趙玉紅，林洋，張智，王振宇（.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江哈爾濱50040；2.哈爾濱工業(yè)大學(xué)化工學(xué)院，黑龍江哈爾濱50090）

堿溶酸沉法提取黑木耳蛋白質(zhì)研究

趙玉紅1，林洋1，張智1，王振宇2,*
（1.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江哈爾濱150040；2.哈爾濱工業(yè)大學(xué)化工學(xué)院，黑龍江哈爾濱150090）

為優(yōu)化黑木耳蛋白質(zhì)的堿溶酸沉法提取工藝，考察料液比、提取時(shí)間、提取溫度、堿液濃度對(duì)黑木耳蛋白質(zhì)得率的影響。采用響應(yīng)面法優(yōu)化黑木耳蛋白質(zhì)提取的工藝條件。結(jié)果表明：黑木耳蛋白質(zhì)的最佳提取工藝參數(shù)為：提取溫度50℃、料液比1∶90（g/mL）、提取時(shí)間2.5 h、堿液濃度0.07 mol/L。在此最佳條件下，黑木耳蛋白質(zhì)的得率為4.52%。由此可知，堿溶酸沉法可以較好地提取黑木耳蛋白質(zhì)。

黑木耳；提??；蛋白質(zhì)；響應(yīng)面優(yōu)化

黑木耳（Auricularia auricula），又名云耳、光木耳、木菌、樹雞，木耳科木耳屬。性平味甘，具有滋補(bǔ)、潤燥、養(yǎng)血益胃、潤肺的作用［1］。常食用可益氣養(yǎng)神、滋陰潤燥，增強(qiáng)抵抗力，延年益壽。黑木耳富含蛋白質(zhì)、氨基酸、多糖、及鈣、鐵、磷等人體所需的礦物質(zhì)元素［2-5］。黑木耳作為一種營養(yǎng)豐富的食用菌，具有很高的研究和利用價(jià)值。

國內(nèi)外對(duì)黑木耳的研究主要集中在黑木耳多糖的提取和功能性質(zhì)研究［6-10］，對(duì)其含有的蛋白質(zhì)研究較少，文獻(xiàn)報(bào)道的有劉靜波等人［11］采用酶法提取黑木耳膠原蛋白，產(chǎn)品得率為1.07%；王振宇等［12］采用傳統(tǒng)水提法提取黑木耳蛋白質(zhì)，產(chǎn)品得率為2.6%。黑木耳以蛋白質(zhì)含量高、脂肪熱量低等優(yōu)勢(shì)，已成為獲取植物蛋白的新興資源，而傳統(tǒng)水提法和酶法提取的黑木耳蛋白質(zhì)的得率都較低，不利于后續(xù)應(yīng)用，因此提取方法有待進(jìn)一步改進(jìn)。常規(guī)的植物蛋白提取方法有堿溶酸沉法、酶法、非蛋白質(zhì)法、復(fù)合法等［13-15］，其中堿溶酸沉法具有簡(jiǎn)單易行、成本低、提取得率及純度較高等特點(diǎn)，目前國內(nèi)外對(duì)采用堿溶酸沉法提取黑木耳蛋白質(zhì)的研究尚鮮見報(bào)道。本文采用堿溶酸沉法提取黑木耳中蛋白質(zhì)，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法優(yōu)化黑木耳蛋白質(zhì)的提取工藝，為黑木耳蛋白質(zhì)提取效率的提高和進(jìn)一步利用提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

黑木耳：采摘自黑龍江省大興安嶺，自然風(fēng)干后粉碎過100目篩，石油醚脫脂24 h。

試劑：氫氧化鈉、石油醚、牛血清蛋白、考馬斯亮藍(lán)G-250、無水乙醇、濃磷酸，均為分析純，購于哈爾濱市盛達(dá)試劑化學(xué)有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

DK-S12型電熱恒溫水浴鍋：上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；TDL-5W型臺(tái)式低速離心機(jī)：湖南星科科學(xué)儀器有限公司；722型可見光分光光度計(jì)、YP2001N型臺(tái)秤：上海精密科學(xué)儀器有限公司；JA-2003型分析天平：上海良品儀器儀表有限公司；FW100型高速萬能粉碎機(jī)：天津市泰斯特儀器有限公司等。

1.3方法

1.3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

取0.1 mg/mL牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL分別置于6只試管中，加水至1.0 mL，之后各加入5.0 mL考馬斯亮藍(lán)G-250，振蕩，充分混合，5 min后在595 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度［16］。以蛋白質(zhì)含量為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程為y=0.007 2x+0.020 9（R2=0.997）。

1.3.2黑木耳蛋白質(zhì)得率的計(jì)算

取黑木耳粉進(jìn)行堿法提取，離心，得上清液?？捡R斯亮藍(lán)法測(cè)定上清液中蛋白質(zhì)含量，蛋白質(zhì)得率公式如下：

式中：M1：上清液中蛋白質(zhì)含量，mg/g；M2：原料質(zhì)量，mg/g。

蛋白質(zhì)沉淀率公式如下：

式中：M1：提取液中蛋白質(zhì)含量，mg/g；M2：沉淀后上清液中蛋白質(zhì)含量，mg/g。

1.3.3黑木耳蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的確定

在最佳提取條件提取黑木耳蛋白質(zhì)，將提取液分裝于50mL燒杯中，每個(gè)30mL，用1mol/LHCl調(diào)提取液pH分別為2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5。8 000 r/min離心20 min，取上清液采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，計(jì)算蛋白質(zhì)沉淀率。

1.3.4黑木耳蛋白質(zhì)提取單因素試驗(yàn)

1）提取時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)得率的影響取黑木耳粉1 g，按料液比1∶50（g/mL）加入0.06 mol/L NaOH溶液，攪拌均勻，40℃水浴，分別提取1、1.5、2、2.5、3、3.5 h。4000 r/min離心10 min，取上清液，采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定黑木耳中蛋白質(zhì)含量。

2）料液比對(duì)蛋白質(zhì)得率的影響 取黑木耳粉1 g，按不同料液比（1∶30、1∶50、1∶70、1∶90、1∶110、1∶130，g/mL）加入0.06 mol/L NaOH溶液，攪拌均勻，40℃水浴2.5 h。4000 r/min離心10 min，取上清液，采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定黑木耳中蛋白質(zhì)含量。

3）堿液濃度對(duì)蛋白質(zhì)得率的影響 取黑木耳粉1g，按料液比1∶50（g/mL）加入不同濃度（0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09 mol/L）NaOH溶液，攪拌均勻，40℃水浴2.5 h，4000 r/min離心10 min，取上清液，采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定黑木耳中蛋白質(zhì)含量。

4）提取溫度對(duì)蛋白質(zhì)得率的影響 稱取黑木耳粉1 g，按料液比1∶50（g/mL）加入0.06 mol/L NaOH溶液，攪拌均勻，不同溫度下（35、40、45、50、55、60℃）水浴提取2.5 h。4 000 r/min離心10 min，取上清液，采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定黑木耳中蛋白質(zhì)含量。

1.3.5響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以提取時(shí)間、料液比、堿液濃度為自變量，蛋白質(zhì)得率為響應(yīng)值，建立回歸方程模型。根據(jù)Design-Expert 8.0.5軟件Box-Benhnken原理采用響應(yīng)面法在三因素三水平對(duì)黑木耳蛋白質(zhì)的提取條件進(jìn)行優(yōu)化，試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案見表1。

表1 試驗(yàn)因素水平及編碼表Table 1　Vairables and levels in Box-Benhnken experimental design

2　結(jié)果與討論

2.1堿法提取黑木耳蛋白質(zhì)的單因素試驗(yàn)

2.1.1提取時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)得率的影響

提取時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)得率的影響見圖1。

圖1　提取時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)得率的影響Fig.1　The effect of extraction time on protein yield

由圖1可知，蛋白質(zhì)得率隨時(shí)間的增加增幅明顯，黑木耳蛋白質(zhì)不斷被浸提出來。當(dāng)提取時(shí)間為2.5 h時(shí)達(dá)到提取平衡，提取曲線呈現(xiàn)平緩趨勢(shì)。這與謝昊宇等應(yīng)用堿法提取青稞蛋白質(zhì)［17］結(jié)果一致。這是由于在提取初期提取時(shí)間過短，原料尚未完全與溶液接觸，此外，黑木耳粉末中的膠質(zhì)和蛋白質(zhì)結(jié)合的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)不易被破壞，蛋白質(zhì)被包容在結(jié)構(gòu)網(wǎng)內(nèi)難以分離；而提取時(shí)間過長(zhǎng)，多糖從膠質(zhì)中分離出來，增加了體系的黏度，使多糖和蛋白質(zhì)不易分離，離心效果受到影響。綜合考慮，確定黑木耳蛋白質(zhì)最佳提取時(shí)間為2.5h。

2.1.2料液比對(duì)蛋白質(zhì)得率的影響

料液比對(duì)蛋白質(zhì)得率的影響見圖2。

圖2 料液比對(duì)蛋白質(zhì)得率的影響Fig.2　The effect of in solid-liquid ratio on protein yield

由圖2可知，隨料液比的逐漸增大，蛋白質(zhì)得率增加，當(dāng)料液比達(dá)到1∶90（g/mL）時(shí)，蛋白質(zhì)得率達(dá)到最大值。原因可能是隨著溶劑體積的增加，原料在溶劑中的分散度和接觸面積增大，加速了黑木耳蛋白質(zhì)的溶出，當(dāng)繼續(xù)增大溶劑體積到一定量時(shí)，原料的接觸面積沒有很大變化，蛋白質(zhì)得率變化緩慢。與Jianmei等提取花生蛋白的結(jié)果一致［18］。由于黑木耳中富含粘性多糖，其在水溶液中能產(chǎn)生很高的粘度，阻礙蛋白質(zhì)提取中的傳質(zhì)過程，因此只有當(dāng)堿液提取的溶出效應(yīng)與粘性多糖的阻遏效應(yīng)達(dá)到平衡時(shí)，才能使蛋白質(zhì)的得率達(dá)到峰值。此外，過大的料液比會(huì)造成提取液中蛋白質(zhì)濃度偏低，不利于后續(xù)的蛋白質(zhì)絮凝沉淀，同時(shí)還會(huì)增加廢水產(chǎn)生量和處理成本。綜合考慮，確定黑木耳蛋白質(zhì)提取最佳料液比為1∶90（g/mL）。

2.1.3堿液濃度對(duì)蛋白質(zhì)得率的影響

堿液濃度對(duì)蛋白質(zhì)得率的影響見圖3。

圖3　堿液濃度對(duì)蛋白質(zhì)得率的影響Fig.3　The effect of alkali concentration on protein yield

由圖3可知，隨NaOH濃度的增加，蛋白質(zhì)得率逐漸變大，當(dāng)NaOH濃度達(dá)到0.07 mol/L時(shí)，蛋白質(zhì)得率達(dá)到最大值。這與王振斌等采用響應(yīng)面優(yōu)化芝麻餅粕蛋白的制備［19］結(jié)果一致。原因可能為黑木耳蛋白質(zhì)的溶解性隨NaOH濃度的增加而增大，但過高的NaOH濃度會(huì)使蛋白質(zhì)變性，促使美拉德反應(yīng)的發(fā)生，導(dǎo)致必須氨基酸的損失。同時(shí)降低蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價(jià)值和得率，而且會(huì)顯著增加提取液的粘度，不利于后續(xù)的離心分離，造成蛋白質(zhì)的損失較多。綜合考慮，確定黑木耳蛋白質(zhì)提取最佳NaOH濃度為0.07 mol/L。

2.1.4提取溫度對(duì)蛋白質(zhì)得率的影響

提取溫度對(duì)蛋白質(zhì)得率的影響見圖4。

圖4　提取溫度對(duì)蛋白質(zhì)得率的影響Fig.4　The effect of temperature on protein yield

由圖4可知，隨著提取溫度的增加，蛋白質(zhì)得率逐漸增大，當(dāng)溫度達(dá)50℃時(shí)，蛋白質(zhì)得率達(dá)到最大值。當(dāng)溫度高于50℃時(shí)，隨著溫度的升高，蛋白質(zhì)得率逐漸下降。這與李加興等采用堿提酸沉法提取黃秋葵蛋白質(zhì)［20］結(jié)果一致。這是由于溫度的上升使蛋白質(zhì)的構(gòu)象發(fā)生改變，分子的立體結(jié)構(gòu)變得伸展，有利于蛋白質(zhì)分子和水分子的相互作用，使蛋白質(zhì)的溶解性增大，促進(jìn)了蛋白質(zhì)的溶出。而過高的提取溫度維持蛋白質(zhì)空間構(gòu)象的次級(jí)鍵被破壞，促進(jìn)了蛋白質(zhì)分子間相互結(jié)合而形成沉淀，使得蛋白質(zhì)變性，增加了提取液的粘度，不利于蛋白質(zhì)的溶出，其得率也隨之下降。綜合考慮，確定黑木耳蛋白質(zhì)提取的最佳溫度為50℃。

2.2響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

2.2.1響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

以料液比、提取時(shí)間、堿液濃度3個(gè)因素為響應(yīng)變量，黑木耳蛋白質(zhì)得率為響應(yīng)值，采用響應(yīng)面分析法進(jìn)行三因素三水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)。響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及分析見表2。

回歸方程為：

得率 =4.516+0.1A+0.08B+0.17C+0.02AB-0.065AC-0.105BC-0.318A2-0.243B2-0.493C2

表2 響應(yīng)面分析方案與試驗(yàn)結(jié)果Table 2　Response surface analysis program with test results

表3　黑木耳蛋白質(zhì)得率回歸方差分析Table 3　Auricularia auricular protein yield regression analysis of variance

為了驗(yàn)證模型的有效性，進(jìn)行了方差分析，結(jié)果見表3。由表3可知，影響顯著因素為A、BC、B，極顯著因素為C、A2、B2、C2，AB、AC影響不顯著。在所選的各因素水平范圍內(nèi)，按照對(duì)結(jié)果的影響排序：C＞A＞B，即堿液濃度＞料液比＞提取時(shí)間。3個(gè)因素中，提取時(shí)間和堿液濃度之間存在較為顯著的交互作用。由響應(yīng)面分析得相關(guān)系數(shù)R2為0.989 0，說明黑木耳蛋白質(zhì)得率的試驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值之間有很好的擬合度。由表3方差分析的結(jié)果可以看出方程的失擬項(xiàng)不顯著，表明該方程對(duì)試驗(yàn)擬合情況好，誤差小，可用該回歸方程代替試驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)［21］。

2.2.2等高線和響應(yīng)面分析

根據(jù)黑木耳蛋白質(zhì)得率回歸模型做出相應(yīng)的二維等高曲線圖與三維球面圖，見圖5～圖7。

圖5　提取時(shí)間和料液比對(duì)蛋白質(zhì)得率的影響Fig.5　The effect of extraction time and temperature on protein yield

圖6　堿液濃度和料液比對(duì)蛋白質(zhì)得率的影響Fig.6　The effect of alkali concentration and solid-liquid ratio on protein yield

圖7　堿液濃度和提取時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)得率的影響Fig.7　The effect of alkali concentration and extraction time on protein yield

響應(yīng)面曲面坡度反映該因素對(duì)蛋白質(zhì)得率影響的強(qiáng)弱程度。等高線密度反映蛋白質(zhì)得率的變化程度，密度越大，響應(yīng)面越陡，密度越小，響應(yīng)面越平。等高線的位置與形狀反映交互作用的強(qiáng)弱，形狀趨近于橢圓形表示兩因素交互作用對(duì)蛋白質(zhì)得率影響顯著，形狀趨近于圓形表示兩因素交互作用對(duì)蛋白質(zhì)得率影響不顯著［22］。由圖5、圖6可知，隨著提取時(shí)間、料液比堿液濃度的逐漸增大，蛋白質(zhì)得率曲線呈先增加后降低趨勢(shì)，存在最高點(diǎn)，觀察圖中曲面較平滑，等高線近似圓形，說明提取時(shí)間與料液比交互作用不顯著。由圖7可知，隨堿液濃度的增加，蛋白質(zhì)得率增幅非常明顯且存在最高點(diǎn)，觀察圖中曲面較陡峭，等高線呈橢圓形，說明彼此之間交互顯著，與方差分析結(jié)果一致。由此可知，適當(dāng)增加提取時(shí)間、堿液濃度和料液比可提高其蛋白質(zhì)得率。

2.2.3驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)響應(yīng)面分析所得結(jié)果和二次多項(xiàng)式方程，利用Design-Expert軟件計(jì)算出最佳提取條件為：提取溫度50℃、料液比1∶93（g/mL）、提取時(shí)間2.57 h、堿液濃度0.0714 mol/L，此時(shí)預(yù)期蛋白質(zhì)得率為4.54%。為便于操作，將上述條件參數(shù)進(jìn)行修正為：提取溫度50℃、料液比1∶90（g/mL）、提取時(shí)間2.5h、堿液濃度0.07mol/L。根據(jù)修正后的工藝條件進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，此時(shí)黑木耳蛋白質(zhì)得率為4.52%，與理論值相比降低了0.44%，可見該模型較好地預(yù)測(cè)了試驗(yàn)結(jié)果。

3　結(jié)論

影響黑木耳蛋白質(zhì)得率的主要因素為提取時(shí)間和料液比，其次為堿液濃度和提取溫度，黑木耳蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)為pH3.5。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化得出黑木耳蛋白質(zhì)提取最佳工藝條件，為便于操作將其修正為：提取溫度50℃、料液比1∶90（g/mL）、提取時(shí)間2.5 h、堿液濃度0.07 mol/L。在此條件下，黑木耳蛋白質(zhì)得率為4.52%。劉靜波、王振宇等［11-12］采用傳統(tǒng)水提法和酶法提取黑木耳蛋白質(zhì)，產(chǎn)品得率僅為1.07%、2.6%，說明堿提酸沉法提取黑木耳蛋白質(zhì)可以有效提高其得率，是提取黑木耳蛋白質(zhì)較為適用的方法。

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Optimization of Alkali Extraction of Protein from Auricularia auricula

ZHAO Yu-hong1，LIN Yang1，ZHANG Zhi1，WANG Zhen-yu2，*
（1.College of Forestry，Northeast Forestry University，Harbin 150040，Heilongjiang，China；2.School of Chemical Engineering，Harbin Institute of Technology，Harbin 150090，Heilongjiang，China）

In order to optimize the extraction process of protein from Auricularia auricular，solid-liquid ratio，extraction time，temperature and alkali concentration were investigated for their effects.The optimal extraction conditions were explored by response surface methodology.The results showed that optimal protein extraction parameters were temperature 50℃，solid-liquid ratio 1∶90（g/mL），extraction time 2.5 h，alkali concentration 0.07mol/L.Under these conditions，the yield of protein from Auricularia auricular was 4.52%.The results indicated that this protein extraction method was distinctly effective when applied on Auricularia auricular.

Auricularia auricular；extraction；protein；response surface optimization

2015-09-25

黑龍江省應(yīng)用技術(shù)研究與開發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（GA13B202）

趙玉紅（1968—），女（漢），副教授，博士，研究方向：林特產(chǎn)品精深加工。

王振宇，教授，博士，研究方向：植物活性物質(zhì)及功能食品。