楊子榮，王　靜，許　萌，張　琇（北方民族大學 生物科學與工程學院，寧夏 銀川 750021）

木聚糖酶產(chǎn)生菌Gh-5培養(yǎng)基配方及發(fā)酵條件的優(yōu)化

楊子榮，王靜，許萌，張琇*
（北方民族大學 生物科學與工程學院，寧夏 銀川 750021）

研究培養(yǎng)基組分與發(fā)酵工藝條件對試驗菌株Gh-5產(chǎn)木聚糖酶的發(fā)酵影響，并對木聚糖酶的酶學性質(zhì)進行初步研究。結(jié)果表明，該菌最適發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基組分為甘露糖15 g/L，氯化銨10 g/L，ZnSO40.3 g/L，KH2PO40.5 g/L；最適發(fā)酵條件為溫度37℃；pH值為8.0；接種量14%；發(fā)酵培養(yǎng)生長周期36 h。木聚糖酶產(chǎn)生菌株Gh-5發(fā)酵優(yōu)化后的酶活力為114.64U/mL，較優(yōu)化前38.02U/mL提高了201.53%。木聚糖酶酶學性質(zhì)研究結(jié)果表明，木聚糖酶酶活最適pH值為8.0；最適溫度為65℃；Zn2+對木聚糖酶酶活有較好促進作用。

木聚糖酶；分離篩選；發(fā)酵優(yōu)化；酶學性質(zhì)

木聚糖（xylan）是存在于植物細胞壁中的異質(zhì)多糖，作為植物半纖維素的主要組成成分，大約占植物含量的1/3［1］。木聚糖是除了纖維素之外自然界中含量最豐富的多糖［2］。我國是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)大國，小麥、水稻、玉米、高粱等收獲后所剩秸稈既可以作為家畜的主要飼料食用［3］，又可以經(jīng)發(fā)酵生產(chǎn)能源乙醇等。秸稈中富含木聚糖，不易直接利用，經(jīng)木聚糖酶作用，可降解為可以直接利用的糖類如木糖、低聚木糖等。木聚糖酶是一類重要的木聚糖苷水解酶［4］，來源及其廣泛。已報道的能夠產(chǎn)木聚糖酶的微生物有細菌、放線菌、真菌和酵母［5］。國內(nèi)研究木聚糖酶最多的是木霉、青霉、黑曲霉和棒曲霉［6］。

木聚糖酶在飼料工業(yè)、造紙工業(yè)、能源工業(yè)以及食品醫(yī)療領(lǐng)域具有重要應(yīng)用價值，作為一種多酶體系，其酶學性質(zhì)、分子結(jié)構(gòu)、催化機制等一直是科學領(lǐng)域研究的熱點［7-11］。然而，目前的研究大多停留在實驗室，能真正投入工業(yè)生產(chǎn)的菌種寥寥無幾。滕超等［12］報道，一株嗜熱踝節(jié)菌生產(chǎn)耐熱木聚糖酶，在50℃培養(yǎng)7 d木聚糖酶酶活力高達1 002.86U/m L，但由于發(fā)酵時間長和發(fā)酵溫度高并不利于工業(yè)生產(chǎn)發(fā)酵。周秀梅［13］報道黑曲霉（Aspergillus niger ZU-06）45℃發(fā)酵5 d后，酶活力可達516U/m L，雖然菌株產(chǎn)酶活力較高，但同樣具有發(fā)酵時間較長的缺點。

因此，本研究通過對土壤中篩選出能發(fā)酵產(chǎn)生木聚糖酶的野生菌株進行培養(yǎng)基組成及發(fā)酵條件優(yōu)化，并對木聚糖酶的酶學性質(zhì)進行初步研究，以期得到高效率產(chǎn)木聚糖酶的發(fā)酵體系，為今后菌株大規(guī)模降解秸稈，發(fā)酵生產(chǎn)乙醇提供前期實驗基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1料與試劑

1.1.1株

菌株Gh-5：本實驗室分離自貴州黃平縣楓樹下土樣，作為本研究實驗菌株。

1.1.2學試劑

可溶性淀粉、K2SO4、K2HPO4、KH2PO4、MgSO4·7H2O、NaCl、FeSO4·7H2O、瓊脂、蛋白胨、酵母浸粉、麥芽糖、葡萄糖、蔗糖、甘露糖、牛肉浸粉、（NH4）2SO4、NH4Cl、NH4NO3、尿素、CaSO4、CuSO4、Fe2（SO4）3、ZnSO4、MnSO4、（Na）2SO4，所有試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：可溶性淀粉20 g/L；KNO31 g/L；K2HPO40.5 g/L；MgSO4·7H2O 0.5 g/L；NaCl 0.5 g/L；FeSO4·7H2O 0.01 g/L；瓊脂15 g/L；pH 7.2～7.4，高溫滅菌20m in。

發(fā)酵培養(yǎng)基：木聚糖10g/L；酵母膏5g/L；MgSO4·7H2O 0.2 g/L；KH2PO40.5 g/L；pH 8.0。

1.2器與設(shè)備

LRH-250恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒精密儀器有限公司；D-37520高速離心機：美國Sigma公司；UV1102II紫外分光光度計：天美（中國）科學儀器有限公司；LDZX-50KB立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；ZWY-100H恒溫培養(yǎng)振蕩器：上海智城分析儀器制造有限公司；JA5003B電子天平：上海精科天美科學儀器有限公司；Five Easy-臺式pH計：梅特勒-托利多國際股份有限公司。

1.3驗方法

1.3.1聚糖酶活力的測定

將斜面培養(yǎng)的菌株接種于25m L種子培養(yǎng)液，20℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)18 h后，吸取1m L接種于25m L發(fā)酵培養(yǎng)基（25m L/250m L），37℃、180 r/min繼續(xù)振蕩培養(yǎng)48 h，10 000 r/min離心5min，上清液即為粗酶液［14］。

采用3，5-二硝基水楊酸（dinitrosalicylic acid，DNS）法測定粗酶液的酶活力，酶活力測定、標準曲線的制作及酶活力的計算參照文獻［15］。

每分鐘從質(zhì)量濃度為5mg/m L的木聚糖溶液中降解釋放1μmol木糖所需要的酶量，定義為一個酶活力單位（U）［15］。

1.3.2養(yǎng)基配方優(yōu)化

以O(shè)D540nm值及酶活力作為考察指標，分別添加質(zhì)量濃度為10 g/L碳源（木聚糖、麥芽糖、木糖、葡萄糖、蔗糖、淀粉、甘露糖）；質(zhì)量濃度為5 g/L氮源（牛肉浸粉、蛋白胨、酵母浸粉、硫酸銨、氯化銨、硝酸銨、尿素）；質(zhì)量濃度為0.2 g/L金屬離子（K+、Ga2+、Cu2+、Mg2+、Fe2+、Zn2+、Mn2+），對產(chǎn)酶菌株發(fā)酵培養(yǎng)基配方進行優(yōu)化［16］。

以O(shè)D540nm值及酶活力作為考察指標，分別設(shè)定為碳源為（2.5g/L、5g/L、10g/L、15g/L、20g/L）、氮源為（2.5g/L、5g/L、 10g/L、15g/L、20g/L）及金屬離子為（0.1 g/L、0.2g/L、0.3g/L、0.4 g/L、0.5 g/L），進行單因素試驗，確定碳源、氮源及金屬離子的最佳添加量。

在單因素試驗基礎(chǔ)上，固定KH2PO4添加量為0.5 g/L，pH值為8.0。以O(shè)D540nm值及酶活力為參考指標，采用L9（33）正交試驗設(shè)計對菌株產(chǎn)酶培養(yǎng)基配方進行優(yōu)化，正交試驗因素與水平見表1。

表1　培養(yǎng)基配方優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonalexperiments formedium formu la optimization

1.3.3酵條件優(yōu)化

在優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基組成的基礎(chǔ)上，分別從初始pH值（3、4、5、6、7、8、9、10、11）、接種量（2%、6%、10%、14%、18%），發(fā)酵溫度（30℃、35℃、37℃、45℃、50℃）、發(fā)酵時間（6 h、12 h、18 h、24 h、30 h、36 h、42 h、48 h、54 h、60 h、66 h、72 h、78 h）進行發(fā)酵條件優(yōu)化。

1.3.4學性質(zhì)研究

pH值對酶活性的影響：分別取pH值為5.0、6.0、6.5、7.0、8.0、9.0的乙酸-乙酸鈉緩沖液（0.1mol/L）配制木聚糖底物，測定酶活。

溫度對酶活性的影響：分別在50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃條件下，測定酶活。

金屬離子對酶活的影響：測定分別含有0.001mol/L的Mg2+、Zn2+、Ca2+、Cu2+、Na+、Fe2+、Fe3+和K+底物溶液的酶活，以不含金屬離子的底物溶液測定的酶活為對照，研究金屬離子對酶活的影響。

2　結(jié)果與分析

2.1養(yǎng)基配方優(yōu)化

2.1.1源、氮源及金屬離子對發(fā)酵的影響

碳源、氮源及金屬離子對發(fā)酵的影響，結(jié)果見表2。

表2　碳源、氮源及金屬離子對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響Table 2 Effects of carbon sources，nitrogen sources and metal ions on xylanase production

由表2可知，菌株Gh-5能夠利用多種碳源，其中對甘露糖利用率最高，產(chǎn)酶最多，酶活可達238.43U/m L此外，甘露糖對Gh-5的生長最為有利，生物量最高，OD540nm達0.359。因此，甘露糖既促進菌株Gh-5的生長又使其產(chǎn)酶最多，為最佳碳源。

由表2可知，菌株Gh-5對氯化銨、胰蛋白胨和硝酸銨的利用都比較好，其中，以氯化銨為氮源，酶活力可高達28.88U/m L，生物量最高，OD540nm達0.034。因此，氯化銨既促進菌株Gh-5的生長又使其產(chǎn)酶最多，為最佳氮源。

由表2可知，Zn2+、Mg2+、Cu2+均具有促進菌株產(chǎn)酶的作用，其中Zn2+對菌株生物量及產(chǎn)酶促進效果最好，酶活17.82U/m L，OD540nm達0.017。因此，Zn2+為培養(yǎng)基中最佳的金屬離子。

2.1.2露糖、氯化銨及硫酸鋅添加量對發(fā)酵的影響

甘露糖、氯化銨及硫酸鋅添加量對發(fā)酵的影響，結(jié)果見表3。

由表3可知，菌株Gh-5的生物量及產(chǎn)酶隨培養(yǎng)基中甘露糖、氯化銨、硫酸鋅添加量的升高呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。當甘露糖添加量為15 g/L時，菌株具有最大生物量及最高酶活，分別達0.268、107.23U/m L；氯化銨添加量為10 g/L時，菌株具有最大生物量及最高酶活，分別達0.135、54.21U/m L；當硫酸鋅添加量為0.4 g/L時，菌株均具有最大生物量及最高酶活，分別達0.122、48.82U/m L；因此，甘露糖、氯化銨及硫酸鋅最佳添加量分別為15g/L、10g/L及0.4g/L。

表3　甘露糖、氯化銨及硫酸鋅添加量對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響Table 3 Effects ofmannose，ammomnia chloride and ZnSO4addition on xylanase production

2.2養(yǎng)基配方優(yōu)化正交試驗

在單因素試驗基礎(chǔ)上，固定KH2PO4為0.5 g/L，pH值為8.0。以O(shè)D540nm值及酶活力為評價指標，采用L9（33）正交試驗設(shè)計對菌株產(chǎn)酶培養(yǎng)基配方進行優(yōu)化，正交試驗結(jié)果與分析如表4所示。

由表4可知，以O(shè)D540nm作為評價指標，對結(jié)果影響順序由小到大順序為A＞B=C，即甘露糖添加量＞硫酸鋅添加量=氯化銨添加量，發(fā)酵培養(yǎng)基最佳組合是A3B3C3，即甘露糖15 g/L、氯化銨10 g/L、硫酸鋅0.5 g/L。以酶活力作為評價指標，對結(jié)果影響順序由小到大順序為A＞B=C，即甘露糖添加量＞硫酸鋅添加量=氯化銨添加量，發(fā)酵培養(yǎng)基最佳組合是A3B3C3，即甘露糖15 g/L、氯化銨10 g/L、硫酸鋅0.5 g/L。綜合考慮，最終確定最佳發(fā)酵培養(yǎng)基組合為9號試驗組，即甘露糖15 g/L、氯化銨10 g/L、硫酸鋅0.5 g/L，KH2PO40.5 g/L。在此最佳條件下，OD540nm為0.064，酶活力為48.44U/m L。

2.3酵條件優(yōu)化

2.3.1始pH值對產(chǎn)酶菌株Gh-5發(fā)酵的影響

不同初始pH對產(chǎn)酶菌株Gh-5發(fā)酵的影響，結(jié)果見圖1。

由圖1可知，隨著初始pH值增加，產(chǎn)酶菌株Gh-5發(fā)酵產(chǎn)酶活力先升高后降低。在初始pH值為8.0時，菌株產(chǎn)酶活最高，達44.47U/m L。因此，菌株Gh-5發(fā)酵最適初始pH值為8.0。

表4　培養(yǎng)基配方優(yōu)化正交試驗結(jié)果與分析Table 4 Results and analysis of orthogonalexperiments for m edium form ula optim ization

圖1　初始pH值對菌株Gh-5發(fā)酵產(chǎn)酶的影響Fig.1 Effects of initialpH on xylanase production o f strain Gh-5

2.3.2種量對產(chǎn)酶菌株Gh-5發(fā)酵的影響

不同接種量對產(chǎn)酶菌株Gh-5發(fā)酵的影響，結(jié)果見圖2。

圖2　接種量對菌株Gh-5發(fā)酵產(chǎn)酶的影響Fig.2 Effects of inoculum on xylanase produc tion of strain Gh-5

由圖2可知，產(chǎn)酶菌株Gh-5隨接種量增加，發(fā)酵產(chǎn)酶酶活先升高后降低，當接種量為14%時，發(fā)酵產(chǎn)酶效果最好，酶活力達102.71U/m L。因此，14%是菌株Gh-5的最佳接種量。

2.3.3酵溫度對產(chǎn)酶菌株Gh-5發(fā)酵培養(yǎng)的影響

不同發(fā)酵溫度對產(chǎn)酶菌株Gh-5發(fā)酵的影響，結(jié)果見圖3。

圖3　發(fā)酵溫度對菌株Gh-5發(fā)酵產(chǎn)酶的影響Fig.3 Effects of fermentation temperature on xylanase production of strain Gh-5

由圖3可知，產(chǎn)酶菌株Gh-5在37℃培養(yǎng)時，發(fā)酵產(chǎn)酶最佳，酶活力達92.93U/m L。因此，發(fā)酵最佳溫度為37℃。

2.3.4酵時間對產(chǎn)酶菌株Gh-5發(fā)酵培養(yǎng)的影響

不同發(fā)酵時間對產(chǎn)酶菌株Gh-5發(fā)酵的影響，結(jié)果見圖4。

圖4　發(fā)酵時間對菌株Gh-5發(fā)酵產(chǎn)酶的影響Fig.4 Effects of fermentation time on xylanase production of strain Gh-5

由圖4可知，菌株Gh-5隨發(fā)酵時間的延長，表現(xiàn)出酶活先升高后降低趨勢。當發(fā)酵時間為36 h時，發(fā)酵產(chǎn)酶效果最佳，酶活力達107.76U/m L。因此，發(fā)酵最佳時間為36 h。

2.4學性質(zhì)

2.4.1pH對木聚糖酶的影響

不同pH值對木聚糖酶活力的影響，結(jié)果見圖5。

圖5　pH值對木聚糖酶活力影響Fig.5 Effects of pH on xylanase activity

由圖5可知，菌株Gh-5的酶活隨pH值的升高呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢。在pH 8.0時酶活力最高，可達85U/m L?？梢?，菌株Gh-5產(chǎn)木聚糖酶在弱酸及中性pH條件下活力較高。當pH＞8.0時，木聚糖酶開始失活。

2.4.2度對木聚糖酶的影響

不同溫度對木聚糖酶活力的影響，結(jié)果見圖6。

圖6　溫度對木聚糖酶活力的影響Fig.6 Effects of temperature on xylanase activity

由圖6所示，菌株Gh-5的酶活隨溫度的升高呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢。在55～75℃時，木聚糖酶活力相對穩(wěn)定。在65℃時，木聚糖酶具有最高活力。

2.4.3屬離子對木聚糖酶的影響

不同金屬離子對木聚糖酶活力的影響，結(jié)果見圖7。

圖7　金屬離子對木聚糖酶活力的影響Fig.7 Effects ofmetal ions on xylanase activity

由圖7所示，金屬離子對產(chǎn)木聚糖酶均有促進作用，其中Zn2+對木聚糖酶活力的促進作用最明顯，比其他金屬離子高出10%～30%。

3　結(jié)論

本研究中篩選到的菌株Gh-5，最適發(fā)酵產(chǎn)酶的培養(yǎng)基為甘露糖15 g/L，氯化銨10 g/L，ZnSO40.3 g/L，KH2PO40.5 g/L；最適發(fā)酵條件溫度為37℃，pH值為8.0，接種量為14%，發(fā)酵培養(yǎng)生長周期為36h。木聚糖酶產(chǎn)生菌株Gh-5發(fā)酵優(yōu)化后的酶活力為114.64 U/m L，較優(yōu)化前38.02U/m L提高了201.53%。木聚糖酶的酶學性質(zhì)研究結(jié)果表明，木聚糖酶酶活最適pH值為8.0；最適溫度為65℃；Zn2+對木聚糖酶酶活的促進作用最好。

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OPtimization of medium formula and fermentation confitions of xylanse-producing strain GH-5

YANG Zirong，WANG Jing，XUMeng，ZHANG Xiu*
（SchoolofBiology Science and Engineering，Beifang University ofNationalities，Yinchuan750021，China）

The effectofmedium componentsand fermentation processon xylanase production by strainsGh-5 was studied，and the xylanase propertieswerestudied aswell.The resultsshowed that theoptimalmedium components forxylanase production wasmannose 15 g/L，NH4Cl10 g/L，Zn-SO40.3 g/L and KH2PO40.5 g/L；the optimalgrow th pH，tem perature，inoculum and fermentation culture grow th cyclewere 8.0，37℃，14%and 36 h，respectively.Xylanase activity was increased from 38.02U/m l to 114.64 U/m l，increased 201.53%.The xylanase properties study results showed that theoptimalpH and temperaturewere8.0 and 65℃，Zn2+had agood role in promoting enzymeactivity.

xylanase；isolation and screening；fermentation optim ization；enzymeproperty

TQ925

0254-5071（2016）01-0068-05

10．11882/j．issn．0254-5071．2016．01．015

2015-11-08

寧夏自然科學基金項目（NZ13080）；國家民委留學人員擇優(yōu)資助項目；寧夏回族自治區(qū)級研究項目（QJCX-2014-027）

楊子榮（1991-），男，本科生，研究方向為微生物能源學。

張琇（1977-），男，教授，博士，研究方向為微生物學。