張澤生，王春龍，劉清岱，*，王寶林（.天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津300457；.天津豈均生物科技有限公司，天津300480）

擴(kuò)增子測(cè)序技術(shù)分析紅茶菌中優(yōu)勢(shì)微生物的研究

張澤生1，王春龍1，劉清岱1，*，王寶林2
（1.天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津300457；2.天津豈均生物科技有限公司，天津300480）

紅茶菌作為一種傳統(tǒng)健康保健飲品，由于發(fā)酵過程中需要多種微生物的參與，因此需要對(duì)混合菌種進(jìn)行高效的分離鑒定。本文通過提取紅茶菌中的基因組DNA，采用高通量測(cè)序的方法對(duì)16S rDNA和ITS的擴(kuò)增子進(jìn)行測(cè)序，實(shí)現(xiàn)對(duì)紅茶菌中優(yōu)勢(shì)微生物的分析鑒定。通過對(duì)可操作分類單元進(jìn)行豐度分析和物種分類樹統(tǒng)計(jì)，最終得到主要的細(xì)菌組成為：醋酸菌89.11%，擬桿菌5.56%，顫螺旋桿菌1.77%；優(yōu)勢(shì)真菌組成為：酵母菌為93.48%，其中嗜酒假絲酵母61.76%，酵母菌Blastobotrys adeninivorans 30.97%；α多樣性分析結(jié)果顯示：測(cè)序數(shù)據(jù)較為合理，測(cè)序數(shù)據(jù)量大，可以反映樣品中絕大多數(shù)的微生物物種信息。

紅茶菌；擴(kuò)增子測(cè)序；16S；ITS

紅茶菌是一種以糖茶水為原料，由醋酸菌、酵母菌等微生物共同發(fā)酵而制成的功能飲料，是一種純天然的健康保健飲品［1-2］。目前對(duì)于紅茶菌中混合菌種研究主要依靠傳統(tǒng)的微生物平板培養(yǎng)方法，這限制了很多微生物物種的分離鑒定，并且依賴表觀性狀對(duì)物種進(jìn)行鑒定也可能導(dǎo)致誤認(rèn)［3］。

擴(kuò)增子測(cè)序就是通過PCR擴(kuò)增，將目標(biāo)區(qū)域DNA富集后進(jìn)行高通量測(cè)序的研究策略。16S rDNA是最適于細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育和分類鑒定的指標(biāo)，采用16S rDNA擴(kuò)增子測(cè)序是利用保守區(qū)設(shè)計(jì)通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后對(duì)高變區(qū)進(jìn)行測(cè)序分析和菌種鑒定，成為研究環(huán)境樣品中微生物組成結(jié)構(gòu)的重要手段［4-5］。而對(duì)ITS擴(kuò)增子進(jìn)行測(cè)序，可以實(shí)現(xiàn)環(huán)境微生物中真菌多樣性分析。MiSeq測(cè)序系統(tǒng)采用邊合成邊測(cè)序的技術(shù)，每次運(yùn)行最多能產(chǎn)生超過7 Gb的數(shù)據(jù)。目前采用MiSeq平臺(tái)對(duì)16S rDNA和ITS的一個(gè)或多個(gè)高變區(qū)測(cè)序，具有測(cè)序深度高、利于鑒定低豐度群落物種以及費(fèi)用低的特點(diǎn)，已成為研究微生物群落多樣性的首選之策［6-7］。

本文通過提取紅茶菌中的基因組DNA，采用高通量測(cè)序的方法對(duì)16S rDNA和ITS的擴(kuò)增子進(jìn)行測(cè)序，對(duì)紅茶菌中微生物組成、種屬關(guān)系、相對(duì)豐富度以及微生物的多樣性進(jìn)行了分析鑒定。

1　材料和方法

1.1原料

紅茶菌：天津豈均生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)菌和真菌基因組DNA提取

CTAB法［8］：取1.5 mL紅茶菌，離心收集菌體，加入567μL的TE緩沖液，震蕩重懸細(xì)菌。然后，加入30 μL 10%SDS和15μL20mg/mL蛋白酶K，于37℃溫育1h，直至細(xì)菌裂解完全。加入100 μL 5mol/L NaCl和80 μL CTAB NaCl溶液，65℃溫育10 min。采用Tris飽和酚/氯仿/異戊醇（25∶24∶1，體積比）抽提，異丙醇沉淀DNA。70%乙醇洗滌沉淀1次后，將DNA溶于50 μL TE緩沖液，加入1 μL RNase A（10 mg/mL），4℃保存?zhèn)溆?。采用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)基因組DNA的純度和濃度，取適量的樣品于離心管中，使用無菌水稀釋樣品至1 ng/μL。

1.2.2PCR擴(kuò)增和高通量測(cè)序

稀釋后的基因組DNA為模板；根據(jù)測(cè)序區(qū)域的選擇，使用帶Barcode的特異引物；使用New England Biolabs公司的使用高效和高保真的酶進(jìn)行PCR，確保擴(kuò)增效率和準(zhǔn)確性。細(xì)菌的引物對(duì)應(yīng)區(qū)域：16S V4區(qū)引物為515F-806R；ITS1區(qū)引物為ITS1F-ITS2。真菌的引物對(duì)應(yīng)區(qū)域：16S V4區(qū)引物為515F-806R；ITS1區(qū)引物為ITS1F-ITS2。在30 μL的PCR反應(yīng)體系中加入15 μL的PhusionRHigh-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer、0.2 μmol/L的正向和反向引物和10 ng模板DNA進(jìn)行反應(yīng)。PCR反應(yīng)程序：98℃預(yù)變性1 min，30個(gè)循環(huán)98℃變性10 s，50℃退火30 s，72℃延伸60 s，最后72℃5 min。

PCR產(chǎn)物使用2%濃度的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，對(duì)主帶在400 bp～450 bp之間的樣品進(jìn)行進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。使用切膠回收試劑盒回收產(chǎn)物。使用建庫(kù)試劑盒進(jìn)行文庫(kù)的構(gòu)建，構(gòu)建好的文庫(kù)經(jīng)過Qubit定量和文庫(kù)檢測(cè)，合格后，使用MiSeq進(jìn)行上機(jī)測(cè)序。

1.2.3生物信息學(xué)分析

采用Illumina MiSeq/HiSeq測(cè)序平臺(tái)得到的下機(jī)數(shù)據(jù)存在一定的低質(zhì)量數(shù)據(jù)，會(huì)干擾分析的結(jié)果，因此在進(jìn)一步分析前，需要對(duì)下機(jī)數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，去除低質(zhì)量數(shù)據(jù)去除切除引物序列，再次去除低質(zhì)量數(shù)據(jù)引物不匹配、含、過短序列，最終得到的有效序列。

提取出每個(gè)操作分類單元（OUT）的代表序列后，用Uparse軟件進(jìn)行物種的分類。最后，用Qiime軟件對(duì)樣品復(fù)雜度指數(shù)進(jìn)行分析，并繪制相應(yīng)的曲線。

2　結(jié)果與分析

2.1紅茶菌16srDNA和ITS序列的擴(kuò)增

紅茶菌16s rDNA和ITS序列的擴(kuò)增見圖1。

圖1　紅茶菌16s rDNA和ITS序列的擴(kuò)增Fig.1　The amplified sequences of 16S rDNA and ITS of Kombucha

采用CTAB法提取紅茶菌中微生物基因組DNA，以其為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖電泳結(jié)果表明采用16S V4區(qū)引物和ITS1引物擴(kuò)增都得到了目的條帶，目的條帶分子量約0.5 kb，表明16S V4區(qū)和ITS1區(qū)都能得到很好的擴(kuò)增。

2.2測(cè)序信息OUT分析及物種注釋

2.2.1OUT分析

為了研究樣品的物種組成多樣性信息，用Uparse軟件［9］對(duì)所有樣品的全部序列聚類，默認(rèn)提供以97% 和95%的一致性將序列聚類成為可操作分類單元結(jié)果。在操作分類單元（OUT）構(gòu)建過程中，對(duì)不同樣品的有效序列數(shù)據(jù)，低頻數(shù)的序列和序列注釋數(shù)據(jù)等信息進(jìn)行初步統(tǒng)計(jì)，16s rDNA擴(kuò)增子序列總數(shù)為72 223；用于構(gòu)建OTUs并且獲得分類信息的Tags數(shù)目為69 092；ITS擴(kuò)增子序列總數(shù)為16 790；用于構(gòu)建操作分類單元并且獲得分類信息的序列數(shù)目為16 217；兩類微生物可操作分類單元數(shù)據(jù)量較大，滿足發(fā)酵產(chǎn)物菌群物種注釋的要求。

2.2.2物種注釋

同一操作分類單元中的序列被視為是來源于某一個(gè)相同分類單元的序列，作為一個(gè)假定的分類單元。Uparse構(gòu)建操作分類單元時(shí)會(huì)選取代表性序列（依據(jù)其算法原則，篩選的是操作分類單元中出現(xiàn)頻數(shù)最高的序列），將這些代表性序列集合用RDP Classifier［10］與GreenGene數(shù)據(jù)庫(kù)［11］對(duì)細(xì)菌進(jìn)行物種注釋分析，用Qiime中的Blast方法與Unite-INSDC數(shù)據(jù)庫(kù)［12］對(duì)真菌進(jìn)行物種注釋分析。

根據(jù)物種注釋結(jié)果，選取在門分類水平上最大相對(duì)豐度排名前十的門，生成的物種相對(duì)豐度分布柱形圖，見圖2。

圖2　細(xì)菌和真菌的物種相對(duì)豐度圖Fig.2　The chart of species relative abundance of fungus and bacteria

從圖2（a）可以看出，細(xì)菌門水平上物種的相對(duì)豐度從上往下依次為：其他，脫鐵桿菌門，梭桿菌門，醋桿菌門，放線菌，藍(lán)菌，疣微菌門，柔膜菌門，擬桿菌門，變形菌，厚壁菌門。從圖（b）可以看出，真菌門水平上物種的相對(duì)豐度從上往下依次為：其他，未分類，接合菌門，擔(dān)子菌，子囊菌。

2.2.3特定物種分類樹

基于樣品的物種分類結(jié)果，篩選特別關(guān)注的物種進(jìn)行物種分類樹統(tǒng)計(jì)［13］，見圖3。

圖3　細(xì)菌和真菌的特定物種分類樹Fig.3　The classification tree of specific species of fungus and bacteria

從圖3中，可以看出，紅茶菌中主要優(yōu)勢(shì)細(xì)菌組成為：醋酸菌89.11%，擬桿菌5.56%，顫螺旋桿菌1.77%，沃氏嗜膽菌0.84%，腸道細(xì)菌Akkermansia muciniphila 0.55%，脫硫弧菌0.54%，瘤胃球菌0.45%。優(yōu)勢(shì)真菌組成為：酵母菌為93.48%，其中嗜酒假絲酵母為61.76%，酵母菌Blastobotrys adeninivorans為30.97%；

2.3樣品α多樣性分析

α多樣性用于分析樣品內(nèi)的群落多樣性［14］，主要包含3個(gè)指標(biāo)：稀釋曲線，物種豐富度和群落多樣性。用Qiime軟件對(duì)樣品復(fù)雜度指數(shù)進(jìn)行計(jì)算并繪制的相應(yīng)的曲線，以紅茶菌中細(xì)菌為例，如圖4。

從細(xì)菌和真菌的稀釋曲線、Chao1指數(shù)曲線、香農(nóng)指數(shù)曲線可以明顯的看出，各曲線數(shù)值升高直至平滑說明測(cè)序數(shù)據(jù)較為合理，測(cè)序數(shù)據(jù)量足夠大，可以反映樣品中絕大多數(shù)的微生物物種信息。

圖4　樣品中細(xì)菌的α多樣性分析Fig.4　Alpha diversity analysis of bacteria in the sample

3　結(jié)論

紅茶菌是由醋酸菌、酵母菌等有益微生物共同自然發(fā)酵而成，難以實(shí)現(xiàn)工業(yè)化的大規(guī)模生產(chǎn)。由于紅茶菌是多菌種發(fā)酵，因此優(yōu)勢(shì)菌群以及相關(guān)的含量等還沒有系統(tǒng)全面的研究報(bào)道。隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，尤其是第二代測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)，使得微生物組學(xué)的研究更加全面和準(zhǔn)確，可獲得全面、系統(tǒng)、結(jié)構(gòu)化的微生物群落結(jié)構(gòu)信息，為紅茶菌的工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

通過對(duì)紅茶菌中細(xì)菌16S rDNA、ITS的擴(kuò)增子進(jìn)行測(cè)序分析，確定了樣品中主要優(yōu)勢(shì)細(xì)菌組成為：醋酸菌89.11%，擬桿菌5.56%，顫螺旋菌1.77%；通過ITS的擴(kuò)增子測(cè)序，結(jié)果表明主要優(yōu)勢(shì)真菌組成為：酵母菌為93.48%，其中嗜酒假絲酵母61.76%，酵母菌Blastobotrys adeninivorans 30.97%。從樣品復(fù)雜度分析可以看出，測(cè)序數(shù)據(jù)較為合理，測(cè)序數(shù)據(jù)量足夠大，可以反映樣品中絕大多數(shù)的微生物物種信息。

本文采用擴(kuò)增子測(cè)序技術(shù)方法對(duì)紅茶菌中微生物的組成、種屬關(guān)系、物種相對(duì)豐富度、群落多樣性進(jìn)行了鑒定分析，與傳統(tǒng)的方法相比準(zhǔn)確性高，穩(wěn)定性好，應(yīng)用范圍廣泛，可以為研究復(fù)合益生菌發(fā)酵飲料及發(fā)酵過程中優(yōu)勢(shì)菌群變化的方法提供參考。

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Study on Analysis of the Dominant Microorganisms in Kombucha by the Technology of Amplicon Sequencing

ZHANG Ze-sheng1，WANG Chun-long1，LIU Qing-dai1，*，WANG Bao-lin2
（1.Institute of Food Engineering and Biotechnology，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China；2.Tianjin Qijun Biotechnology Co.，Ltd.，Tianjin 300480，China）

Study on the application of the amplification sequencing technology in the research of compound bacteria fermented beverage.Taking the Kombucha beverage as an example，throught the genomic DNA extraction in oral liquid of Kombucha，amplicon sequencing of 16S rDNA and ITS using the method of high-throughput sequencing of amplicons of sequencing to analysis and identification the dominant microbial in oral liquid of Kombucha.The classification and statistics of the species by the special species classification tree，finally got the main bacteria composition：Acetobacter was 89.11%，Bacteroides was 5.56%，Oscillospira was 1.77%.The main fungus composition：Yeast was 93.48%，of which Candida ethanolica was 61.76%，Blastobotrys adeninivorans was 30.97%.The result of Alpha Diversity analysis showed that：the sequencing data was more reasonable，the sequencing data amount was large enough，can reflect most of the microbial species information in the sample.The the application of the amplification sequencing technology has advantages in the analysis of the advantages of the compound bacteria fermented beverage and the detection of the content of probiotics.

Kombucha；amplicon sequencing；16S；ITS

2015-09-01

張澤生（1956—），男（漢），教授，博士，研究方向：天然產(chǎn)物活性成分。

劉清岱（1975—），男（漢），副教授，博士，研究方向：生物化學(xué)與分子生物學(xué)。