒的體外降解具有pH值響應(yīng)性。從生物安全性和惡性腫瘤酸性微環(huán)境這兩點(diǎn)考慮，HAp顆粒在弱酸性pH值下緩慢降解性這一特征，為其作為緩釋性基因載體提供基礎(chǔ)依據(jù)。

2.3P-HAp與pEGFP-C1-lefty-1質(zhì)粒體外負(fù)載曲線

圖4為P-HAp與pEGFP-C1-lefty-1質(zhì)粒的體外負(fù)載曲線。從圖4中可以觀察到，隨著P-HAp懸液濃度的增加，與顆粒結(jié)合的質(zhì)粒DNA的量也逐漸

a. pH=4.5，b. pH=5.6，c. pH=6.5，d. pH=7.4圖3　P-HAp顆粒體外降解曲線圖

增加；在顆粒濃度為0.1 mg/mL時，質(zhì)粒DNA結(jié)合百分比為25.9%；而當(dāng)濃度為10 mg/mL時，質(zhì)粒DNA結(jié)合百分比達(dá)到90.8%。說明經(jīng)PEI調(diào)控合成的HAp顆粒具有很好的基因負(fù)載效率，體外能夠有效地結(jié)合質(zhì)粒DNA。

圖4　P-HAp與質(zhì)粒DNA結(jié)合曲線

2.4P-HAp-pEGFP-C1-lefty-1體外基因釋放曲線

圖5為P-HAp-pEGFP-C1-lefty-1在pH值為5.6(曲線a)和7.4(曲線b)PBS溶液中體外基因釋放曲線。在pH值為5.6的條件下，前6 h內(nèi)其基因釋放量呈指數(shù)增長，6～144 h時間段里呈類線性增長，并且在144 h后達(dá)到平臺期，其最大釋放量為18.3%；在pH值為7.4的條件下，前6 h內(nèi)其基因釋放量呈指數(shù)增長，其后基因緩慢釋放，并且在96 h后達(dá)到平臺期，其最大釋放量為9.8%。說明與HAp顆粒結(jié)合的質(zhì)粒DNA在弱酸性pH值下更容易釋放，進(jìn)一步為其作為緩釋性基因載體提供基礎(chǔ)依據(jù)。

圖5　P-HAp-pEGFP-C1基因釋放曲線

2.5P-HAp-pEGFP-C1的體外轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)

圖6為P-HAp顆粒、pEGFP-C1質(zhì)粒和P-HAp-pEGFP-C1復(fù)合物的體外轉(zhuǎn)染人乳腺癌細(xì)胞(MCF-7、MDA-MB-231)48 h和72 h后的熒光圖。pEGFP-C1質(zhì)粒帶有綠色熒光蛋白基因，表達(dá)的綠色熒光蛋白在藍(lán)光激發(fā)下會發(fā)出綠色熒光。從圖6中可以觀察到，Mock組(P-HAp顆粒)由于沒有攜帶pEGFP-C1質(zhì)粒，無論是MCF-7細(xì)胞還是MDA-MB-231細(xì)胞，整個視野中都沒有檢測到綠色熒光；pEGFP-C1質(zhì)粒組對于兩種細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率都很低，在轉(zhuǎn)染48 h和72 h后，整個視野中只有極少數(shù)的細(xì)胞表達(dá)綠色熒光蛋白。圖6(a)中與pEGFP-C1組相比，P-HAp-pEGFP-C1對MCF-7細(xì)胞具有更高的轉(zhuǎn)染效率，整個視野中觀察到更多綠色熒光蛋白，這是由于PEI帶正電荷，細(xì)胞膜表面帶負(fù)電荷，這樣細(xì)胞能夠有效地吸附P-HAp-pEGFP-C1復(fù)合物，提高轉(zhuǎn)染效率，并且在轉(zhuǎn)染72 h后綠色熒光蛋白的表達(dá)量更多。但對于MDA-MB-231細(xì)胞，P-HAp-pEGFP-C1組的轉(zhuǎn)染效率沒有明顯變化。圖6(b)中與pEGFP-C1組相比，在轉(zhuǎn)染48 h和72 h后，視野中觀察到的綠色熒光蛋白量并沒有顯著的差異，仍保持著較低轉(zhuǎn)染水平。

圖6　熒光顯微鏡檢測P-HAp-pEGFP-C1轉(zhuǎn)染熒光圖

2.6P-HAp顆粒的生物相容性

圖7為P-HAp顆粒對Hs 578bst細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，P-HAp懸液的終濃度為0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1 mg/mL。隨著P-HAp懸液濃度的增加，Hs 578bst細(xì)胞的存活率并沒有顯著的變化，且細(xì)胞存活率都在80%以上。不同時間處理組(24、48 、72 h)的細(xì)胞存活率也都在80%以上，表明P-HAp顆粒對Hs 578bst細(xì)胞表現(xiàn)出極低的細(xì)胞毒性。

圖7　P-HAp生物相容性結(jié)果

2.7P-HAp-pEGFP-C1-lefty-1對乳腺癌細(xì)胞的殺

傷效應(yīng)

圖8為P-HAp-pEGFP-C1-lefty-1復(fù)合物對乳腺癌細(xì)胞的殺傷效果圖。從圖8中可以觀察到終濃度為0.1 mg/mL的P-HAp懸液對MCF-7細(xì)胞、MDA-MB-231細(xì)胞和Hs 578bst細(xì)胞均表現(xiàn)出極低細(xì)胞毒性，三種細(xì)胞的細(xì)胞存活率在培養(yǎng)24、48、72 h后也沒有顯著的變化，且都在80%以上。P-HAp顆粒攜載pEGFP-C1-lefty-1質(zhì)粒后對人乳腺癌細(xì)胞(MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞)具有較顯著殺傷效果，但對人乳腺上皮細(xì)胞(Hs 578bst細(xì)胞)不表現(xiàn)殺傷作用。對于MCF-7細(xì)胞，加入P-HAp-pEGFP-C1-lefty-1復(fù)合物后，在培養(yǎng)24 h和72 h后其細(xì)胞存活率分別為65.3%和50.4%；而對于MDA-MB-231細(xì)胞，在培養(yǎng)24 h和72 h后細(xì)胞存活率分別為72.9%和62.8%，說明P-HAp-pEGFP-C1-lefty-1的殺傷作用隨著時間的延長而增強(qiáng)，且對MCF-7細(xì)胞具有更強(qiáng)的殺傷作用，推測是P-HAp-pEGFP-C1對MCF-7細(xì)胞具有更高的轉(zhuǎn)染效率的原因。Cavallar等[23]發(fā)現(xiàn)lefty蛋白能夠有效促進(jìn)人肝癌細(xì)胞(HepG2)的凋亡。Topczewska等[24]在研究Nodal信號和惡性黑色素瘤的發(fā)生關(guān)系時，發(fā)現(xiàn)lefty蛋白能夠降低黑色素瘤細(xì)胞的浸潤性和集落形成。本實(shí)驗(yàn)研究首次證實(shí)了納米HAp顆粒攜載lefty-1基因?qū)θ橄侔┘?xì)胞的殺傷效果。

圖8　P-HAp-pEGFP-C1對人乳腺癌細(xì)胞殺傷結(jié)果

3　結(jié)論

a) 以有機(jī)物PEI為模板調(diào)控合成了主要晶型為羥基磷灰石的納米顆粒，其形貌為長梭狀，長度為300～400 nm，中間寬度為30～40 nm，顆粒分散性好，尺度均勻。

b) 合成的納米HAp顆?？捎行劫|(zhì)粒DNA，在弱酸性pH條件下可實(shí)現(xiàn)對質(zhì)粒DNA的持續(xù)釋放，具有一定的pH響應(yīng)性。

c) 納米HAp顆粒對人乳腺上皮細(xì)胞表現(xiàn)出極低的細(xì)胞毒性，具有良好的生物相容性，攜載pEGFP-C1-lefty-1質(zhì)粒后，可成功轉(zhuǎn)染人乳腺癌細(xì)胞MCF-7和MDA-MB-231，并在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)綠色熒光蛋白標(biāo)記的lefty-1蛋白，對人乳腺癌細(xì)胞的殺傷效率達(dá)到40%左右。本研究首次證明了人源lefty-1基因?qū)θ巳橄侔┘?xì)胞的殺傷效應(yīng)，納米HAp攜載lefty-1基因用于乳腺癌治療研究有望成為乳腺癌基因治療的一個新方向。

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(責(zé)任編輯：許惠兒)

Killing Effect of Nano-hydroxyapatite Loading Lefty-1 Gene on Human Breast Carcinoma Cells

ZHONGYunpinga,YAOChenxuea,SONGGuolonga,LAIWenb,CHENCena,XIEChunganga,KONGXiangdonga

(a. College of Life Sciences; b. College of Materials and Textile,Zhejiang Sci-Tech University,Hangzhou 310018, China)

In this study, the co-precipitation method had been used to synthesize a long spindle nano-hydroxyapatite by using polyethylenimine (PEI) as a regulating agent, calcium chloride and sodium hydrogen phosphate as raw materials. The material properties were characterized by using field emission scanning electron microscope (FE-SEM), X-ray powder diffraction pattern (XRD), infrared absorption spectrum (FT-IR) and thermogravimetric analysis (TGA). As indicated in the degradation experiment in vitro, HAP particles is degradable, can be degraded more easily in acidic conditions and has pH-responsiveness. The result of in vitro load curve and gene release curve of particles and plasmid DNA shows that the long spindle HAP particles can more effectively load and continuously release plasmid DNA. The results of in vitro transfection experiment indicate that green fluorescent protein was successfully expressed in cells after particles loading pEGFP-C1-lefty-1 plasmid. According to the MTT result, the prepared HAP particles show an extremely low cytotoxicity to mammary epithelial cells and a good biocompatibility. After pEGFP-C1-lefty-1 plasmid is loaded, the HAP particles has a good killing effect on human breast carcinoma cells.

hydroxyapatite; lefty-1; human breast carcinoma cell; killing effects; polyethylenimine

10.3969/j.issn.1673-3851.2016.05.022

2015-12-23

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(50942023，51272236)；浙江理工大學(xué)521人才培養(yǎng)計(jì)劃資助項(xiàng)目(1610032521302)

鐘云平(1990-)，男，浙江湖州人，碩士研究生，主要從事生物材料方面的研究。

孔祥東，E-mail：kongxiangdong@gmail.com

Q279

A

1673- 3851 (2016) 03- 0450- 08 引用頁碼： 050704