陳　琛，于　威,b，史利利,b，鞏成見,b，蔣　磊,b，童富淡,b

(浙江理工大學(xué)，a.生物化學(xué)研究所； b.浙江省家蠶生物反應(yīng)器和生物醫(yī)藥重點實驗室，杭州 310018)

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Bmp24缺失對家蠶核型多角體病毒基因組的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄及病毒組裝的影響

陳琛a，于威a,b，史利利a,b，鞏成見a,b，蔣磊a,b，童富淡a,b

(浙江理工大學(xué)，a.生物化學(xué)研究所； b.浙江省家蠶生物反應(yīng)器和生物醫(yī)藥重點實驗室，杭州 310018)

研究Bmp24基因的生物學(xué)功能，利用Red重組技術(shù)和Bac-to-Bac系統(tǒng)構(gòu)建Bmp24缺失型病毒(Bmp24-ko-Bacmid)和Bmp24修復(fù)型病毒(Bmp24-re-Bacmid)。然后將Bmp24-ko-Bacmid、Bmp24-re-Bacmid以及野生型病毒(wtBacmid)分別轉(zhuǎn)染BmN細胞，病毒滴度測定發(fā)現(xiàn)3種病毒都能產(chǎn)生有活力的子代病毒并使細胞發(fā)病，但Bmp24-ko-Bacmid在各個時相的滴度值顯著低于其他兩種病毒(P<0.05)。電鏡觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn)Bmp24-ko-Bacmid感染的細胞中只有少量細長的桿狀結(jié)構(gòu)，而其他兩種病毒感染細胞后能夠產(chǎn)生大量具有囊膜包裹的成熟病毒粒子。qPCR實驗結(jié)果顯示，Bmp24缺失不會影響病毒基因組的復(fù)制，同時qRT-PCR結(jié)果顯示Bmp24缺失使早期、晚期基因和極晚期基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著低于野生型病毒(P<0.05)。

家蠶核型多角體病毒；Bmp24基因；Red重組系統(tǒng)；Bac-to-Bac系統(tǒng)

0　引　言

桿狀病毒(baculovirus)是一類具有囊膜包裹的雙鏈DNA大型病毒，感染的宿主種類達到600多種，是已知昆蟲病毒中最大的類群。桿狀病毒屬于桿狀病毒科，這一病毒家族分為4大類[1]：α-桿狀病毒屬Alphabaculovirus (lepidopteran-specific nucleo-polyhedrovirus NPV)、β-桿狀病毒屬Betabaculovirus(lepidopteran-specific gran-uloviruses)、γ-桿狀病毒屬Gammabaculovirus (hymenopteran-specific NPV)、δ-桿狀病毒屬Deltabaculovirus (dipteran-specific NPV)。

家蠶核型多角體病毒(Bombyxmorinucleopolyhedrovirus, BmNPV)(T3株)是Alphabaculovirus的成員之一，自從該病毒基因組測序完成之后[2]，對其分子生物學(xué)上的研究非常多，尤其是對基因組中保守基因的功能研究頗多。至今為止，大約有65%的基因被報道，例如調(diào)控基因lef-3[3]、lef-1[4]、lef-11[5]等；結(jié)構(gòu)基因Ac143[6]、ODV-E56[7]、Bm60[8]、38K[9]、Bm67[10]、和Bm91[11]等。

p24基因在苜蓿夜蛾核型多角體病毒(Autographcalifornicamultiple nuclear polyhedrosis virus,AcMNPV)和黃衫毒蛾核型多角體病毒(Orgyiapseudotsugatamulticapsid nucleopolyhedrovirus,OpMNPV)[12]中都是位于多角體膜蛋白基因區(qū)域連續(xù)表達的5個晚期開放閱讀框(open reading frame ORF)中的第一個，預(yù)期蛋白分子量大小為21.2KDa。在OpMNPV中p24基因編碼了一種核衣殼相關(guān)蛋白[13]；在舞毒蛾核型多角體病毒 (Lymantriadisparmultiple embedded nucleopolyhedrovirus,LdMNPV)中p24的同源序列缺失N-端，編碼蛋白預(yù)期分子量為11KDa[14]。表達時相研究發(fā)現(xiàn)p24在AcMNPV和OpMNPV中為晚期表達基因，而在LdMNPV中該基因為早期表達基因[15]，即p24基因具有結(jié)構(gòu)多樣性和表達的多樣性，但該基因在病毒繁殖和感染過程中究竟具有何種影響以及在細胞感染中有何種調(diào)控功能，研究甚少。

Bmp24位于BmNPV基因組的101,563-102,150 nt，預(yù)測蛋白分子量為21.8 KDa。本實驗以Bmp24基因為研究對象，探究該基因?qū)mNPV病毒復(fù)制、轉(zhuǎn)錄及組裝的影響，為優(yōu)化家蠶桿狀病毒表達系統(tǒng)提供基礎(chǔ)資料。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

家蠶細胞BmN，DH10Bac(含Helper plasmid，含pKD46質(zhì)粒，可表達phage λRed重組酶系統(tǒng))；大腸桿菌菌株TG1；質(zhì)粒pKD3(含氯霉素抗性基因cat)和質(zhì)粒pFastBacHTB均由本實驗室保存。

T4連接酶(TaKaRa公司)、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和EcoRⅠ(TaKaRa公司)；DpnⅠ(Promega公司)；PCR反應(yīng)有關(guān)的酶與試劑(TOYOBO公司)；胎牛血清和 sf-900TMII SFM(1×)(Life technologies 公司)；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑和SYBR Green實時熒光定量PCR試劑盒(Roche 公司)；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2方法

1.2.1Bmp24缺失型和修復(fù)型病毒的構(gòu)建及鑒定

以pKD3質(zhì)粒為模板，Bmp24-C1/C2為引物，PCR擴增獲得含有Bmp24同源臂和氯霉素(cat)基因的線性片段，為了避免模板自身對后續(xù)實驗的污染、減少假陽性提高打靶效率，本實驗用PCR產(chǎn)物為模板進行了二次PCR，獲得的片段命名為Bmp24-C。將Bmp24-C利用CaCl2熱激法轉(zhuǎn)化到制備好的DH10Bac(含pKD46質(zhì)粒)感受態(tài)細胞中，在Red重組酶的作用下使得Bmp24-C與Bmp24發(fā)生同源重組，最后經(jīng)LB固體平板(含Kan和Cm抗性)篩選，挑斑進行PCR鑒定。鑒定引物組合為Bmp24-up和Bmp24-down、cat-F和Bmp24-down、Bmp24-up和cat-R(表1)。獲得的Bmp24缺失型病毒命名為Bmp24-ko-Bacmid 。

以wtBacmid基因組為模板， pFastBacHTB-p24 F/R為引物，PCR擴增含Bmp24基因及其上游60 bp左右(含啟動子)序列的線性片段，連接到轉(zhuǎn)移載體pFastBacHTB上，并命名為pFastBacHTB-p24。然后將pFastBacHTB-p24轉(zhuǎn)化到已制備的Bmp24-ko-Bacmid感受態(tài)細胞中，通過含有Kan、Gen、Tet抗性及IPTG、X-gal的LB固體平板進行藍白斑篩選培養(yǎng)，挑取白斑進行PCR鑒定。鑒定引物組合為M13F和M13R、M13F和pFastBacHTB-p24R、pFastBacHTB-p24F和M13R(表1)。獲得的Bmp24修復(fù)型病毒命名為Bmp24-re-Bacmid。

表1　Bmp24缺失型和修復(fù)型病毒構(gòu)建及鑒定

Bmp24缺失型病毒構(gòu)建策略(圖1-a)和修復(fù)型病毒(圖1-b)的構(gòu)建策略。

圖1　Bmp24缺失型和修復(fù)型病毒的構(gòu)建策略注：(a)Bmp24缺失型病毒的構(gòu)建策略：擴增帶有Bmp24基因同源臂的cat片段，同wtBacmid的病毒基因組中Bmp24基因發(fā)生同源重組，替換p24基因；(b)修復(fù)型病毒的構(gòu)建策略：擴增完整的Bmp24基因通過轉(zhuǎn)移載體定點補回到Bmp24-ko-Bacmid的病毒基因組中polh基因上游位點。

1.2.2TCID50分析Bmp24缺失對子代病毒增殖的影響

分別將1μg的wtBacmid、Bmp24-ko-Bacmid和Bmp24-re-Bacmid DNA經(jīng)脂質(zhì)體法(V轉(zhuǎn)染試劑∶VDNA=3∶1)轉(zhuǎn)染到處于對數(shù)生長期的BmN[16-17]，收集轉(zhuǎn)染后12、24、48、72 h和96 h的細胞上清。然后將狀態(tài)良好的BmN均勻地鋪于96孔板(1×104個/孔)，27 ℃靜置培養(yǎng)24 h。當細胞密度達到70%～80%后，將收集的病毒上清按梯度稀釋(10-1～10-9)后接種到鋪有細胞的96孔板中(100 μL/孔)，每個稀釋度要設(shè)置8個重復(fù)，并且將未接病毒液的細胞孔作為陰性對照組。27 ℃靜置培養(yǎng)5 d，觀察細胞狀況，記錄各個稀釋度陽性和陰性感染的孔數(shù)。3次重復(fù)實驗后用TCID50終端稀釋法計算病毒滴度并制備曲線。

1.2.3電鏡分析Bmp24缺失對子代病毒組裝的影響

以3種病毒上清(MOI=10)分別感染處于對數(shù)增長期的BmN，48 h后離心(1000 r/min，5 min)收集細胞。參照相關(guān)文獻[18]的方法固定、包埋、切片和染色，以HitachiH-7650型透射鏡觀察分析。

1.2.4qPCR分析Bmp24缺失對病毒基因組復(fù)制的影響

首先以未轉(zhuǎn)染的wtBacmid為標準品，按103～109的梯度依次稀釋，各取1 μL為模板進行qPCR，繪制標準曲線。然后分別將1 μg的wtBacmid、Bmp24-ko-Bacmid和Bmp24-re-Bacmid的基因組DNA轉(zhuǎn)染(V轉(zhuǎn)染試劑∶VDNA=3∶1)BmN(1×106/培養(yǎng)皿)，收集轉(zhuǎn)染后12、24、48 h和72 h的細胞，提取胞內(nèi)總DNA，以DpnⅠ酶[19]在37 ℃條件下消化12 h。將消化后的基因組DNA作為模板進行qPCR[20]分析。以gp41(gp41是BmNPV ODV的囊膜蛋白基因，gp41基因突變感染昆蟲細胞后不能產(chǎn)生二代病毒)作為基因組復(fù)制水平的標記基因，根據(jù)gp41基因序列設(shè)計引物gp41 F和gp41 R(表2)。為了確保上樣量的統(tǒng)一，實驗中引入內(nèi)參β-Actin，β-Actin的擴增引物為β-actin F/β-actin R(表2)。

表2　qPCR反應(yīng)中所用擴增引物

1.2.5qRT-PCR分析Bmp24缺失對病毒基因組轉(zhuǎn)錄的影響

收集3種病毒轉(zhuǎn)染12、24、48 h和72 h后的細胞，提取胞內(nèi)總RNA，以不同時相的總RNA為模板，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA的第一條鏈。再以cDNA為模板進行qPCR，每個樣品設(shè)置3個實驗重復(fù)，研究Bmp24基因缺失對早期基因lef-3、晚期基因vp39和極晚期基因p10轉(zhuǎn)錄的影響。同樣，為了消除上樣量產(chǎn)生的誤差，引入內(nèi)參β-Actin。根據(jù)lef-3、vp39、p10基因[21]序列分別設(shè)計引物lef-3 F和lef-3 R、vp39 F和vp39 R、p10 F和p10 R(表3)。

表3　qRT-PCR反應(yīng)中所用擴增引物

1.2.5數(shù)據(jù)處理

利用SPSS17.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，通過T檢驗比較各實驗組之間是否存在顯著差異，P<0.05表示各組數(shù)據(jù)存在顯著差異，P<0.01表示存在極顯著差異。

2　結(jié)果與分析

2.1Bmp24缺失型和修復(fù)型病毒的鑒定

缺失型病毒理論上PCR擴增條帶大小為：以cat-F和Bmp24-down為引物擴增條帶為1023 bp；以cat-R和Bmp24-up為引物擴增條帶為399 bp；以Bmp24-up和Bmp24-down為引物擴增條帶為1424 bp。PCR結(jié)果顯示擴增產(chǎn)物大小均與理論值相符(圖2-a)，表明Bmp24缺失型病毒構(gòu)建成功，將該病毒命名為Bmp24-ko-Bacmid 。

修復(fù)型病毒理論上PCR擴增產(chǎn)物大小：以M13F和M13R為引物擴增條帶為3000 bp；以M13F和pFastBacHTB-p24R為引物擴增條帶為2350 bp；以pFastBacHTB-p24F和M13R為引物擴增條帶為1390 bp。PCR結(jié)果表明擴增產(chǎn)物大小均與理論值相符(圖2-b)，表明Bmp24修復(fù)型病毒構(gòu)建成功，將該病毒命名為Bmp24-re-Bacmid 。

圖2　Bmp24基因缺失型和修復(fù)型病毒的PCR鑒定注：(a)Bmp24基因缺失型病毒的PCR鑒定；M:DL-15000;1:以Bmp24-up& Bmp24-down為引物的PCR產(chǎn)物；2:以Bmp24-up& cat-R為引物的PCR產(chǎn)物；3:以cat-F & Bmp24-down為引物的PCR產(chǎn)物；(b)Bmp24基因修復(fù)型病毒的PCR鑒定；1:以M13F和M13R為引物的PCR產(chǎn)物；2:以M13F和pFastBacHTB-p24R為引物的PCR產(chǎn)物；3:以pFastBacHTB-p24F和M13R為引物的PCR產(chǎn)物。

2.2Bmp24缺失對病毒滴度的影響

收集3種病毒轉(zhuǎn)染后特定時間點的病毒上清，感染BmN細胞，以TCID50法測定滴度。

結(jié)果顯示3種病毒都可以產(chǎn)生有效的子代病毒并使細胞發(fā)病，且隨著病毒轉(zhuǎn)染時間的延長子代病毒滴度值增加；但Bmp24缺失型病毒的滴度顯著低于野生型病毒(P<0.05)，而修復(fù)型病毒與野生型病毒相比差異不顯著(P>0.05)(圖3)。

圖3　3種病毒轉(zhuǎn)染BmN細胞后的病毒滴度測定曲線

2.3Bmp24缺失對病毒粒子組裝的影響

將MOI為10的3種病毒上清感染BmN細胞，48 h后收集的細胞經(jīng)固定、包埋、切片和染色，透射電鏡觀察。10000×電鏡結(jié)果顯示：Bmp24-ko-Bacmid病毒感染的細胞中(圖4-b1)病毒顆粒量與wtBacmid(圖4-a1)及Bmp24-re-Bacmid(圖4-c1)兩種病毒相比明顯降低；30000×電鏡結(jié)果顯示：Bmp24-ko-Bacmid病毒感染的細胞中只出現(xiàn)少量細小的桿狀結(jié)構(gòu)(圖4-b2)，而wtBacmid病毒感染的細胞(圖4-a2)存在大量包裝成熟的桿狀病毒顆粒，而這種變化在Bmp24基因修復(fù)后得到彌補(圖4-c2)。

圖4　電子顯微鏡觀察3種病毒轉(zhuǎn)染BmN48h后的增殖情況注：a1. 野生型病毒感染的BmN(10000×)；b1. 缺失型病毒感染的BmN(10000×)；c1.修復(fù)型病毒感染的BmN(10000×)；a2. 野生型病毒感染的BmN(30000×)；b2. 缺失型病毒感染的BmN(30000×)；c2.修復(fù)型病毒感染的BmN(30000×)。

2.4Bmp24缺失對BmNPV基因組復(fù)制的影響

收集3種病毒轉(zhuǎn)染特定時間后的細胞，提取總DNA進行qPCR分析。結(jié)果表明隨著轉(zhuǎn)染時間的延長，3種病毒的gp41的拷貝數(shù)都隨之增高，但Bmp24-ko-Bacmid和wtBacmid相比無顯著差異(P>0.05)，證實Bmp24不是病毒基因組復(fù)制的必需基因(圖5)。

圖5　3種病毒轉(zhuǎn)染BmN后病毒拷貝數(shù)隨時間變化的qPCR分析

2.5Bmp24缺失對早期、晚期基因和極晚期基因轉(zhuǎn)錄的影響

收集3種病毒轉(zhuǎn)染特定時間后的細胞，提取總RNA進行qRT-PCR分析。qRT-PCR實驗得出轉(zhuǎn)染后不同時間點收集的細胞中l(wèi)ef-3、vp39和p10的ct值，按照ΔCt=ΔCt目的基因-ΔCt內(nèi)參基因；ΔΔCt=ΔCt-ΔCt最大值，計算出所有ΔΔCt。然后以-ΔΔCt為縱坐標，轉(zhuǎn)染后時相為橫坐標做柱狀圖，顯示3種病毒在各個時間點上的轉(zhuǎn)錄水平(這里圖表顯示的不是絕對值差異，而是相對值差異)。結(jié)果表明缺失型病毒轉(zhuǎn)染細胞后產(chǎn)生的子代病毒的早期基因lef-3(圖6-a)、晚期基因vp39(圖6-b)和極晚期基因p10(圖6-c)在各個時期的轉(zhuǎn)錄水平都低于野生型病毒，差異顯著(P<0.05)，而修復(fù)型與野生型無顯著差異(P>0.05)，Bmp24基因的補回彌補了這一缺陷。

圖6　3種病毒對病毒基因組轉(zhuǎn)錄水平的影響

3　討　論

前期實驗研究發(fā)現(xiàn)p24基因表達的蛋白是重要的核衣殼相關(guān)蛋白，但該基因在病毒繁殖和感染中具體的功能仍未知，因此本實驗利用Red重組的方法及Bac-to-Bac系統(tǒng)對其在細胞感染中的調(diào)控功能進行深入研究。

近年對BmNPV的保守基因研究頗多，而基因敲除是研究基因功能的有效方法之一。Red重組技術(shù)構(gòu)建Bm61基因缺失型和修復(fù)型病毒[22]，病毒滴度的測定發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后12～96h，Bm61的缺失并不會影響子代病毒的滴度，而本研究發(fā)現(xiàn)Bmp24基因缺失病毒的滴度值顯著低于野生型(P<0.05)；同時電鏡實驗進一步發(fā)現(xiàn)Bmp24基因的缺失影響子代病毒粒子的包裝，而其對子代病毒的增殖和包裝的影響機理有待深入研究。

在AcMNPV基因組中插入轉(zhuǎn)座子使p24基因失活，發(fā)現(xiàn)該基因的失活對基因組復(fù)制沒有顯著影響[23]；本實驗發(fā)現(xiàn)Bmp24的缺失對BmNPV的gp41基因復(fù)制無顯著影響，p24對BmNPV和AcMNPV病毒基因復(fù)制具有相似的功能。qRT-PCR實驗結(jié)果顯示Bmp24缺失雖然對基因復(fù)制沒有顯著影響，但Bmp24的缺失會顯著降低BmNPV的早期基因lef-3、晚期基因vp39和極晚期基因p10的轉(zhuǎn)錄水平,其作用機制有待深入研究。

另外，Bm56同Bmp24一樣，也是家蠶核型多角體病毒中重要的結(jié)構(gòu)基因[24]，以往研究通過qPCR實驗發(fā)現(xiàn)Bm56缺失對BmNPV病毒基因組復(fù)制和轉(zhuǎn)錄都沒有顯著影響，而本研究發(fā)現(xiàn)Bmp24缺失對于BmNPV病毒基因組復(fù)制水平?jīng)]有顯著影響，但它的缺失卻顯著降低病毒的轉(zhuǎn)錄水平。然而Bmp24和Bm56對BmNPV病毒基因組復(fù)制的作用機理是否相同，有待進一步研究；而兩者對病毒基因組轉(zhuǎn)錄作用的差異及其機制，也有待深入研究。

本實驗研究發(fā)現(xiàn)Bmp24基因具有一定的調(diào)控功能，影響子代病毒增殖和組裝，抑制BmNPV病毒基因組的轉(zhuǎn)錄。

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(責(zé)任編輯： 許惠兒)

Effect ofBmp24 Deficiency on Replication, Transcription and Virus Assembly of BmNPV

CHENChena,YUWeia,b,SHILilia,b,GONGChengjiana,b,JIANGLeia,b,TONGFudana,b

(a. Institute of Biochemistry; b.Zhejiang Provincial Key Laboratory of Silkworm Bioreactor and Biomedicine, Zhejiang Sci-Tech University, Hangzhou 310018, China)

This research intends to study the biological function of Bmp24. We constructed Bmp24-ko-Bacmid Red recombination technology and Bac-to-Bac system. Then, Bmp24-ko-Bacmid, Bmp24-re-Bacmid and wtBacmid transfected BmN cells. It was found through virus titer that the three viruses could generate viable progeny virus and induce cell pathogenesis, but the titerring values of Bmp24-ko-Bacmid was markedly lower than the other two types of viruses in various phases (P<0.05). Transmission electron microscopy result shows that among the cells infected by Bmp24-ko-Bacmid, there is only a small amount of long slender rod-shaped structures, while the other two virus-infected cells can produce large amounts of mature virus particles with capsule package. The qPCR result shows that lack of Bmp24 will not affect the replication of the viral genome. And the qRT-PCR result shows that lack of Bmp24 will reduce the transcription levels of early gene, late gene and very late gene which are significantly lower than that of the wild-type virus (P<0.05).

bmnpv;Bmp24 gene; Red recombination system; Bac-to-Bac system;

10.3969/j.issn.1673-3851.2016.01.018

2015-02-11

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃“863”項目(2011AA100603)

陳琛(1988-)，女，安徽淮南人，碩士研究生，主要從事生物反應(yīng)器與蛋白質(zhì)組學(xué)方面的研究。

童富淡，E-mail:fdtong@zstu.edu.cn

Q812

A

1673- 3851 (2016) 01- 0109- 07 引用頁碼： 010704