卯吉華，賈代順*，景躍波，陳福，李榮波，耿云芬

(1.云南省林業(yè)科學院油茶研究所，云南廣南663300；2.云南省林業(yè)科學院，昆明650201)

?

野生蒜頭果叢枝菌根真菌和深色有隔內(nèi)生真菌調(diào)查研究

卯吉華1，賈代順1*，景躍波2，陳福1，李榮波2，耿云芬2

(1.云南省林業(yè)科學院油茶研究所，云南廣南663300；2.云南省林業(yè)科學院，昆明650201)

為探明我國特有瀕危野生植物資源蒜頭果根系中叢枝菌根真菌(AMF)和深色有隔內(nèi)生菌(DSE)的定殖狀況，對蒜頭果的天然分布中心—云南省廣南縣4個蒜頭果主要分布點的AMF及DSE自然定殖情況進行調(diào)查研究。結果表明:蒜頭果根系能被AMF及DSE雙重定殖，并形成良好的共生關系，且DSE的平均定殖率(52.69%)高于AMF平均定殖率(46.96%)。其AMF和DSE的自然定殖率因立地條件而異，在4個分布點中，以舊莫鄉(xiāng)湯盆村AMF自然定殖率最高，達70.75%，以懂堡鄉(xiāng)三仙洞村DSE定殖率最高，達76.58%。

叢枝菌根真菌；深色有隔內(nèi)生菌；野生蒜頭果

蒜頭果(MalaniaoleiferaChun et SK Lee),為鐵青樹科(Olacaceae)蒜頭果屬高大喬木，又稱山桐果(廣南)、馬蘭后(壯語),是我國特有的單種屬重點保護珍希瀕危植物[1-2]。野生蒜頭果資源僅分布于云南東南部(廣南、富寧)及廣西西部(大新、田林、樂業(yè)、巴馬)的狹長區(qū)域[3-4]。廣南是該物種的野生天然分布中心，現(xiàn)保存的野生蒜頭果資源有85%分布于廣南縣境內(nèi)。蒜頭果種含油率達60%以上，其種仁油脂中的脂肪酸是提起神經(jīng)酸以及人工合成名貴的麝香所需的理想植物資源[5]，因此其潛在的開發(fā)價值較高。

叢枝菌根真菌(Arbuscular mycorrhiza fungi，AMF)是植物根系與根際土壤中的叢枝菌根真菌形成的共生體，是土壤生態(tài)系統(tǒng)中最普遍、最重要的一類共生關系[6]。90%以上的陸生高等植物，如糧食作物、果樹、蔬菜、花卉等都具有叢枝菌根[7]。AMF真菌在土壤中形成許多菌絲網(wǎng)絡，增加植物根系的吸收面積，從而促進寄主植物對水分和營養(yǎng)物質(zhì)的吸收；增強植物對逆境如冷、熱、旱、堿、重金屬污染等的耐受能力;改善植物根際的微生態(tài)條件。深色有隔內(nèi)生真菌(Dark Septate Endophytes, DSE)泛指一群定居于健康植物根的表皮、皮層甚至維管束組織的細胞內(nèi)或細胞間隙的一類小型共生真菌，這種小型真菌為棕色或深棕色，菌絲較粗，有明顯隔膜，能夠在植物細胞內(nèi)形成微菌核[8]。DSE從植物根部延伸出的粘質(zhì)菌絲可幫助植物在干旱環(huán)境中維持水分和營養(yǎng)的運輸。DSE通過改善寄主植物的營養(yǎng)狀況，從而增強植物在脅迫生境中的抗旱、抗病、抗寒、耐重金屬污染的能力[9]。自20世紀70年代以來，已有不少蒜頭果的研究報道，但所見報道對它瀕危機制、生態(tài)保護、育苗技術、病害防治和開發(fā)利用等方面的研究居多[10],然而，有關蒜頭果AMF和DSE方面的研究尚未開展過。本研究針對國內(nèi)外在蒜頭果AMF和DSE研究方面的空白，選擇蒜頭果的主要生態(tài)分布中心廣南縣的4個野生分布點，調(diào)查自然條件下，野生蒜頭果根系中AMF和DSE的定殖狀況，了解不同立地條件以及不同樹齡的蒜頭果對AMF和DSE定殖率的影響，為AMF和DSE生物技術在蒜頭果培育中的應用研究奠定基礎。

1　材料與方法

1.1樣品采集與處理

采樣地點為蒜頭果的野生分布中心—廣南縣，2013年6月在廣南縣野生蒜頭果分布較多的4個點(懂堡鄉(xiāng)三仙洞村、舊莫鄉(xiāng)湯盆村、舊莫鄉(xiāng)花掌村、蓮城鎮(zhèn)幕咪村)，每個點隨機選擇5株生長良好的植株，去掉表層土5cm，在距主干10～30cm的范圍，采集附帶根際土壤的根樣，用自封袋封好，貼上標簽，帶回實驗室，存放在4℃冰箱內(nèi)，盡快對根樣進行測定。

1.2AMF真菌和DSE定殖狀況觀察與測定

將所采集的根樣在堿解離—酸性品紅染色法的基礎上，稍做調(diào)整(用英雄純藍墨水203染色)進行制片[6]。具體操作是：將采集的蒜頭果根系用清水沖洗2～3次，去掉根系表面附著的土壤顆粒，剪成1cm左右的根段，然后放入試管中，加入10%的氫氧化鈉約10 mL(以淹沒根段為宜)，置于90℃的水浴鍋中煮1.5h，然后倒出氫氧化鉀，再用蒸餾水漂洗數(shù)次根樣，再加入10mL乳酸浸泡約5～10min，然后用蒸餾水清洗數(shù)次后即可加入英雄牌純藍墨水，置于酒精燈上染色2～3min，再用蒸餾水清洗數(shù)次后用乳酸甘油進行脫色，最后選50個細小根段，按照McGonigle 等的十字交叉法[6]，于光學顯微鏡(OLYMPUS- BH 2)下觀察各根樣中AMF真菌(菌絲、泡囊、叢枝、菌絲圈)及DSE(深色有隔內(nèi)生菌、微菌核)的定殖情況。典型的標本于顯微鏡(Nikon 80i, Japan)下拍照保存圖片。

定殖率(%)=被定殖根段數(shù)/鏡檢總根段數(shù)×100%

1.3數(shù)據(jù)分析

采用DPS統(tǒng)計軟件和Microsoft Excel 2007進行數(shù)據(jù)分析。

2　結果與分析

2.14個野生蒜頭果分布點蒜頭果生長概況

4個野生蒜頭果分布點是目前廣南縣蒜頭果產(chǎn)量較高的地方，但都受到不同程度的人為破壞，尤其是舊莫鄉(xiāng)花掌村和蓮城鎮(zhèn)幕咪村人為破壞及其嚴重，經(jīng)初步調(diào)查30%以上的大樹樹干和枝椏被人為亂砍過；立地類型為喀斯特巖溶類型和土山地類型；地理范圍23°89′～24°36′ N，104°73′～105°26′ E；海拔范圍1240～1360m；主要伴生植物有：麻櫟、云南松、滇青岡、滇油杉、清香木等；樹勢除舊莫鄉(xiāng)花掌村生長中等外，其它3個點的生長旺盛；樹高10～17m；胸徑18～52cm；樹齡20～55a。

表1　4個野生蒜頭果分布區(qū)采樣點概況

2.24個野生蒜頭果分布點AMF定殖狀況

由表2可知，從懂堡鄉(xiāng)三仙洞村、舊莫鄉(xiāng)花掌村、舊莫鄉(xiāng)湯盆村、蓮城鎮(zhèn)幕咪村4個野生蒜頭果分布點植株根系中都檢測到AMF的定殖，4個分布點AMF的平均總定殖率達46.96%，蒜頭果根系中AMF的總定殖率最高的是舊莫鄉(xiāng)湯盆村(70.75%)，其次是蓮城鎮(zhèn)幕咪村，AMF總定殖率最低的是懂堡鄉(xiāng)三仙洞村(30.41%),AMF總定殖率除懂堡鄉(xiāng)三仙洞村和舊莫鄉(xiāng)花掌村差異不顯著外，其它兩兩之間的差異均達到極顯著水平。在4個野生蒜頭果分布點的根系中都觀察到AMF的典型結構，即菌絲、泡囊、叢枝和菌絲圈，其中菌絲的平均定殖率最高(38.75%)，其次是叢枝定殖率，而菌絲圈的平均定殖率最低(10.84%)；方差分析結果表明，泡囊定殖率在4個蒜頭果分布點之間存在極顯著的差異，而菌絲、菌絲圈和叢枝定殖率除在懂堡鄉(xiāng)三仙洞村和舊莫鄉(xiāng)花掌村之間差異不顯著外，其它不同分布點兩兩之間存在極顯著的差異。

本研究發(fā)現(xiàn)，在4個野生蒜頭果分布點的蒜頭果植株根系中均有AMF定殖，說明AMF真菌能與蒜頭果形成良好的共生關系，蒜頭果是一個典型的叢枝菌根營養(yǎng)型樹種。在4個不同的野生蒜頭果分布點之間，盡管都是天然的野生蒜頭果，但是立地條件、海拔、氣候、土壤、寄主植物種類等方面的差異，都影響著AMF在植物根系中的定殖程度，因此，導致4個分布點蒜頭果根系中的AMF定殖率各不相同。另外，值得注意的是隨著蒜頭果樹齡的增長，AMF定殖率有下降趨勢，45年和55年生蒜頭果根系AMF定殖率普遍很低，而20年和30年生蒜頭果根系AMF定殖率較高。這一結果與李素美等在蘋果樹根系的研究結果一致，蘋果的AMF定殖率隨著樹齡的增大而下降[11]。一方面大齡樹生長勢逐漸下降，新根的更新較慢，而AMF對新生根的侵染率較強，另一方面，隨著樹齡的不斷增長，根系皮層細胞的木質(zhì)化程度不斷加大，從而不利于AMF的定殖。因此，對于老樹，應加強土壤深翻、施農(nóng)家肥等措施，提高土壤的通透性，從而促進AMF的生長發(fā)育，以提高植株生產(chǎn)力。

表2　4個野生蒜頭果分布區(qū)根系中叢枝菌根真菌的定殖狀況(%)

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標準差，每一列后面不同的小寫字母表示不同分布區(qū)該平均值的多重比較在0.05的水平上有顯著差異，不同的大寫字母表示不同分布區(qū)該平均值的多重比較在0.01的水平上有極顯著差異。

2.34個野生蒜頭果分布點DSE定殖狀況

中懂堡鄉(xiāng)三仙洞村DSE的定殖率最高，達76.58%，其次是舊莫鄉(xiāng)花掌村，定殖率為58.97%，DSE定殖率最低的是舊莫鄉(xiāng)湯盆村，為29.51%，且4個分布點的總定殖率兩兩之間的差異達到顯著水平。通常，深色有隔菌絲和微菌核被認為是DSE在植物根內(nèi)的兩種典型結構[8]，本研究在蒜頭果的全部根系樣品中都檢測到DSE的典型結構，即深色有隔菌絲和微菌核。深色有隔菌絲分布于蒜頭果根的皮層，顏色為深棕色至淺棕色，且隨著菌絲的延伸，顏色逐漸變淺，菌絲壁較厚，具明顯的橫隔。 微菌核為“腦狀”，由細胞壁加厚的膨大細胞緊密堆積形成，顏色多為深棕色，形狀大小不一，分布于細胞表皮，偶見與其相連的菌絲。在4個分布點均表現(xiàn)出深色有隔菌絲的定殖數(shù)較微菌核的定殖數(shù)多，深色有隔菌絲的平均定殖率達42.99%，而微菌核的平均定殖率僅為12.16%。4個野生蒜頭果根系中深色有隔菌絲和微菌核的定殖率從高到低依次是懂堡鄉(xiāng)三仙洞村、舊莫鄉(xiāng)花掌村、蓮城鎮(zhèn)幕咪村、舊莫鄉(xiāng)湯盆村，深色有隔菌絲定殖率在4個分布點的兩兩之間的差異達到顯著水平，微菌核定殖率在懂堡鄉(xiāng)三仙洞村與舊莫鄉(xiāng)花掌村和舊莫鄉(xiāng)湯盆村與蓮城鎮(zhèn)幕咪村之間的差異不顯著。

本研究發(fā)現(xiàn)，4個野生蒜頭果分布點的蒜頭果植株根系中均有DSE定殖，且定殖率高，說明蒜頭果能與DSE形成良好的共生關系。DSE在懂堡鄉(xiāng)三仙洞村喀斯特巖溶石山的定殖率極顯著高于其它3個土山地類，在脅迫生態(tài)環(huán)境(干旱、寒冷、重金屬污染)中DSE常常產(chǎn)生大量的深色有隔菌絲和微菌核，對宿主植物忍受干旱、寒冷和重金屬污染具有重要的作用，因此，通常DSE在干旱、寒冷和重金屬污染嚴重的生境中定殖率較高[12]。 而本研究的4個野生蒜頭果分布點中，懂堡鄉(xiāng)三仙洞村的蒜頭果生長于喀斯特巖溶石山的陽坡，長期生長于這種極端干旱的環(huán)境中，需要產(chǎn)生大量的菌絲和微菌核，擴大根系的吸收面積，從而促進蒜頭果能夠吸收更多的礦質(zhì)營養(yǎng)和水分，以滿足自身生長發(fā)育對水分和養(yǎng)分的需求。

表3　4個野生蒜頭果分布區(qū)根系中深色有隔內(nèi)生菌的定殖狀況(%)

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標準差，每一列后面不同的小寫字母表示不同分布區(qū)該平均值的多重比較在0.05的水平上有顯著差異，不同的大寫字母表示不同分布區(qū)該平均值的多重比較在0.01的水平上有極顯著差異。

3　結論與討論

3.1本研究首次探討了野生蒜頭果AMF和DSE的定殖狀況，結果表明，AMF和DSE往往同時存在于蒜頭果根系的同一根段，AMF和DSE普遍雙重定殖于蒜頭果根系，在蒜頭果根內(nèi)或根與根之間形成緊密的菌絲網(wǎng)絡，共同作用于蒜頭果，為蒜頭果進行水分、礦質(zhì)養(yǎng)分和其他代謝物的輸送與傳遞，AMF和DSE的雙重定殖可能是蒜頭果適應亞熱帶干旱山地和喀斯特巖溶石山環(huán)境的有效途徑。

3.2在野生蒜頭果根系中DSE的總定殖率高于AMF總定殖率，但在不同的分布點AMF和DSE的定殖率各不相同，在AMF定殖率較高的舊莫鄉(xiāng)湯盆村和蓮城鎮(zhèn)幕咪村根系中DSE的定殖率較低，而在DSE的定殖率較高的懂堡鄉(xiāng)三仙洞村和舊莫鄉(xiāng)花掌村根系中AMF的定殖率較低。這可能與不同分布點蒜頭果生長狀況有關，或與DSE在一些干旱生境的植物根系中有較高的定居率有關。

3.3AMF和DSE是野生蒜頭果根系上普遍存在的現(xiàn)象，且自然定居率較高，這表明蒜頭果能與AMF和DSE形成良好的共生關系，AMF和DSE是蒜頭果根系的一個重要組成部分，這為蒜頭果菌根化苗木的培育提供了可能。在不同的野生蒜頭果分布點，蒜頭果的AMF和DSE定殖率差異顯著，表明蒜頭果的AMF和DSE定殖率受生態(tài)環(huán)境的影響大。因此，在今后蒜頭果菌根化苗的培育過程中，應針對不同的栽培區(qū)，摸索出最適宜蒜頭果深色有隔內(nèi)生真菌和從枝菌根發(fā)育的環(huán)境條件，培育優(yōu)質(zhì)的蒜頭果菌根苗木。另外可充分利用DSE與植物病原菌的拮抗關系，在蒜頭果苗期接種土著的DSE菌種，為蒜頭果苗期嚴重的根腐病提供具有生防價值的工程菌，從而增強蒜頭果的抗病性，減少農(nóng)藥、化肥的施用量，在植被恢復、保護生態(tài)環(huán)境以及對促進蒜頭果產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展方面具有非常重要的意義。

3.4本研究只針對野生環(huán)境中蒜頭果的AMF和DSE定殖狀況進行了初步研究，這只邁出蒜頭果叢枝菌根和深色有隔內(nèi)生真菌研究工作的第一步，今后還需要對野生蒜頭果的AMF和DSE真菌孢子進行濕篩分離，篩選出蒜頭果土著的高效、優(yōu)質(zhì)菌種，開展蒜頭果接種試驗研究，將分離得到的優(yōu)質(zhì)土著菌種接種于蒜頭果苗木中。而有關AMF和DSE在脅迫環(huán)境中對蒜頭果的雙重作用機理也有待進一步研究。另外，蒜頭果是我國特有珍稀瀕危植物，目前野生蒜頭果資源退化極其嚴重，因此對野生蒜頭果AMF和DSE資源進行研究和利用，保藏一些稀有菌種，對于豐富我國菌種資源及其菌種的合理開發(fā)利用具有重要意義。

[1]李樹剛.油料植物一新屬—蒜頭果屬[J].東北林學院植物研究室匯刊,1980,1(6):67-72.

[2]李樹剛.廣西現(xiàn)代植物分類學研究的發(fā)展[J].廣西植物，1995,15(3):256-267.

[3]國家環(huán)境保護局.珍稀瀕危植物保護與研究[M].北京:中國環(huán)境科學出版社,1991.

[4]傅立國.中國植物紅皮書[M].北京:科學出版社,1991.

[5]李用華,朱亮鋒,歐乞緘,等.蒜頭果油合成麝香酮簡報[J].云南植物研究,1983,5(3):238.

[6]卯吉華,寧德魯,李榮波,等.云南不同栽培區(qū)油橄欖的叢枝菌根研究[J].西部林業(yè)科學，2015,44(1):114-120.

[7]郭紹霞,孟祥霞,張玉剛,等.牡丹AMF菌根菌自然侵染率的調(diào)查[J].中國農(nóng)學通報，2003,19(3):77-78,83.

[8]劉茂軍,張興濤,趙之偉.深色有隔內(nèi)生真菌(DSE研究進展[J].菌物學報，2009, 28(6): 888-894.

[9]張玉潔,植物深色有隔內(nèi)生真菌(DSO)的研究進展[J].文山學院學報,2010,23(1):145-150.

[10]吳彥瓊.蒜頭果保護的初步研究[D].南寧：廣西大學,2002.

[11]李素美,洪濱,維華,等.山東東部果樹種植園叢枝菌根發(fā)育狀況[J].青島農(nóng)業(yè)大學學報,2013,30(4):235-239.

[12]徐浩博,賀學禮,許偉,等.蒙古沙冬青根圍叢枝菌根和深色有隔內(nèi)生真菌的空間分布[J].貴州農(nóng)業(yè)科學,2013,41(12):105-109.

Survey Study of Wild Malania oleifera AMF and DSE

Mao Jihua1，Jia Daishun1，Jing Yuebo2，Chen Fu1，Li Rongbo2，Geng Yunfen2

(1. Camellia Research Institute of Yunnan Academy of Forestry, Guangnan,Yunnan 663300;2. Yunnan Academy of Forestry, Kunming 650201)

In order to explore the colonization of arbuscular mycorrhizal fungi (AMF) and dark septate endophyte (DSE) in root system ofMalaniaoleifera, a kind of rare and endangered wild plant species endemic to China, root samples of natural growing tree were collected from four sites of Guangnan county of Yunnan province and studied using microscopic method. The results showed that the roots ofMalaniaoleiferawere colonized by both AMF and DSE. The colonization percentages of AMF and DSE were 46.96 % and 52.69% respectively. The colonization percentage of AMF and DSE varied with sample collecting site. Among the four sites, the AMF colonization percentage ofMalaniaoleiferaroots collected from Tangpen village of Jiumo township was 70.75%, which was the highest among the four sites. The DSE colonization percentage of roots collected from Sanxiandong village of Dongbao township was 76.58%, which was the highest among all the four sites.

Arbuscular mycorrhizal fungi; Dark septate fungi;Malaniaoleifera

2016-04-20

國家林業(yè)局引進國際先進林業(yè)科學技術項目(2014-4-23)和油茶、蒜頭果的基因技術快速良種選育、高效栽培技術攻關與運用示范項目(2015IC056)共同資助

卯吉華(1984-)，女,研究實習員，主要從事經(jīng)濟林木叢枝菌根研究,E-mail:1244587886@qq.com；*通訊作者：賈代順(1974-)，男，工程師，主要從經(jīng)濟林良種繁育及高效栽培的研究。

S718.81

A

DOI.:10.13268/j.cnki.fbsic.2016.05.001