王銳麗，孫 偉，薛業(yè)敏（.信陽農(nóng)林學院生物與制藥工程學院，河南信陽464000；.南京師范大學金陵女子學院，江蘇南京0097）

嗜熱菌β-葡萄糖苷酶A基因的克隆表達及轉(zhuǎn)化大豆異黃酮糖苷的研究1

王銳麗1，孫 偉1，薛業(yè)敏2
（1.信陽農(nóng)林學院生物與制藥工程學院，河南信陽464000；2.南京師范大學金陵女子學院，江蘇南京210097）

為獲得具有高穩(wěn)定性和高效轉(zhuǎn)化大豆異黃酮糖苷的β-葡萄糖苷酶A，從嗜熱厭氧乙醇菌（Thermoanaerobacter ethanolicus）JW200基因組DNA中β-葡萄糖苷酶A基因（Te-BglA）進行PCR擴增，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-20b-Te-BglA，實現(xiàn)在大腸桿菌Escherichia coli JM109（DE3）的高效表達，經(jīng)熱處理和Ni2+親和層析純化達電泳均一，并對純化的重組酶Te-BglA的酶學性質(zhì)和動力學參數(shù)進行研究。結(jié)果表明，以pET-20b為載體成功實現(xiàn)基因Te-BglA在E.coli JM109（DE3）細胞中的表達，獲得重組酶Te-BglA。以對硝基苯酚-β-葡萄糖苷（pNPG）作為底物，重組酶Te-BglA的最適溫度和最適pH分別為80℃和7.0，Km與Vmax值分別為（0.78±0.02）mmol/L和（66.45±0.22）μmol/（min·mg）。以天然產(chǎn)物水楊苷作為底物時，Km與Vmax值分別為（5.18±0.10）mmol/L和（131.60±1.73）μmol/（min·mg），說明重組酶Te-BglA表現(xiàn)出對pNPG更好的專一性，對天然底物也有較好的親和力。將酶在65℃保溫3 h仍有90%的殘留活性，在pH 4.6～7.8區(qū)間重組酶Te-BglA保持較高的穩(wěn)定性。高效液相色譜法（HPLC）分析酶解大豆粉的結(jié)果表明，重組酶Te-BglA在65℃作用3 h能有效的將大豆異黃酮糖苷形式轉(zhuǎn)化為異黃酮苷元形式，酶解100 g大豆粉后大豆黃素和染料木素的產(chǎn)量分別達到26.2 mg/g和56.1 mg/g。

β-葡萄糖苷酶；酶學性質(zhì)；大豆異黃酮糖苷；苷元

大豆異黃酮因具有抗腫瘤作用、緩解更年期綜合征、抗輻射、延緩衰老等功效而成為國內(nèi)外研究熱點［1-3］。目前研究發(fā)現(xiàn)的12種大豆異黃酮根據(jù)結(jié)構(gòu)的不同分為兩大類：游離型苷元（染料木素、大豆素和黃豆黃素，占有比例少）和結(jié)合型糖苷，約占總量的97%～98%。藥理學研究發(fā)現(xiàn)，大豆異黃酮的作用特點與虎仗中的白藜蘆醇苷等中藥類糖苷類似［4-6］，即被人體腸道吸收的是它的苷元形式，糖苷形式必須轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的苷元才能真正發(fā)揮藥效。常用的轉(zhuǎn)化方法有酸水解法、微生物發(fā)酵法和酶水解法等。酸水解雖然高效，但污染環(huán)境。大豆異黃酮糖苷水解酶（β-葡萄糖苷酶）水解或相關(guān)微生物發(fā)酵因條件溫和而成為一種理想的轉(zhuǎn)化途徑［7-9］。雖有很多來源于細菌或真菌轉(zhuǎn)化大豆異黃酮糖苷β-葡萄糖苷酶的報道，但有關(guān)耐熱性高效水解糖苷的β-葡萄糖苷酶的報道卻很少。SUZUKI H等［10］研究發(fā)現(xiàn)大豆根含β-葡萄糖苷酶是對異黃酮糖苷專一性最高的，但該酶穩(wěn)定性不高。耐熱性酶在生物轉(zhuǎn)化過程中具有減少污染、加快反應(yīng)速度、提高底物溶解度和易于大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)勢［11］。為獲得具有高熱穩(wěn)定性和高效轉(zhuǎn)化大豆異黃酮糖苷的β-葡萄糖苷酶，本研究利用基因工程的方法實現(xiàn)嗜熱厭氧乙醇菌（Thermoanaerobacterethanolicus）JW200的β-葡萄糖苷酶A（Te-BglA）在大腸桿菌中的重組表達，并對重組酶的酶學性質(zhì)、動力學參數(shù)和酶解大豆粉中大豆異黃酮糖苷作用進行研究，為β-葡萄糖苷酶的工業(yè)應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

菌株：嗜熱厭氧乙醇菌（T.ethanolicus）JW200由美國佐治亞大學微生物系分離；大腸桿菌（Escherichiacoli）DH10B（用于質(zhì)粒擴增和分子克隆等過程）、E.coliJM109（DE3）（作為目的基因的表達宿主）：均購于普洛麥格生物技術(shù)有限公司。

主要試劑：限制酶XbaⅠ、XhoⅠ：日本TAKARA公司；水楊苷（salicin）、對硝基苯酚-β-D-葡萄糖苷（pNPG）、染料木素（genistein，G）、染料木苷（gensitin，Gin）和大豆黃苷（daidzin，Din）：美國Sigma公司；丙二?；玖夏拒眨?-malonyl-gensitin，M-Gin）、大豆黃素（daidzein，D）、丙二酰基大豆黃苷（6-malonyl-daidzin，M-Din）：伊普瑞斯科技有限公司。

液體LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L，酵母膏5 g/L，NaCl 10 g/L。

1.2儀器與設(shè)備

聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴增儀：美國Thermo Hybaid；電轉(zhuǎn)化儀：美國Bio-Rad公司；高速冷凍離心機：美國Thermo公司；高效液相工作站：美國Agilent公司。

1.3方法

1.3.1重組質(zhì)粒pET-20b-Te-BglA的構(gòu)建

根據(jù)GenBank公布的海棲熱袍菌（Thermotoga maritime）MSB8基因組序列上的BglB基因序列和Thermoanaerobacter pseudethanolicusATCC 33223的BglA基因序列設(shè)計相應(yīng)引物P1：5'GCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGATAAAATTT CCAAAAGA3'和引物P2：5'CCCCTCGAGCTCAATAGA ATTTTTCTGT3'，以T.ethanolicusJW200基因組為模板進行PCR擴增。PCR擴增參數(shù)設(shè)定為：先在95℃變性5 min，加Pyrobest DNA聚合酶1 μL；然后94℃變性30 s，52℃退火40s，72℃延伸2min，循環(huán)30次后，72℃保溫10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)回收柱純化后用XbaⅠ和XhoⅠ雙酶切，插入到用XbaⅠ和XhoⅠ雙酶切后的質(zhì)粒pET-20b中，于16℃連接過夜，將連接液電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞E.coliDH10B。挑取陽性克隆，提取質(zhì)粒，用雙酶切驗證。送至上海美吉生物技術(shù)公司測序，正確的轉(zhuǎn)化子命名為pET-20b-Te-BglA。

1.3.2重組酶的表達和純化

將重組質(zhì)粒pET-20b-Te-BglA電轉(zhuǎn)化于E.coliJM109（DE3），挑取單菌落接入含氨芐霉素（Amp）抗性的液體LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜。然后以1.5%接種量接入到750mL含Amp抗性液體LB培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至OD600nm達0.8左右加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG）至濃度0.05 mmol/L，繼續(xù)誘導培養(yǎng)5 h后，離心，收集細胞。用Rapid Affinity Purification Kit中的結(jié)合緩沖液（Binding Buffer）懸浮細胞，經(jīng)高壓破碎，13 000 r/min離心20 min，取上清液于70℃下熱處理20 min，離心得粗酶液。粗酶液再經(jīng)Ni2+親和層析純化，快速提取法按Novagen的產(chǎn)品說明進行，以每管1 mL收集酶活的峰值部分，純化的酶液采用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）檢測純度。

1.3.3重組酶活性測定

β-葡萄糖苷酶活性由底物pNPG釋放對硝基苯酚（pNP）的量確定，采用分光光度法［10］。一個酶活力單位（U）定義：在一定反應(yīng)條件下，1 min內(nèi)催化產(chǎn)生1 μmol pNP所需的酶量。

1.3.4重組酶的酶學性質(zhì)［11］

最適反應(yīng)溫度的測定：將重組酶液pH值調(diào)節(jié)為6.2，在30～95℃范圍內(nèi)每隔5℃，反應(yīng)10 min后測定β-葡萄糖苷酶A酶活，以最高酶活為100%，計算相對酶活性。

溫度穩(wěn)定性的測定：將重組酶分別置于65℃、70℃下保溫數(shù)小時，然后加底物于最適條件下測定殘留活性，以保存于冰浴中（未保溫）的酶活性為100%，制作重組酶溫度穩(wěn)定性曲線。

最適pH的測定：將重組酶液置于不同pH下，于最適溫度條件下測定其活性，以最高酶活為100%，計算相對酶活性。

pH穩(wěn)定性的測定：將重組酶置于20 μL的100 mmol/L不同pH的鄰苯二甲酸氫鉀-咪唑緩沖液中，于37℃下保溫1 h，冷卻后補加相應(yīng)的底物和緩沖液達到200 μL，再于最適條件測定殘留活性，以保存于冰浴中（未保溫）的酶活力為100%，制作重組酶pH穩(wěn)定性曲線。

1.3.5動力學參數(shù)的測定

用pH 7.0鄰苯-咪唑緩沖液配制濃度為1.0～10 mmol/L的水楊苷（salicin）作為底物，反應(yīng)體系為100 μL，包括10 μL不同濃度的Salicin，酶液10 μL，其余用緩沖液補足。80℃下反應(yīng)10 min，取出，加75 μL 3，5-二硝基水楊酸（3，5-Dinitrosalicylic acid，DNS），煮沸5 min，冰水冷卻，加1 075 μL水，混勻，在波長520 nm處測定吸光度值以檢測葡萄糖的生成量。配制濃度為0.2～2.0 mmol/L的pNPG作為底物，反應(yīng)體系為200 μL，包括10 μLpNPG，酶液10 μL，其余用緩沖液補足，于80℃反應(yīng)5 min，冰水冷卻后加入600 μL 1 mol/L的Na2CO3溶液終止反應(yīng)并顯色，在波長410 nm處測定吸光度值以檢測pNP的生成量。然后采用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法，計算重組酶的米氏常數(shù)（Km）、最大反應(yīng)速度（Vmax）、酶的轉(zhuǎn)換數(shù)（Kcat）、和催化效率常數(shù)（Kcat/Km）等。其中Kcat=最大反應(yīng)速度/蛋白摩爾數(shù)。

1.3.6重組酶Te-BglA轉(zhuǎn)化大豆異黃酮糖苷大豆粉的酶解試驗

稱取0.1 g脫脂大豆粉，以料液比1∶10（g∶mL）溶于pH 7.0，250 mmol/L的磷酸緩沖液中，加酶量為50 U/g，然后于65℃分別酶解10 min和3 h，在冰浴條件下終止反應(yīng)，離心，收集上清，冷凍干燥。經(jīng)干燥后的上清干粉與沉淀分別用1 mL 80%甲醇重懸，30℃提取2 h，13000 r/min離心20 min，取上清液，經(jīng)微孔濾膜過濾后取20 μL進行HPLC分析。以不加酶的試驗組為對照組。

重組酶Te-BglA轉(zhuǎn)化大豆異黃酮糖苷大豆粉的活性是由底物Gin、M-Gin釋放出G的量，由底物Din、M-Din釋放出D的量來確定，采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法［12］分析。色譜條件：Agilent HC-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；檢測波長260 nm；柱溫度30℃；流動相A：0.1%的磷酸水溶液，流動相B，乙腈，45 min內(nèi)，流動相A由85%降至65%；流速：0.8 mL/min［13］。一個酶活單位（U）定義為：在該條件下，1 min內(nèi)催化產(chǎn)生1 μmol的苷元類物質(zhì)（G、D）所需要的酶量。以峰面積（A）與標準品（G、D）的量（B）作標準曲線，分別得線性回歸方程A1=11.44B1+317.94（R2=0.999 6）和A2=14.15B2+541.49（R2=0.999 3）。

以反應(yīng)前后峰面積大小的相對比值表示大豆異黃酮糖苷的轉(zhuǎn)化率，異黃酮苷元產(chǎn)量用100 g脫脂大豆粉產(chǎn)生的異黃酮苷元的毫克（mg）數(shù)表示，以不加酶的試驗組為對照組。大豆異黃酮糖苷的轉(zhuǎn)化率計算公式如下所示：

轉(zhuǎn)化率=反應(yīng)一定時間（10 min或3 h）的峰面積/反應(yīng)0 min時的峰面積。

2　結(jié)果與分析

2.1重組質(zhì)粒pET-20b-Te-BglA的構(gòu)建

以嗜熱厭氧乙醇菌JW200基因組為模板，利用引物P1和P2擴增的Te-bglA基因片段為1.34 kb，結(jié)果見圖1。

圖1　 Te-bglA基因（A）和重組質(zhì)粒的酶切驗證（B）PCR擴增電泳圖Fig.1 PCR amplification electrophoregram of Te-bglA gene（A）and restriction analysis of the recombinant plasmid（B）

由圖1A可知，擴增的DNA片段的電泳圖中沒有明顯的非特異性條帶，說明所選PCR擴增條件能有效擴增Te-bglA基因片段。由圖1B可知，對于已構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET-20b-Te-BglA采用XbaⅠ和XhoⅠ雙酶切，得到線性的pET-20b質(zhì)粒載體和插入的Te-BglA基因片段，大小分別為3.7kb和1.34kb，與預計結(jié)果相同。測序結(jié)果表明質(zhì)粒pET-20b-Te-BglA構(gòu)建成功。

2.2重組酶的表達和純化

將重組質(zhì)粒pET-20b-Te-BglA電轉(zhuǎn)化于E.coliJM109（DE3）中，挑取E.coli JM109（DE3）單菌落接種于液體LB培養(yǎng)基中經(jīng)IPTG誘導后，收集細菌經(jīng)高壓破碎，上清液經(jīng)熱處理和Ni2+親和層析兩步純化操作，所得重組酶經(jīng)SDSPAGE檢測結(jié)果見圖2。

圖2　純化的重組酶Te-BglA的SDS-PAGE電泳圖Fig.2 SDS-PAGE electrophoretogram of purified recombinase Te-BglA

由圖2可知，所得重組酶Te-BglA蛋白條帶在泳道中單一均勻分布，與預期的蛋白分子量一致，證明重組酶Te-BglA已成功被純化。

2.3重組酶的最適反應(yīng)溫度和最適pH以及對溫度和pH穩(wěn)定性

通過在不同溫度和pH值條件測定重組酶的相對酶活，確定重組酶的最適反應(yīng)溫度和最適pH以及對溫度和pH的穩(wěn)定性，結(jié)果見圖3。

用pNPG作為底物，測得溫度和pH值對重組酶β-葡萄糖苷酶相對酶活的影響，由圖3A可知，在溫度70～80℃之間，酶的相對活性都在80%；當反應(yīng)溫度為80℃，重組酶的相對酶活達到最高，為100%；當溫度超過80℃，其相對活性急劇下降。由圖3B可知，重組酶的相對酶活隨著pH值的增加，先增加后降低；當反應(yīng)處于pH 5.8～7.8時，重組酶的相對酶活均在70%以上；當pH值為pH 7.0時，重組酶的相對酶活達到最高，為100%。因此重組酶的最適溫度和pH值分別為80℃和7.0。

由圖3C可知，將重組酶Te-BglA于65℃保溫3 h仍有90%的殘留活性。于70℃保溫1 h有90%的殘留活性，當時間延長為2 h時，酶活性幾乎檢測不出。在已報道的水解大豆異黃酮糖苷的β-葡萄糖苷酶具有高穩(wěn)定性的較少，只有來自嗜熱擬青霉（Paecilomyces thermophila）的重組β-葡萄糖苷酶在60℃保溫8 h，能保持70%的殘存活性，但是在70℃保溫1 h，只能保持20%的殘存活性［14］。將重組酶Te-BglA置于100 mmol/L不同pH緩沖液中，37℃保溫1 h，再測酶的殘留活性，由圖3D可知在pH 4.5～8.0重組酶都保持很高的pH穩(wěn)定性。

圖3　重組酶Te-BglA的最適溫度（A）、最適pH（B）、熱穩(wěn)定性（C）和pH穩(wěn)定性（D）的檢測結(jié)果Fig.3 Detection results of optimal temperature（A），the optimal pH（B），thermostability（C）and pH stability（D）of recombinase Te-BglA

2.4動力學參數(shù)

重組酶Te-BglA以人工底物Salicin和pNPG作為底物，計算重組酶Te-BglA的動力學參數(shù)，結(jié)果見表1。

表1　重組酶Te-BglA的動力學參數(shù)Table1 Kinetic parameters of recombinase Te-BglA

由表1可知，以pNPG為底物時，Km值為（0.78±0.02）mmol/L，Kcat/Km值為（6.86±0.16）×104mmol/（L·s），表現(xiàn)出對pNPG更好的親和力和催化效率。以Salicin作為底物時Km與Vmax值分別為（5.18±0.10）mmol/L、（131.60±1.73）μmol/（min·mg），對天然底物salicin的底物專一性都要高于來自海棲熱袍菌的β-葡萄糖苷酶，推測對于降解纖維素寡糖和糖苷異黃酮等天然底物它也具有較高的專一性功能［11］。

2.5重組酶Te-BglA酶解大豆粉試驗

重組酶Te-BglA酶解大豆粉試驗結(jié)果見圖4和表2。

圖4　未加酶（A）和酶處理3 h后（B）的脫脂大豆粉中大豆異黃酮成分的HPLC色譜圖Fig.4 HPLC patterns of isoflavonoids in soybean flour after incubation without（A）and with（B）recombinase Te-BglAfor 3 h

由圖4的峰型圖可知，脫脂大豆粉中主要的四種大豆異黃酮糖苷經(jīng)重組酶Te-BglA酶解作用后，其含量大幅度減少，而相應(yīng)的苷元產(chǎn)量增加明顯。由表2可知，于65℃作用脫脂大豆粉10 min后，Din和Gin被重組酶Te-BglA完全降解。酶解3 h后，M-Din和M-Gin也被重組酶Te-BglA完全降解，產(chǎn)生相應(yīng)的異黃酮苷元。重組酶Te-BglA與大豆粉反應(yīng)10min之后，D和G的產(chǎn)率就分別達到20.4mg/g和47.7mg/g。在不加酶的對照組，反應(yīng)10min后，D和G的產(chǎn)率只有0.6mg/g和1.4 mg/g?？梢娫谥亟M酶Te-BglA的作用后，苷元產(chǎn)量大幅度增加。

表2　重組β-葡萄糖苷酶A水解脫脂大豆粉的結(jié)果Table 2 The results of soy isoflavones hydrolysed and isoflavone aglycones produced by the recombinant β-glucosidase A

3　結(jié)論

糖苷形式的大豆異黃酮不具有最佳的生理活性狀態(tài)，須在大豆異黃酮糖苷酶的作用下轉(zhuǎn)化成苷元形式才能被吸收而發(fā)揮藥效［15-16］。因此，篩選出高效的轉(zhuǎn)化糖苷的β-葡萄糖苷酶成為項目的目標。為獲得具有高穩(wěn)定性和高效轉(zhuǎn)化大豆異黃酮糖苷的β-葡萄糖苷酶A，本研究從T.ethanolicusJW200基因組DNA中PCR擴增β-葡萄糖苷酶A基因（Te-BglA），對其進行重組表達，獲得重組酶Te-BglA。該酶經(jīng)熱處理和Ni2+親和層析純化，純化的酶液采用SDS-PAGE檢測其純度，并對純化的重組酶Te-BglA的酶學性質(zhì)和動力學參數(shù)進行研究。結(jié)果表明，本研究成功實現(xiàn)Te-BglA在E.coliJM109（DE3）細胞中的表達，獲得重組酶Te-BglA。以pNPG作為底物，重組酶Te-BglA的最適溫度和最適pH值分別為80℃和7.0，Km與Vmax值分別為（0.78±0.02）mmol/L和（66.45±0.22）μmol/（min·mg）。以天然底物Salicin作為底物時Km與Vmax值分別為（5.18±0.10）mmol/L和（131.60±1.73）μmol/（min·mg），說明重組酶Te-BglA表現(xiàn)出對pNPG更好的專一性，對天然底物也有較好的親和力。將酶在65℃保溫3 h仍有90%的殘留活性，在pH 4.6～7.8區(qū)間重組酶Te-BglA保持較高的穩(wěn)定性。HPLC分析酶解大豆粉的結(jié)果表明，重組酶Te-BglA在65℃作用3 h能有效的將大豆異黃酮糖苷形式轉(zhuǎn)化為異黃酮苷元形式，酶解100 g大豆粉后D和G的產(chǎn)率達到26.2 mg/g和56.1 mg/g。

針對重組酶Te-BglA熱穩(wěn)定性高的特點，如將該酶直接用于大豆異黃酮的熱提取過程中，使原料中的大豆異黃酮邊抽提邊轉(zhuǎn)化以制備大豆異黃酮苷元，改善原有的兩步法，從而縮短生產(chǎn)周期短和降低成本［17］?？梢姀腡.ethanolicusJW200克隆的重組Te-BglA在開發(fā)富含大豆異黃酮苷元的保健食品上具有潛在的應(yīng)用價值。

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Cloning and expression β-glucosidase A gene from Thermoanaerobacter ethanolicus for hydrolysis of soybean isoflacone glucosides

WANG Ruili1，SUN Wei1，XUE Yemin2
（1.Department of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering，Xinyang College of Agriculture and Forestry，Xinyang 464000；2.Jinling College，Nanjing Normal University，Nanjing 210097）

In order to obtain a high stability and efficiency β-glucosidase A（BglA）in the biotransformation of isoflavone glycosides，β-glucosidase gene was amplified by PCR from the genomic DNA of Thermoanaerobacter ethanolicus JW200，and produced in Escherichia coli JM109（DE3）and purified by nickel affinity chromatography for characterization of their enzymatic and kinetic properties.p-Nitrophenyl β-D-glucoside（pNPG）as substrate，optimal temperature and pH of the BglA were 80℃and 7.0，Km and Vmax of BglA were（0.78±0.02）mmol/L and（66.45±0.22）μmol/（min·mg），respectively.The salicin as substrate，Km and Vmax were（5.18±0.10）mmol/L and（131.60±1.73）μmol/（min·mg），demonstrated that the recombinant Te-BglA showed better specificity for pNPG，and had better affinity for the natural substrate.And BglA was found to be greater stability which kept 90%activity of 3 h at 65℃and pH 4.6-7.8.High performance liquid chromatography（HPLC）results demonstrated that the effect of enzyme hydrolysis soybean isofavone glycosides to isoflavone aglycones was evident at 65℃for 3 h，the yield of soybean daidzein and genistein reached 26.2 mg/g and 56.1 mg/g per 100 g soybean flour.

β-glucosidase；enzymatic property；soybean isoflavone glycoside；aglycones

Q93

0254-5071（2016）02-0000-00

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.02.000

2015--

河南省科技攻關(guān)資助項目（132102110047）

王銳麗（1985-），女，講師，碩士，研究方向為微生物學及分子生物學。