田新華，張建瑛，李京

(黑龍江省林業(yè)科學(xué)研究所，哈爾濱150081)

?

九臺(tái)晚李的組織培養(yǎng)方法

田新華，張建瑛*，李京

(黑龍江省林業(yè)科學(xué)研究所，哈爾濱150081)

以優(yōu)良李子品種九臺(tái)晚李為供試材料，通過(guò)試驗(yàn)篩選適合其苗木繁殖的培養(yǎng)基配方為：MS(改良)+6-BA1.5mg/L +NAA0.02mg/L +GA30.2 mg/L，經(jīng)此培養(yǎng)基培養(yǎng)35d的苗木平均增殖倍數(shù)7.27，平均苗高1.46cm；生根培養(yǎng)基配方為：1/2MS(改良)+IBA1.0mg/L+NAA0.2mg/L，經(jīng)此培養(yǎng)基培養(yǎng)可獲得高度適中，生根狀況良好的苗木。

九臺(tái)晚李；組織培養(yǎng)；快速繁殖

九臺(tái)晚李(PrunussalicinaLindl.‘wanhuang’)，又稱晚黃李、香蕉李，是吉林省九臺(tái)市林業(yè)局選育的適宜寒地栽培的良種[1]。其特點(diǎn)是：晚熟，9月上旬成熟；果大豐產(chǎn)，單果重可達(dá)45g, 果皮臘黃色；果肉多汁，酸甜適口，口感好，抗寒離核耐貯運(yùn)[2-4]；掛果期長(zhǎng)，抗逆性強(qiáng)。由于晚熟的特點(diǎn)，延長(zhǎng)了李子的供應(yīng)期，其經(jīng)濟(jì)效益要比中熟品種增加60%左右，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。因此，我們擬采用植物組織培養(yǎng)技術(shù)對(duì)九臺(tái)晚李優(yōu)樹(shù)展開(kāi)研究，旨在建立九臺(tái)晚李的組培快繁技術(shù)體系，為今后優(yōu)良種質(zhì)資源的繁育與保護(hù)奠定基礎(chǔ)，為種質(zhì)創(chuàng)新及種質(zhì)資源保存構(gòu)建技術(shù)平臺(tái)。

1　試驗(yàn)材料與方法

1.1試驗(yàn)材料與預(yù)處理

以我省尚志國(guó)慶村果園的九臺(tái)晚李優(yōu)良單株的休眠健壯枝條為供試材料。用濃度為100mg/L的GA3浸泡枝條，每天清水噴霧1次，水溫控制在20～22℃，約10d左右休眠腋芽開(kāi)始萌動(dòng)。

1.2外植體消毒滅菌處理

待腋芽萌發(fā)后，剪取長(zhǎng)約1.0cm左右的單芽莖段，用流水反復(fù)清洗。在超凈工作臺(tái)上進(jìn)行滅菌處理：

(1)3%的NaClO溶液滅菌10min，然后用無(wú)菌水沖洗5次。

(2)75%酒精浸泡30s，10%H2O2溶液浸泡10min，然后用無(wú)菌水沖洗5次。

(3)0.1% HgCI2溶液浸泡2min，然后無(wú)菌水沖洗5次。

(4)0.1% HgCI2溶液浸泡3min，然后用無(wú)菌水沖洗5次。

以上材料滅菌后取出，用無(wú)菌濾紙吸干材料表面多余水分。每組處理5個(gè)莖段，2次重復(fù)，5d后觀察效果。

2　試驗(yàn)方法

2.1誘導(dǎo)側(cè)芽生長(zhǎng)

以改良的MS培養(yǎng)基(1/2大量元素+1/2微量元素+有機(jī)元素+鐵鹽)為基本培養(yǎng)基，利用超凈工作臺(tái)的無(wú)菌環(huán)境，將帶有一個(gè)芽的莖段接種于MS(改良)+6-BA1.0mg/L+NAA0.2 mg/L +20g/L蔗糖+瓊脂粉6.0g/L培養(yǎng)基上(pH值調(diào)到5.8)，誘導(dǎo)芽苗生長(zhǎng)。

2.2試管苗增殖擴(kuò)繁培養(yǎng)

待莖段腋芽伸長(zhǎng)后，轉(zhuǎn)接于以MS(改良)為基本培養(yǎng)基，分別添加不同濃度激素的培養(yǎng)基中增殖擴(kuò)繁培養(yǎng)，篩選適宜九臺(tái)晚李試管苗分化增殖的培養(yǎng)基配方：

(1)MS(改良)+6-BA0.5 mg/L+NAA0.1 mg/L

(2)MS(改良)+6-BA1.0 mg/L+NAA0.2 mg/L

(3)MS(改良)+6-BA1.5mg/L+NAA0.02mg/L+GA30.2 mg/L

(4)MS(改良)+6-BA2.0 mg/L+NAA0.04 mg/L+GA30.5 mg/L

培養(yǎng)基中添加蔗糖20g/L，日產(chǎn)瓊脂粉6.0g/L，pH值調(diào)至5.8，溫度控制在白天25±1℃，夜晚22±1℃，光照強(qiáng)度2000 lx，光照時(shí)長(zhǎng)14h/d。每個(gè)處理接種5瓶，重復(fù)3次，無(wú)菌條件下培養(yǎng)35d后調(diào)查苗木的苗高、分化增值倍數(shù)。

2.3九臺(tái)晚李生根培養(yǎng)基的篩選

剪取苗高約1.0cm的單芽莖段，分別轉(zhuǎn)接于以下4種生根培養(yǎng)基：

(1)1/2MS(改良)+IBA0.5mg/L；

(2)1/2M(改良)+IBA1.0mg/L+KT0.02mg/L；

(3)1/2MS(改良)+IAA0.7mg/L；

(4)1/2MS(改良)+IBA1.0mg/L+NAA0.2mg/L

進(jìn)行試管苗生根培養(yǎng)，培養(yǎng)45d調(diào)察試驗(yàn)結(jié)果。

上述培養(yǎng)基均加蔗糖20g/L，日產(chǎn)瓊脂粉6.0g/L，pH值調(diào)至5.8。培養(yǎng)條件同上。每個(gè)處理重復(fù)3次，每個(gè)重復(fù)接種5瓶。無(wú)菌條件下培養(yǎng)35d后調(diào)查苗木的高度、生根狀況。

2.4統(tǒng)計(jì)分析方法

本試驗(yàn)采用Microsoft Excel 2003的統(tǒng)計(jì)工具進(jìn)行計(jì)算并作圖，dps7.05統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和多重比較[5]。

3　結(jié)果與分析

3.1不同滅菌時(shí)間對(duì)外植體的影響

在接種后的第三天觀察試驗(yàn)外植體的滅菌狀況，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)滅菌不徹底的莖段開(kāi)始出現(xiàn)染菌現(xiàn)象。經(jīng)0.1%氯化汞滅菌2min的試材污染率較高；經(jīng)10%H2O2滅菌10min和3%的NaClO溶液滅菌10min的試材無(wú)污染，但大部分外植體切口處出現(xiàn)褐化現(xiàn)象；0.1% HgCI2溶液滅菌3min的外植體污染較少，并沒(méi)有出現(xiàn)褐花現(xiàn)象，這說(shuō)明0.1% HgCI2溶液滅菌3min即達(dá)到滅菌的目的，又對(duì)九臺(tái)晚李外植體無(wú)損傷(見(jiàn)表1)。

表1　不同滅菌處理九臺(tái)晚李外植體的表現(xiàn)

3.2誘導(dǎo)九臺(tái)晚李側(cè)芽生長(zhǎng)

觀察結(jié)果表明，九臺(tái)晚李在MS(改良)+6-BA1.0mg/L+NAA0.2mg/L+20g/L蔗糖+瓊脂粉6.0g/L培養(yǎng)基上培養(yǎng)7d左右開(kāi)始萌動(dòng)，經(jīng)培養(yǎng)15d后節(jié)間伸長(zhǎng)、葉片展開(kāi)，培養(yǎng)25d后繁殖系數(shù)較高(平均新生芽苗數(shù)2.8個(gè))，葉片較多，芽苗生長(zhǎng)速度較快。

3.3九臺(tái)晚李試管苗的分化增殖培養(yǎng)

將經(jīng)初代培養(yǎng)的試管苗切成1.0cm左右的單芽莖段轉(zhuǎn)接入不同激素組合的增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)。通過(guò)觀察各處理培養(yǎng)35d后的試管苗可知，因激素的種類、濃度的不同，不定芽的生長(zhǎng)狀況表現(xiàn)出明顯的不同。經(jīng)方差分析結(jié)果(見(jiàn)表2)表明，對(duì)于九臺(tái)晚李而言，無(wú)論控制試管苗的苗高還是分化增殖數(shù)的主要因素均是6-BA，在一定范圍內(nèi)試管苗的分化增殖倍數(shù)隨著6-BA的使用量增多而增長(zhǎng)；但超過(guò)使用范圍就會(huì)影響苗木的縱向生長(zhǎng)及分化情況。經(jīng)Tukey法進(jìn)行多重比較分析，處理1～3培養(yǎng)的試管苗縱向生長(zhǎng)較好，與處理4培育的苗木差異顯著；對(duì)于試管苗的分化情況則以處理3、4較好，彼此差異不顯著，但與其他處理差異顯著。但是處理4由于6-BA 的使用量過(guò)高，導(dǎo)致苗木縱向生長(zhǎng)受限，試管苗表現(xiàn)叢狀生長(zhǎng)，并且有玻璃化現(xiàn)象。因此，綜合九臺(tái)晚李試管苗的生長(zhǎng)與分化情況，篩選處理(3)即：MS(改良)+6-BA1.5mg/L +NAA0.02mg/L +GA30.2 mg/L 為試管苗的分化增殖培養(yǎng)基配方。

表2　不同處理對(duì)植株地上部性狀方差分析表

表3　試管苗地上部性狀的多重比較

3.4九臺(tái)晚李試管苗的生根培養(yǎng)

表4　試管苗根部性狀方差分析表

表5　試管苗生根狀況調(diào)查統(tǒng)計(jì)表

切取苗高約1.0cm左右的單芽莖段，分別轉(zhuǎn)接于不同生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。試驗(yàn)觀察，培養(yǎng)20d左右開(kāi)始有淺綠色的根萌出。對(duì)培養(yǎng)35d的試管苗進(jìn)行方差分析表明(表4)，無(wú)論從生根苗高度還是根長(zhǎng)方面統(tǒng)計(jì)分析，處理3、4間差異均不顯著；經(jīng)Tukey法進(jìn)行多重比較結(jié)果表明(表5)，從苗木生根數(shù)量和生根長(zhǎng)度方面各處理間還是有差異的，并且處理3、4培養(yǎng)的試管苗生根狀況均好于其他處理。結(jié)合試驗(yàn)結(jié)果可以看出，九臺(tái)晚李試管苗屬于生根相對(duì)容易的植物，使用不同的激素均可生根，但生根狀況有所區(qū)別：利用激素IAA培養(yǎng)的試管苗生根較長(zhǎng)，但生根數(shù)量遜于激素IBA 1.0 mg/L培養(yǎng)的苗木，激素NAA在其他條件相同的情況下也有促進(jìn)苗木根系生長(zhǎng)的作用。

綜合生根苗木的高度生長(zhǎng)與生根狀況，我們選擇便于苗木移栽操作的培養(yǎng)基配方(即處理4)：1/2MS(改良)+IBA1.0mg/L+NAA0.2mg/L為九臺(tái)晚李試管苗的生根培養(yǎng)基，經(jīng)此培養(yǎng)基培養(yǎng)35d后可獲得高度適中，生根狀況良好的苗木。

4　討論與結(jié)論

4.1植物組織培養(yǎng)具有無(wú)性繁殖的特點(diǎn)，能較好地保持良種的優(yōu)良性狀，所用材料經(jīng)濟(jì)、繁殖系數(shù)高[6-7]；便于經(jīng)營(yíng)，縮短育種周期；在農(nóng)林業(yè)領(lǐng)域的開(kāi)拓利用獲得了巨大的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。

4.2注意枝條采集的時(shí)間，如冬季采集的休眠枝條經(jīng)水培易產(chǎn)生花芽，處理材料時(shí)盡量避免接種帶花芽的嫩枝[8]。

4.3九臺(tái)晚李外植體采用0.1%升汞消毒浸泡3min，是較合適的滅菌方法，既達(dá)到滅菌的目的，又對(duì)外植體無(wú)損傷[9,10]。

4.4通過(guò)試驗(yàn)篩選出 MS(改良) +6-BA 1.5mg/L +NAA 0.02mg/L +GA30.2 mg/L為九臺(tái)晚李的分化增殖培養(yǎng)基，經(jīng)此培養(yǎng)基培養(yǎng)35d的苗木平均增殖倍數(shù)7.27，平均苗高1.46cm；1/2MS(改良)+IBA 1.0mg/L+NAA 0.2mg/L為九臺(tái)晚李試管苗的生根培養(yǎng)基，經(jīng)此培養(yǎng)基培養(yǎng)35d后可獲得高度適中，生根狀況良好的苗木。

[1]沈靜華,曹玉良,范欣. 九臺(tái)晚李苗木培育技術(shù)[J].吉林林業(yè)科技, 2013(42):47-48.

[2]郭金玲,楊曉華,劉海榮. 黑龍江省李品種抗寒力研究[J].中國(guó)林副特產(chǎn), 2012(3):21-23.

[3]張憲志. 優(yōu)良李子品種—九臺(tái)晚李[J].吉林林業(yè)科技, 1993(6):58-59.

[4]賈新榮. 優(yōu)質(zhì)李品種簡(jiǎn)介[J].吉林農(nóng)業(yè)，2004(5):29.

[5]唐啟義,馮明光. 實(shí)用統(tǒng)計(jì)分析及其DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)[M].北京:科學(xué)出版社,2002.

[6]沈海龍.植物組織培養(yǎng)[M]. 北京：中國(guó)林業(yè)出版社,2005：79-80.

[7]張東旭,周增產(chǎn)，卜云龍，等. 植物組織培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)用研究進(jìn)展[J].北方園藝, 2011(6):209-213.

[8]田新華,吳捷，張建瑛，等. 藍(lán)靛果忍冬組織培養(yǎng)研究[J].林業(yè)科技, 2012(6):7-9.

[9]葉梅,王伯初,段傳人. 植物組織培養(yǎng)外植體褐變的研究進(jìn)展[J]. 生物技術(shù)通訊,2004, 15(4): 426-428.

[10]杜雪玲,張振霞，余如剛，等. 植物組織培養(yǎng)過(guò)程中的污染成因及其預(yù)防[J]. 草業(yè)科學(xué), 2005(1):24-27.

Tissue Culture Method of Prunus salicina Lindl.‘wanhuang’

Tian Xinhua， Zhang Jianying*，Li Jing

(Forestry Science Research Institute of Heilongjiang Province, Harbin, 150081)

This study that excellent cultivarsPrunussalicinaLindl.‘wanhuang’for experimental material, through the test screening for the seedling propagation medium formula was MS (modified) +6-BA1.5mg/L +NAA0.02mg/L +GA30.2 mg / L, the medium 35d seedling average multiplication was 7.27, average seedling height was 1.46 cm; rooting culture medium formula was 1/2MS (modified) +IBA1.0mg/L+NAA0.2mg/L, the medium can be obtained moderate height, root seedlings in good condition.

PrunussalicinaLindl.‘wanhuang’; Tissue culture; Rapid propagation

2016-07-20

森工總局應(yīng)用研究項(xiàng)目(sgzjY2015017)

田新華(1976-)，碩士，副研究員，主要從事森林培育研究,E-mail:tianjie1976@sina.com；*通訊作者：張建瑛,副研究員，碩士，主要從事森林培育方面研究。

S662.3

A

DOI.:10.13268/j.cnki.fbsic.2016.05.004