朱蓮蓮，林高強，葉聰瑩，黃　倩，劉小川

(浙江理工大學生命科學學院生物工程研究所，杭州 310018)

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水稻端粒酶RNA候選序列的鑒定

朱蓮蓮，林高強，葉聰瑩，黃倩，劉小川

(浙江理工大學生命科學學院生物工程研究所，杭州 310018)

端粒酶由端粒酶反轉(zhuǎn)錄蛋白和端粒酶RNA構(gòu)成，端粒酶RNA中除模板序列保守外，其余區(qū)域的保守度極低，難以基于同源序列實施克隆。目前，植物中僅擬南芥端粒酶RNA得到了克隆。為了鑒定一條具水稻端粒酶RNA特征的候選序列，研究中進行了對模板序列單堿基T/A突變(5′-AAACCCTAA-3′)后的轉(zhuǎn)基因愈傷組織端粒酶活性的比較，結(jié)果顯示在缺乏dATP的端粒重復序列擴增法反應(yīng)中，突變型的端粒酶活性明顯高于未突變型；對體外延伸得到的端粒ssDNA進行測序分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所測10條片段均含有突變特征序列；再對轉(zhuǎn)基因植株進行端粒序列的檢測，結(jié)果所測8個端粒序列中，有2個含有突變特征序列。因此，初步判斷該候選序列為水稻端粒酶RNA基因。

水稻；端粒酶；端粒酶RNA；TRAP；定點突變

0　引　言

真核生物端粒酶是一種依賴于RNA的DNA聚合酶，是保證染色體末端結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，維持細胞正常分裂的重要生物酶。它由端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(Telomerase reverse transcriptase，TERT)和RNA亞基(Telomerase RNA，TER)組成，不管是體內(nèi)還是體外環(huán)境[1-3]，對于端粒酶活性來說TERT和TER都是必不可少的核心組件，其中TER中含有決定端粒重復序列的一段短模板序列[4]。端粒酶以染色體3′末端為前導引物，以其自身的TER為模板合成串聯(lián)重復序列(TTTAGGG)n，TER模板區(qū)直接決定了延伸的端粒末端序列。線蟲、酵母和多種脊椎動物的端粒酶TER已經(jīng)得到了克隆，而在植物中僅報道了擬南芥端粒酶含有兩個TER形式，分別為TER1和TER2，兩者的模板序列均為5′-CTAAACCCTA-3′，其中TER1被認為是端粒重復序列的主要模板提供者[5]。分析顯示TER中除了模板區(qū)域高度保守外，其長度及序列在這些物種之間都不具相似性[6]。

目前對水稻端粒酶序列的研究已有初步進展，馬登旭通過水稻愈傷組織的端粒酶提取總RNA，接頭連接后反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，再設(shè)計多條特異性引物進行克隆，經(jīng)過分析得到了一條具有水稻TER特征的候選序列[7]；楊力媛等[8]建立了一套切實可行的水稻端粒酶RNA模板基因序列的鑒定體系。

通過對擬南芥，水稻，大麥，玉米等植物的研究發(fā)現(xiàn)，端粒酶主要分布在具有活躍細胞分裂和分化的分生組織中[9-11]，而在已分化的組織中幾乎檢測不到端粒酶活性。植物細胞具有全能性[12]，高度分化的成熟細胞可通過脫分化恢復分化能力，進而通過再分化成長為一個新植株，說明脫分化能重新激活端粒酶基因的表達。對煙草的研究發(fā)現(xiàn)，煙草葉片脫分化形成的愈傷組織中端粒酶活性比其外植體葉片有明顯提高，而再分化后形成的再生植株葉片的端粒酶活性又下降到了原始植株水平[13]，說明植物愈傷組織中有較高的端粒酶表達。本研究將正常的及模板區(qū)定點突變了的TER轉(zhuǎn)導入水稻愈傷組織，以此為實驗材料進行端粒酶活性比較等相關(guān)實驗。

端粒酶活性的檢測有多種方法，這些方法能應(yīng)用于較高端粒酶活性的動物組織的檢測，而植物組織，即便是分生組織或愈傷組織的酶活性都十分有限，目前還沒有完全適用于植物端粒酶活性的高靈敏度檢測技術(shù)。據(jù)報道，端粒酶重復序列擴增法(telomeric repeat amplification protocol，TRAP)相對靈敏度較高，其原理是首先合成一段長度約為18 nt的單鏈寡聚核苷酸作為前導引物，端粒酶結(jié)合前導引物末端的GTT并合成端粒重復序列，前導引物被延伸成為含有多個端粒重復序列的DNA單鏈，同時結(jié)合PCR擴增技術(shù)可提高檢測端粒酶活性的靈敏度[14]。其中引物的設(shè)計也是關(guān)鍵的一步，故在本研究實驗中采用TRAP法，通過設(shè)計特異的引物來進一步提高檢測的靈敏度。

本研究將對馬登旭發(fā)現(xiàn)的這條具有水稻TER特征的候選序列進行驗證，實驗采用楊力媛建立的鑒定體系，通過改變候選序列的模板區(qū)即可導致合成的端粒末端重復序列的變化，從而實現(xiàn)對候選序列的鑒定，為之后進一步研究端粒酶TER的結(jié)構(gòu)和功能奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1實驗材料與儀器

主要實驗材料有中花11號水稻(OryzasativaL.)種子、E.coliDH5α、pCambia1301、農(nóng)桿菌LBA4404。

主要儀器有高壓蒸汽滅菌鍋、超凈工作臺、植物生長培養(yǎng)箱、Bio-Rad電泳儀、SynGene凝膠成像系統(tǒng)、NANODROP 2000分光光度計、Bio-Rad電擊轉(zhuǎn)化儀。

1.2方法

1.2.1水稻愈傷組織的誘導

利用水稻中花11的成熟胚為材料誘導愈傷組織[8-15]。

1.2.2端粒酶TER候選序列的定點突變及穿梭載體的構(gòu)建

在已經(jīng)得到的一條TER候選序列基因的基礎(chǔ)上，比對水稻的全基因組，在目標序列區(qū)向上游延伸700 bp，向下游延伸500 bp，按照此序列設(shè)計一對擴增全長目的序列的引物24RNAPS1和24RNAPA1，再針對模板區(qū)設(shè)計一對定點突變引物22RNAPS2和27RNAPA2(表1)。采用三重PCR方法，將候選序列模板區(qū)的5′-AAACCCTAA-3′(Y)突變?yōu)?′-AAACCCAAA-3′(T)，從而獲得突變型序列。然后通過構(gòu)建pCambia1301-T/Y穿梭質(zhì)粒的方法[8], 將兩組基因?qū)朕r(nóng)桿菌LBA4404細胞，于—80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

表1　獲得端粒酶RNA候選序列的引物

1.2.3水稻轉(zhuǎn)基因植株的培養(yǎng)

用分別含有穿梭載體pCambl1301-T/Y的農(nóng)桿菌LBA4404侵染繼代培養(yǎng)4次的水稻愈傷組織，并對侵染后的愈傷組織進行兩次抗性篩選[8]。

分別挑取狀態(tài)良好的未突變型(Contorl，C)和突變型(Mutant，M)愈傷組織5～6顆，移入裝有分化培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，25℃，14 h光照和10 h黑暗條件下培養(yǎng)分化成苗，20 d繼代1次，待苗長至1 cm左右，移入裝有生根培養(yǎng)基的組培瓶中壯苗。分別留下一部分愈傷組織用于基因組和端粒酶的提取。

待組培瓶中的轉(zhuǎn)基因苗長至頂部時，及時開蓋，并加入適量無菌蒸餾水，煉苗3 d，期間每天換水。然后洗去苗根部的瓊脂，移栽到溫室的土缽中。7 d后將苗移至室外實驗田中。

1.2.4利用轉(zhuǎn)基因愈傷組織鑒定水稻端粒酶TER候選序列

1.2.4.1轉(zhuǎn)基因愈傷組織的鑒定

分別稱取新鮮的未突變型和突變型愈傷組織各100 mg，用試劑盒(TaKaRaMiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0)提取全基因組。以基因組為PCR模板，根據(jù)載體pCambl1301內(nèi)含的潮霉素基因序列以及插入水稻基因組的T-DNA序列設(shè)計上下游引物TUP和TDW(表2)，進行PCR驗證，并測序鑒定。

表2　鑒定抗性愈傷組織的引物

1.2.4.2端粒酶活性及酶促產(chǎn)物的檢測

參照Fitzgerald MS等報道的方法提取水稻成熟胚愈傷組織的端粒酶[16]。對未突變型和突變型愈傷組織的端粒酶蛋白進行分組實驗[17]，分別為C組、M組及相應(yīng)的對照組C-滅活組、M-滅活組，滅活組在酶促反應(yīng)前加0.5μL 10 mg/mL RNaseA，冰上放置5 min，將端粒酶進行滅活。采用Kim建立的基于PCR基礎(chǔ)上的TRAP法[18]，結(jié)合陳波等[19]設(shè)計的前導引物CHEN03(表3)和不含dATP和dCTP的dNTPs，同時進行體外酶促反應(yīng)。C組、M組在酶促反應(yīng)后加0.5μL 10 mg/mL RNaseA，冰上放置5 min，將端粒酶進行滅活。酶促反應(yīng)產(chǎn)物用氯仿抽提，醋酸鈉、乙醇沉淀純化的方法回收后，使用NANODROP 2000 spectrophotometer進行ssDNA的含量測定，并對各組進行比較分析。

通過對酶促產(chǎn)物ssDNA序列排列方式的推測，設(shè)計下游引物T3T-1(表3)，以M組的酶促產(chǎn)物為模板，CHEN03和T3T-1為引物進行TD-PCR擴增。PCR產(chǎn)物用試劑盒進行純化后裝載與pMD18-T vector并轉(zhuǎn)化大腸桿菌細胞，挑取單菌落后進行菌液PCR鑒定陽性克隆，引物為pMD18-T vector測序用的上下游引物M13-20和M13-48(表3)。并選擇合適的克隆進行測序分析，以進一步確定TER候選序列的正確性。

表3　酶促反應(yīng)及克隆鑒定的引物序列

1.2.5轉(zhuǎn)基因植株端粒的檢測

1.2.5.1轉(zhuǎn)基因植株的鑒定

分別稱取鮮嫩葉片100 mg，用試劑盒提取5個樣本的全基因組。按照轉(zhuǎn)基因愈傷組織的PCR鑒定方法，使用相同的引物和程序?qū)?個樣本進行PCR擴增，使用突變型愈傷組織基因組作為對照，進行轉(zhuǎn)基因植株的鑒定。

1.2.5.2染色體末端的檢測

隨機選取第2號染色體短臂設(shè)計上游引物02pF，下游引物為端粒重復序列P-R(表4)。分別以五個植株的基因組DNA為模板進行PCR反應(yīng)。取一部分PCR產(chǎn)物進行回收，將回收后的產(chǎn)物裝載到pMD18-T vector中用于測序檢測，以確定樣品端粒的組成。

表4　擴增端粒的引物序列

2　實驗結(jié)果

2.1水稻轉(zhuǎn)基因植株的獲取

將未突變型和突變型的抗性愈傷組織進行誘導分化，發(fā)現(xiàn)在相同的培養(yǎng)條件下，突變組出綠點率高于未突變組。取長有綠色顆粒狀組織的愈傷組織進行繼代培養(yǎng)后，突變組內(nèi)近一半組織褐變死亡，但有兩塊愈傷組織上分化出苗(圖1(a))；未突變組大部分褐變死亡，未能分化成苗。重復誘導分化實驗，出現(xiàn)相似的結(jié)果。待突變型轉(zhuǎn)基因苗長至1cm左右時，將其轉(zhuǎn)接到含有生根培養(yǎng)基的組培瓶中進行壯苗(圖1(b))，再移栽入土栽培為轉(zhuǎn)基因植株(圖1(c))。

圖1　轉(zhuǎn)基因植株誘導培養(yǎng)的不同階段

2.2轉(zhuǎn)基因愈傷組織及植株的鑒定

分別提取未突變型和突變型兩種愈傷組織，以及五個突變型轉(zhuǎn)基因植株的基因組后，經(jīng)PCR鑒定目標片段大小均在2500 bp左右，符合預(yù)期(圖2(a)-(b))，結(jié)合測序結(jié)果證明轉(zhuǎn)基因成功。

圖2　轉(zhuǎn)基因愈傷組織及植株的PCR鑒定結(jié)果注：M.Marker;c.未突變型愈傷組織基因組; m.突變型愈傷組織基因組;1～5. 轉(zhuǎn)基因植株基因組。

2.3利用轉(zhuǎn)基因愈傷組織鑒定水稻端粒酶TER候選序列

2.3.1端粒酶活性的比較

基于TRAP方法，在缺乏dATP和dCTP的體外酶促延伸反應(yīng)中，未突變型端粒酶將受到抑制或停止反應(yīng)，而突變型端粒酶則能順利延伸前導引物，增加ssDNA含量。結(jié)果顯示用100 μg未突變型和突變型的端粒酶經(jīng)體外延伸后獲得的ssDNA量(表5)，未突變型的差值應(yīng)為加入的前導引物，其與突變型組的差值為突變型端粒酶作用的結(jié)果，說明突變型愈傷組織的端粒酶，在缺乏dATP和dCTP的條件下能有效延伸前導引物，但相對于動物組織的端粒酶，它的酶活性仍不強。

表5　未突變型(C)和突變型(M)端粒酶的

2.3.2酶促產(chǎn)物的檢測

為解析延伸的ssDNA，對M組的酶促產(chǎn)物進行回收，并通過T-vector進行克隆。從獲得的23個克隆(圖3)中，選取了10個含所有不同分子量的克隆進行了測序分析，結(jié)果顯示：10個克隆中都含有或多或少的GGGTTTT重復，與突變型端粒酶RNA模板序列5′-AAACCCAAA-3′相符(表6)。

圖3　M組酶促產(chǎn)物的T克隆PCR鑒定結(jié)果　　　　　注：M.Marker;1～23.23個不同的克隆。

名稱序列(5'—3')No1…ATGATGTGCAACTCGACAACTT(G)GGGTTTTGGGGTTTGGGTTTT…-3'No3…ATGATGTGCAACTCGACAACTT(G)GGGTTTTGGGTTTTGGGTTTT…-3'No5…ATGATGTGCAACTCGACAACTT(G)GGGTTTTGGGTTTT…-3'No6…ATGATGTGCAACTCGACAACTTGGGGTTT(G)GGGTTTTGGGGTCTTGGGTTTT…-3'No7…ATGATGTGCAACTCGACAACTTGGGTTTTGGGTTTT…-3'No10…ATGATGTGCAACTCGACAACTTT(G)GGGTTTT(G)GGGTTTTGGGTTTT…-3'No14…ATGATGTGCAACTCGACAACTT(GG)GGGTTTTGGGTTTT…-3'No17…ATGATGTGCAACTCGACAACTTGGGGTTTGGGGTTCTGGGTTTT…-3'No19…ATGATGTGCAACTCGACAACTTGGGTTTTGGGTTTT…-3'No23…ATGATGTGCAACTCGACAACTT(G)GGGTTTT(G)GGGTTTTGGGTTTT…-3'

2.4轉(zhuǎn)基因植株端粒的檢測

2.4.1單個端粒序列的擴增

以02pF和P-R作為上下游引物對獲得的五株轉(zhuǎn)基因水稻染色體端粒進行擴增并分析(圖4)。每個泳道均出現(xiàn)了彌散條帶，與預(yù)期情況相符。

圖4　單個端粒重復序列的PCR擴增結(jié)果　注：M.Marker;1～5.5個轉(zhuǎn)基因水稻基因組。

2.4.2染色體端粒序列的檢測

為解析轉(zhuǎn)基因植株染色體末端的組成，對PCR擴增后的端粒重復序列進行回收，并通過T-vector進行克隆。結(jié)果獲得了40個克隆(圖5)，選取8個含不同插入片段的克隆進行測序分析。顯示8個克隆中均含有(AGGGTTT)n，與野生型端粒酶RNA模板序列5′-AAACCCTAA-3′相吻合；其中，2個克隆出現(xiàn)5次GGGTTTT序列，與突變型端粒酶RNA模板序列5′-AAACCCAAA-3′一致(表7)。

圖5　染色體端粒序列T克隆的PCR鑒定結(jié)果注：M.Marker;1-1～5-8.以02pF和M13-48為引物獲得的40個克隆。

名稱序列(5'—3')No1-5…TGATTGAGCCAAGACAAGTGCATTGCTTCATTAAGGTTGGGGTT(AGGGTTT)25AGGGTTTT(AGGGTTT)8AGGGTT(AGGGTTT)3AGAGTTT(AGGGTTT)3AGGGTTTT(AGGGTTT)6AGGGTTTT(AGGGTTT)2-3'No2-2…TGATTGAGCCAAGACAAGTGCATTGCTTCGTTAAGGTTGGGGTT(AGGGTTT)5AGGGTT(AGGGTTT)20AGGGTT(AGGGTTT)3AGTGTTT(AGGGTTT)9-3'No2-3…TGATTGAGCCAAGACAAGTGCATTGCTTCATTAAGGTTGGGGTT(AGGGTTT)4AGGGTT(AGGGTTT)9AGGGTT(AGGGTTT)4AGTGTTT(AGGGTTT)9-3'No3-1…TGATTGAGCCAAGACAAGTGCATTGCTTCATTAAGGTTGGGGTT(AGGGTTT)2-3'No3-7…TGATTGAGCCAAGACAAGTGCATTGCTTCATTAAGGTTGGGGTT(AGGGTTT)3AGGGCTTAGGGTT(AGGGTTT)9AGGGTT(AGGGTTT)11-3'No4-1…TGATTGAGCCAAGACAAGTGCATTGCTTCATTAAGGTTGGGGTT(AGGGTTT)4AGGGTT(AGGGTTT)9AGGGTT(AGGGTTT)6-3'No5-3…TGATTGAGCCAAGACAAGTGCATTGCTTCATTAAGGTTGGGGTT(AGGGTTT)4AGGGTT(AGGGTTT)17AGGGTT(AGGGTTT)13-3'No5-7…TGATTGAGCCAAGACAAGTGCATTGCTTCATTAAGGTTGGGGTT(AGGGTTT)4AGGGTT(AGGGTTT)9AGGGTT(AGGGTTT)7AGGGTTTT(AGGGTTT)3AGGGTT(AGGGTTT)4GGGGTTT(AGGGTTT)2AGGGTTTT(AGGGTTT)11-3'

3　討　論

在抗性愈傷組織的誘導分化過程中，愈傷組織的褐變死亡現(xiàn)象是導致低分化率的最大原因。植物組織培養(yǎng)中產(chǎn)生褐變的原因很多，可能是在多次轉(zhuǎn)接過程中愈傷組織受到了多次切割，切口部位酚類物質(zhì)被氧化的面積越來越大，導致了褐變程度的加深。在抗性篩選過程中使用了Cef來抑制農(nóng)桿菌的生長，但Cef卻易于引起傷口細胞的褐變死亡，也會抑制芽的分化[20]。在愈傷組織誘導過程中pH值的變化，也可能改變酚類與酚氧化酶的結(jié)合部位，進而影響酚類的氧化程度。在之后的實驗中，可以深入探索防止植物組織培養(yǎng)褐變的措施，從而提高分化率。

在解析突變型愈傷組織端粒酶體外酶促反應(yīng)的產(chǎn)物時，表6顯示酶促產(chǎn)物中出現(xiàn)8次(G)GGGTTTT和1次(GG)GGGTTTT，可能是RNA模板的突變降低了端粒酶的保真性所導致。3次GGGGTTT序列的出現(xiàn)可能是由于突變型愈傷組織中內(nèi)源的野生型端粒酶RNA模板造成的干擾所致。根據(jù)陳波等[19]的研究，端粒酶在延伸前導引物時傾向于合成GGTTTAG、TTAGGGT、TAGGGTT這三種類型的重復序列，且體外酶促條件下前導引物與TER模板區(qū)結(jié)合的位點一般是兩個堿基，這意味著反應(yīng)過程中TER模板可發(fā)生左右滑動，使得野生型端粒酶在不含dATP的情況下通過錯配一個堿基G來完成端粒的延伸，但其效率應(yīng)遠遠低于突變型端粒酶的催化作用。表6的結(jié)果可以較清晰地闡明體外延伸的部分為端粒重復序列，且出現(xiàn)了突變型目標重復序列，與擬南芥體外延伸試驗結(jié)果基本一致[5]。

由于轉(zhuǎn)基因植株體內(nèi)既有內(nèi)源的野生型端粒酶又有轉(zhuǎn)入的突變型端粒酶，野生型端粒酶可能合成的端粒序列有AGGGTTT、TTAGGGT、TAGGGTT三種類型，而突變型端粒酶可能合成的端粒序列有GGGTTTT、TTTGGGT、TTGGGTT、TGGGTTT四種類型。在檢測轉(zhuǎn)基因植株染色體末端的組成時，表7的測序結(jié)果符合預(yù)期。其中7個克隆均出現(xiàn)了或多或少的AGGGTT序列，總計達14次，還出現(xiàn)了AGAGTTT、AGTGTTT、AGGGCTT、GGGGTTT這4個單一的序列，推測是突變型端粒酶RNA模板序列的存在降低了內(nèi)源野生型端粒酶的保真性所導致的。從測序結(jié)果來看，突變型端粒酶合成的端粒序列GGGTTTT次數(shù)很少，出現(xiàn)這種情況可能有兩方面的原因，其一，水稻有24條染色體，共48個染色體末端，這里只選擇了其中一條染色體的一個端粒末端來進行實驗，突變型端粒酶產(chǎn)生作用的概率相對較低；其二，體內(nèi)端粒合成過程中，轉(zhuǎn)基因植株的內(nèi)源野生型端粒酶占優(yōu)勢，故合成的野生型端粒重復序列居多，推測突變型端粒酶只是間或插入野生型端粒酶作用的進程中，故合成的序列很少。

綜合上述分析，研究認為馬登旭克隆得到的這條候選序列為水稻端粒酶RNA序列。根據(jù)已報道的擬南芥端粒酶的情況，其擁有兩個形式的TER[5]，水稻也可能存在多個形式，而現(xiàn)克隆得到的這條序列也許只是其中一種，水稻端粒酶是否擁有另一個TER形式還有待進一步的研究。

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(責任編輯： 許惠兒)

Identification of Telomerase RNA Candidate Sequence in Rice (OryzaSativaL.)

ZHULianlian,LINGaoqiang,YECongying,HUANGQian,LIUXiaochuan

(Institute of Bioengineering, College of Life Science, Zhejiang Sci-Tech University, Hangzhou 310018, China)

Telomerase is composed of telomerase inverse transcription and telomerase RNA. Except template sequence which is conservative in telomerase RNA, conservation degree in olther zones is very low, so it is very hard to clone based on homologous sequence. Currently, only Arabidopsis thaliana RNA has been cloned in plants. To identify a candidate telomerase with the characteristic of telomerase RNA, the activity of the transgenic callus telomerase after site-directed mutagenesis T/A of the template sequence (5’-AAACCCTAA-3’) was compared. The result shows the activity of mutant telomerase is significantly higher than that of non-mutant telomerase in the absence of dATP during the TRAP approach. Furthermore, a sequencing result from the ssDNA extended in vitro by the transgenic telomerase shows that all of the 10 fragments contain mutant feature sequence. Then, telomere detection of transgenic plants was conducted. The results show that among 8 telomere sequences, 2 contain mutant feature sequence. Therefore, we can preliminarily judge the candidate sequence is telomerase RNA gene in rice.

rice; telomerase; telomerase RNA; TRAP; site-directed mutation

10.3969/j.issn.1673-3851.2016.01.019

2015-05-04

朱蓮蓮(1989- )，女，浙江紹興人，碩士研究生，主要從事水稻端粒酶方面的研究。

劉小川，E-mail：xcliu@zstu.edu.cn

Q785

A

1673- 3851 (2016) 01- 0116- 06 引用頁碼： 010705