朱莉莉，周健，明紅梅，陳曉旭，姚霞，李蓉，劉禹孟（四川理工學(xué)院生物工程學(xué)院，四川自貢643000）

濃香型大曲復(fù)合功能酵母菌的篩選及鑒定

朱莉莉，周健*，明紅梅，陳曉旭，姚霞，李蓉，劉禹孟
（四川理工學(xué)院生物工程學(xué)院，四川自貢643000）

從濃香型大曲分離的酵母菌中，篩選出發(fā)酵力、酯化力和脂肪酶活力復(fù)合功能較高的菌株，為構(gòu)建濃香型大曲復(fù)合功能菌群提供重要資源。以從濃香型大曲中篩選得到的10株酵母菌為研究對象，利用脂肪酶平板鑒定法初步確認(rèn)10株酵母均具有脂肪酶功能，并對這10株酵母進(jìn)行單菌小麥固體培養(yǎng)基發(fā)酵，測定發(fā)酵產(chǎn)物發(fā)酵力、酯化力和脂肪酶活力，復(fù)篩出一株復(fù)合功能性突出的菌株J17，該菌株的發(fā)酵力為2.02 g/（g·72 h），酯化力為114.13 U，脂肪酶活力為6.37 U/g。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，J17發(fā)酵后能產(chǎn)生較為豐富的風(fēng)味物質(zhì)，經(jīng)掃描電鏡觀察結(jié)合分子生物學(xué)鑒定，J17為釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）。

濃香型大曲；發(fā)酵力；酯化力；脂肪酶活力；分子生物學(xué)鑒定

大曲是以小麥、大麥、豌豆等為原料制成的形狀較大且含有多菌酶類的曲塊［1］。大曲素有“酒骨”之稱，其含有的多種微生物及酶類在酒精發(fā)酵過程中起著重要的糖化、發(fā)酵等作用［2］。大曲微生物包括細(xì)菌、酵母、霉菌和放線菌［3］，酵母菌是產(chǎn)酒與生香的關(guān)鍵功能菌，影響白酒的出品率及其香味成分，是白酒釀造中的主要功能菌之一，對功能性酵母菌的研究勢在必行［4］。大曲中的酵母菌主要有釀酒酵母屬、假絲酵母屬、畢赤酵母屬、伊薩酵母屬、漢遜酵母屬、結(jié)合酵母屬、德巴利氏酵母屬和紅酵母屬［5］。目前，對大曲酵母菌的研究多集中在分離、篩選及鑒定方面［6-8］，對酵母復(fù)合功能研究較少。研究復(fù)合功能菌，有利于擴(kuò)大菌種的應(yīng)用范圍，即可用于單一功能強(qiáng)化大曲，還可以應(yīng)用于多功能性大曲。本研究中的復(fù)合功能包括發(fā)酵力、酯化力和脂肪酶活力3種功能，在釀酒發(fā)酵過程中，酵母菌能利用經(jīng)淀粉轉(zhuǎn)化的葡萄糖產(chǎn)生乙醇，同時(shí)酵母菌還可以產(chǎn)生多種醇、醛、酯等香味物質(zhì)［9］。酯化酶可用于白酒增香和提高出酒率［10］；而脂肪酶可分解脂肪，有利于減少原料中脂肪帶給酒體的強(qiáng)脂肪臭味和刺激感［11］。目前對于大曲中產(chǎn)脂肪酶酵母菌的研究開展較少。

本研究目的是找出發(fā)酵力、酯化力和脂肪酶活力復(fù)合功能酵母菌，能為構(gòu)建濃香型大曲復(fù)合功能菌群以及提高大曲質(zhì)量作出貢獻(xiàn)。本研究先從大曲資源中篩選發(fā)酵力、脂肪酶和酯化酶活力復(fù)合功能菌株，豐富了菌種資源，為下一步大曲復(fù)合功能菌群的構(gòu)建及優(yōu)質(zhì)曲異地化生產(chǎn)打下基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

1.1.1菌種來源

試驗(yàn)初期從濃香型大曲中篩選獲得的10株酵母菌。

1.1.2培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，pH自然。馬鈴薯去皮，切成塊煮沸30 min，然后用紗布過濾，再加入葡萄糖及瓊脂，溶化后補(bǔ)充蒸餾水至1 000 mL。

YPD培養(yǎng)基：葡萄糖20g，蛋白胨20g，酵母膏10g，溶于1000 mL蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH至5.0～5.5。

脂肪酶篩選培養(yǎng)基：橄欖油乳化液120 mL，瓊脂粉20 g，加入自來水補(bǔ)足至1 000 mL，調(diào)節(jié)pH為7.0，加入適量1.6%溴甲酚紫溶液［12］，制備橄欖油乳化液時(shí)乳化劑為2%的聚乙烯醇溶液。以橄欖油乳化劑為唯一碳源，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH，利用溴甲酚紫的變色范圍5.2（黃色）～6.8（紫色），酵母在生長代謝過程中利用橄欖油產(chǎn)生脂肪酸類物質(zhì)，使培養(yǎng)基中的pH發(fā)生變化，使培養(yǎng)基顏色發(fā)生變化，根據(jù)是否產(chǎn)生變色圈及變色圈的大小來判斷酵母產(chǎn)脂肪酶能力的大?。?3］。

小麥固體培養(yǎng)基：取80 g小麥固體培養(yǎng)基，于250 mL錐形瓶中，調(diào)節(jié)小麥原料含水量38%。

1.1.3試劑

葡萄糖、氫氧化鈉、硫酸、正己酸、無水乙醇、碘、碘化鉀、鄰苯二甲酸氫鉀、聚乙烯醇（以上試劑均為AR）：購自成都科龍化工試劑廠；溴甲酚紫（指示劑）：購自成都科龍化工試劑廠；橄欖油（化學(xué)純）：購自成都科龍化工試劑廠；酵母膏、蛋白胨、糖化酶（以上試劑均為BR）：購自成都科龍化工試劑廠；瓊脂糖和蝸牛酶（生物技術(shù)級）：購自北京索萊寶科技有限公司；DNAMaker DL1500、Taq酶：購自Takara大連寶生物工程有限公司；蛋白酶K：購自Biosharp公司；真菌26SrDNA通用引物ITS1：TCCGTAGGAACCTGCGG和ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC：由上海英濰捷基生物技術(shù)公司合成。

1.1.4主要儀器設(shè)備

SKY-2102C恒溫培養(yǎng)振蕩器：上海蘇坤實(shí)業(yè)有限公司；GZ-250-HSⅡ恒溫恒濕箱：韶關(guān)市廣智科技設(shè)備有限公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取頭、手動SPME進(jìn)樣器、15 mL帶硅橡膠墊的樣品瓶：美國Supelco公司；My Cycler型PCR儀：美國BIARAD公司；SC-805凝膠成像儀：上海山富科學(xué)儀器有限公司；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國Agilent Technologies；掃描電子顯微鏡：捷克TESCAN。

1.2方法

1.2.1平板透明圈法篩選高產(chǎn)脂肪酶活酵母

配制活化培養(yǎng)基，即PDA培養(yǎng)基，121℃滅菌30min，在無菌條件下倒入平板中，將實(shí)驗(yàn)室保藏的酵母菌，劃線接種到平板培養(yǎng)基上，放置30℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)至長出明顯的單菌落，備用。

配制脂肪酶篩選培養(yǎng)基，121℃滅菌30 min，在活化培養(yǎng)基上挑選單菌落，用滅菌的牙簽點(diǎn)接到篩選培養(yǎng)基上，放置30℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 d，觀察試驗(yàn)現(xiàn)象，挑選菌落邊緣培養(yǎng)基顏色變化明顯的平板進(jìn)行拍照，并用尺子測定菌落直徑和變色圈直徑。

1.2.2固態(tài)發(fā)酵

配制YPD培養(yǎng)基，量取100 mL于250 mL錐形瓶中，8層紗布蓋住瓶口，再用牛皮紙包扎好后于115℃下滅菌30 min，備用。從冰箱中取出斜面菌種，無菌操作臺上，在酒精燈旁，用接種環(huán)挑選適量菌落于錐形瓶中，整個(gè)過程注意無菌操作。接種好后，將錐形瓶置于恒溫?fù)u床中，30℃，150 r/min，振蕩培養(yǎng)48 h。

分裝好小麥固體培養(yǎng)基后，121℃滅菌30 min，放置1 d，無菌操作條件下，用移液槍將培養(yǎng)好的酵母種子液按10%的接種量接種到裝有80 g小麥固體培養(yǎng)基的錐形瓶中，混合均勻，將接種好的培養(yǎng)基于30℃恒溫培養(yǎng)箱中，靜置培養(yǎng)72 h，中間間歇手工振蕩。

1.2.3固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物主要功能特性分析

固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物主要功能特性：脂肪酶活力、發(fā)酵力和酯化力的測定參照文獻(xiàn)［14-15］進(jìn)行。

1.2.4固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物的揮發(fā)性成分分析

固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物的揮發(fā)性成分的測定參照文獻(xiàn)［16］進(jìn)行。

1.2.5功能酵母菌株鑒定

對篩選出的功能性突出的酵母菌株采用掃描電子顯微鏡進(jìn)行形態(tài)觀察并進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。

菌種培養(yǎng)：將篩選出的功能性菌株接種PDA液體培養(yǎng)基中，30℃，200 r/m，培養(yǎng)48 h。

DNA提取與序列測定：將上述培養(yǎng)好的種子液離心取沉淀，采用酶解法、CTAB法和反復(fù)凍融法相結(jié)合的方法提取單菌DNA，DNA溶解液進(jìn)行電泳觀察，并采用真菌26SrDNA通用引物ITS1：TCCGTAGGAACCTGCGG和 ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳后條帶亮而清晰的樣品，送上海杰李生物技術(shù)有限公司測序。

序列分析：采用序列圖譜軟件Chromas，參照正、反向序列圖譜，對序列人工校對。采用NCBI的BLAST功能將校對后的序列與GeneBank中的序列進(jìn)行比對。利用MEGA5.0軟件進(jìn)行多重序列同源性比對分析，并采用鄰接法（Neighbor-Joiningmethod）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2　結(jié)果與分析

2.1產(chǎn)脂肪酶酵母菌平板初篩

將實(shí)驗(yàn)室初期篩選自濃香型大曲的10株酵母菌，無菌條件下，點(diǎn)接到脂肪酶篩選培養(yǎng)基培養(yǎng)，觀察試驗(yàn)現(xiàn)象，培養(yǎng)3 d后將菌落周圍有顏色變化的平板進(jìn)行拍照，變色明顯的圖片如圖1所示。并測定了菌落直徑和變色圈直徑大小（分別用C和B表示），其結(jié)果如圖2。

圖1　部分產(chǎn)脂肪酶酵母菌初篩結(jié)果Fig.1　Part screening results of lipase-producing yeast

從圖1可以看出，J17、J19、J15菌落周圍的黃色較為明顯，說明產(chǎn)脂肪酶能力較強(qiáng)，另外，J1、J3、J4、J5、J6、FJ1、J10菌落周圍的黃色不明顯，說明產(chǎn)脂肪酶能力一般。

由圖2可以得到，J17的脂肪酶活力顯著高于其余6株菌株（P＜0.05）；另外，點(diǎn)接酵母J1、J6、FJ1的脂肪酶鑒定平板上菌落周圍變色圈不明顯，常規(guī)直尺不易測量。酵母點(diǎn)接到脂肪酶篩選培養(yǎng)基中，平行的3個(gè)培養(yǎng)基中酵母的生長情況基本相同。

2.2固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物復(fù)合功能特性檢測

圖2　變色圈直徑和菌落直徑比值測定結(jié)果Fig.2　The result of the measurement of diameter ratio ofcolor-change ring and colonies

通過上述平板鑒定試驗(yàn)，得到這10株酵母均具有產(chǎn)脂肪酶的能力，對這10株酵母菌進(jìn)行單菌固態(tài)發(fā)酵，30℃培養(yǎng)72 h之后，測定各菌株的發(fā)酵力、酯化力和脂肪酶活力，結(jié)果見表1，發(fā)現(xiàn)只有J10、J17和J19的脂肪酶活能檢測出，這3株菌同時(shí)還具有較高的發(fā)酵力和酯化力。另外，J10、J17和J19在發(fā)酵基質(zhì)上生長旺盛，呈現(xiàn)均勻白色點(diǎn)狀菌體，發(fā)酵基質(zhì)具有濃郁的酒香味和令人愉悅的香味，其它酵母發(fā)酵后均未產(chǎn)生令人愉悅的香味，或者無味。

表1　各菌株發(fā)酵產(chǎn)物的脂肪酶活力、發(fā)酵力和酯化力結(jié)果Table 1　The result of fermentation acitivity and esterase activity ofstrains fermentation products

由表1可知，10株酵母固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物的發(fā)酵力均大于2 g/（g·72 h），與張春林研究的中溫優(yōu)級大曲發(fā)酵力最高0.69 g/（g·72 h）［3］以及一級大曲發(fā)酵力大于1.2 g/ （g·72 h）［14］相比，本研究中的酵母菌發(fā)酵力水平較高。說明這些酵母菌產(chǎn)乙醇能力很強(qiáng)；與張春林研究的中溫優(yōu)級大曲酯化力221.8 mg/（g·100 h）以及大曲傳統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)中優(yōu)質(zhì)曲的酯化力相比，10株酵母固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物的酯化力水平一般［17］。J17固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物的脂肪酶活力最高，具有較高的轉(zhuǎn)化脂肪類物質(zhì)的能力。

綜合來看，酵母J17的復(fù)合功能較為突出，進(jìn)一步研究其揮發(fā)性發(fā)酵產(chǎn)物。

2.3固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)測定結(jié)果

對J17菌株發(fā)酵3d的固態(tài)產(chǎn)物采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)測定其中的揮發(fā)性物質(zhì)，其萃取的揮發(fā)性成分的總離子流色譜圖如圖3所示，分析鑒定出的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)如表2所示。小麥固體培養(yǎng)基中揮發(fā)性成分的總離子流色譜圖如圖4所示，分析鑒定出的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)如表3所示。

由表2和表3對比可以看出，添加了酵母菌的小麥固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物的揮發(fā)性成分與不添加菌株的小麥培養(yǎng)基揮發(fā)性成分相比發(fā)生了較大的變化，說明酵母菌及其產(chǎn)生的酶類，在一定溫度和時(shí)間的條件下，催化了小麥原料中的成分轉(zhuǎn)化形成具有濃香型大曲特征的香味物質(zhì)。酵母菌株J17發(fā)酵小麥固體培養(yǎng)基后共獲得香味物質(zhì)10種。這些香味物質(zhì)中乙酸乙酯的相對含量最高，達(dá)到57.94%，乙酸乙酯是白酒香味的重要物質(zhì)［6］，是四大酯類之一。酯類物質(zhì)相對含量最高，達(dá)到73.45%，其次是醇類，達(dá)到10.29%，其中，苯乙醇是濃香型大曲中重要的風(fēng)味成分。其他酚類物質(zhì)，例如愈創(chuàng)木酚，也是濃香型大曲中重要的香味成分的組成部分［18］。發(fā)酵物中的醇類物質(zhì)可以為酯化酶提供醇類前體物，同時(shí)，脂肪酶活力可以提供脂肪酸類前體物［19-20］?？梢?，酵母菌的發(fā)酵力、脂肪酶活力和酯化力的作用，產(chǎn)生了大曲中眾多的風(fēng)味成分。

圖3　J17發(fā)酵產(chǎn)物揮發(fā)性成分總離子流色譜圖Fig.3　The GC-MS total ion current chromatogram of volatile substance fermented by J17

圖4　小麥固體培養(yǎng)基中揮發(fā)性成分總離子流色譜圖Fig.4　The GC-MS total ion current chromatogram of volatile substance in wheat solid medium

2.4功能菌株鑒定結(jié)果

將斜面保藏菌種轉(zhuǎn)接到PDA固體平板培養(yǎng)基上，30℃恒溫培養(yǎng)24 h后，結(jié)果如圖5所示。圖5表明，該菌的形態(tài)特征為：菌落為乳白色，質(zhì)地均勻，菌體較濕潤、不透明，表面較光滑，中央有明顯凸起，易挑起，酒香氣味濃郁。

表2　J17發(fā)酵產(chǎn)物揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)測定Table 2　Determination of volatile fragrance substances of J17 fermentation products

表3　小麥固體培養(yǎng)基揮發(fā)性香味物質(zhì)測定Table 3　Determination of volatile fragrance substances in wheat solid medium

圖5J17的平板菌落圖Fig.5　Colony picture of J17

進(jìn)一步以錫箔為載體，自然干燥后，噴金，用電子掃描顯微鏡進(jìn)行觀察拍照，結(jié)果如圖6所示。經(jīng)過對J17菌體進(jìn)行DNA提取、目的片段PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增后的電泳圖，如圖7所示。將PCR產(chǎn)物送上海杰李公司測序，測序結(jié)果在GeneBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對，結(jié)果表示，菌株 J17與 Saccharomyces cerevisiae KC544486.1相似性為99%。利用Mega5.0軟件通過N-J法對菌株J17分別構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖8所示。根據(jù)菌株形態(tài)和菌株rDNA的相似性，初步鑒定J17為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。

圖6　掃描電鏡下J17的形貌圖Fig.6　Scanning electron microscape individual form diagram of J17

圖7目的片段PCR擴(kuò)增后電泳圖Fig.7　Electrophoresis after PCR amplification of purpose fragment

圖8　基于26SrDNA序列同源性構(gòu)建的菌株J17系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.8　Unrooted phylogenetic trees based on the 26S rDNA sequence of strain J17

3　結(jié)論

我國濃香型白酒是白酒香型中重要香型之一，濃香型大曲作為白酒釀造的重要微生物菌系、酶系和物系的載體，富含大量有用的微生物群落資源。本研究以從濃香型大曲中篩選得到的10株酵母菌為研究對象，利用脂肪酶平板鑒定法初步確認(rèn)這10株酵母均具有產(chǎn)脂肪酶功能，并對這10株酵母進(jìn)行單菌小麥固體培養(yǎng)基發(fā)酵，對發(fā)酵產(chǎn)物測定發(fā)酵力、酯化力和脂肪酶活力，復(fù)篩出一株復(fù)合功能性突出的菌株J17。進(jìn)一步對J17采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)測定其中的揮發(fā)性物質(zhì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這株菌發(fā)酵后能產(chǎn)生較為豐富的風(fēng)味物質(zhì)，比如乙酸乙酯、苯乙醇和愈創(chuàng)木酚等，這些物質(zhì)在濃香型白酒香味成分中占有重要位置。經(jīng)掃描電鏡觀察結(jié)合分子生物學(xué)鑒定，J17為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）?？梢?，本次研究的結(jié)果獲得了一株具有較高發(fā)酵力、酯化力和脂肪酶活力的復(fù)合功能菌株，且發(fā)酵產(chǎn)物中含有乙酸乙酯等香味成分，乙酸乙酯的形成和發(fā)酵力、酯化力之間有一定的內(nèi)在聯(lián)系。本研究中，酯化力以己酸乙酯為檢測指標(biāo)，酵母J17的酯化力一般，而其發(fā)酵產(chǎn)物中乙酸乙酯含量較高，說明該菌株產(chǎn)乙酸乙酯能力較強(qiáng)。今后以其它酯類物質(zhì)為檢測指標(biāo)研究酵母的酯化力，以充分認(rèn)知酯化酶與香味成分之間的相互關(guān)系，指導(dǎo)釀酒工藝生產(chǎn)。

研究大曲功能性菌株，充分挖掘它們的各種功能，還需要篩選多種類型的功能性細(xì)菌、酵母、霉菌，研究它們的糖化、液化、產(chǎn)酒、產(chǎn)香功能性，利用它們之間的協(xié)調(diào)性，對多種功能微生物進(jìn)行組合優(yōu)化，對提高大曲質(zhì)量具有重要的研究價(jià)值和應(yīng)用前景。

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Selection and Identification of Composite Functional Yeasts from Luzhou-flavor Daqu

ZHU Li-li，ZHOU Jian*，MING Hong-mei，CHEN Xiao-xu，YAO Xia，LI Rong，LIU Yu-meng
（College of Bioengineering，Sichuan University of Science&Engineering，Zigong 643000，Sichuan，China）

Functional strains with lipase activity，high fermentation activity and esterification force were selected from the yeasts that were isolated from Luzhou-flavor Daqu，which provided significant resources for constructing Luzhou-flavor Daqu functional microorganisms group.10 yeasts from Luzhou-flavor Daqu were researched as the objects.10 Lipase functional strains were preliminarily determine by lipase flat evaluating method，and this 10 strains were separately cultured in solid medium with wheat and fermentation activity，esterification force and lipase activity of the fermentation products were measured.The results showed that，there was a complex functional outstanding strain，number J17，with fermentation activity 2.02 g/（g·72 h），esterification force 114.13 U and lipase 6.37 U/g.The results showed that，comparatively abundant flavor components were producted after fermentation of J17.J17 belonged to Saccharomyces cerevisiae by morphological observation and identification of molecular biology.

Luzhou-flavor Daqu；fermentation activity；esterification force；lipase activity；identification of molecular biology

2015-09-11

瀘州老窖科研獎(jiǎng)學(xué)金項(xiàng)目（13ljzk04；15ljzk06）；四川省教育廳重點(diǎn)科研項(xiàng)目（15ZA0219）；四川省大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201410622004）；研究生創(chuàng)新基金（y2014021）；釀酒及生物技術(shù)四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目（NJ2014-05）

朱莉莉（1990—），女（漢），在讀研究生，研究方向：發(fā)酵工程。

周?。?963—），男，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：環(huán)境生物技術(shù)。