于　洋，倪永清*

（石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆石河子832000）

干酪中腸球菌種群的遺傳差異及萬(wàn)古霉素抗性基因分析

于洋，倪永清*

（石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆石河子832000）

通過(guò)種、屬引物特異性擴(kuò)增、重復(fù)序列PCR（rep-PCR）技術(shù)和萬(wàn)古霉素抗性基因檢測(cè)對(duì)新疆北疆地區(qū)干酪樣品中球菌的遺傳結(jié)構(gòu)差異進(jìn)行分析。結(jié)果表明，15份樣品共分離52株腸球菌，包括31株耐久腸球菌（Enterococcusdurans）、18株糞腸球菌（Enterococcusfaecalis）和3株屎腸球菌（Enterococcusfaecium）。依據(jù)rep-PCR遺傳指紋帶譜分析，52株菌可以聚類(lèi)成7個(gè)群，其中4個(gè)由E.durans構(gòu)成。24株腸球菌檢測(cè)到了萬(wàn)古霉素抗性基因，17株E.durans為VanC2/C3型，4株E.faecalis為VanC1型，2株E.faecium為VanB型，只有1株E.faecium為VanA型。新疆北疆地區(qū)干酪中腸球菌種群分布較為廣泛，地域之間優(yōu)勢(shì)種群和基因型不同，同種腸球菌菌株之間存在廣泛的遺傳差異。

干酪；腸球菌；重復(fù)序列PCR；萬(wàn)古霉素

腸球菌（enterococci）屬于乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB），是一類(lèi)共生于人和其他哺乳動(dòng)物腸道的革蘭氏陽(yáng)性菌，也是人和哺乳動(dòng)物腸道菌群的重要組成。最早分離的菌株大多來(lái)自人和哺乳動(dòng)物腸道，陸續(xù)研究發(fā)現(xiàn)腸球菌廣泛分布于自然界的其他生態(tài)環(huán)境中，如健康人體的上呼吸道、口腔，甚至昆蟲(chóng)體內(nèi)［1］。除此之外，腸球菌更廣泛的存在于各種食品中，如干酪、牛奶、肉制品和蔬菜等［2］。

我國(guó)新疆北疆地區(qū)氣候季節(jié)變化明顯，有遼闊的天然牧場(chǎng)，生活在該地區(qū)的哈薩克族和維吾爾族等少數(shù)民族世代以原奶制作各種傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品，其中干酪（維語(yǔ)“庫(kù)魯特”）是生活在牧區(qū)的牧民最常見(jiàn)的食物。到目前為止，雖然關(guān)于新疆地區(qū)乳制品中乳酸菌多樣性的研究報(bào)道較多［3-6］，但針對(duì)專(zhuān)一屬的同一類(lèi)乳酸菌深入開(kāi)展群體表型和遺傳差異的研究很少。此外，由于人類(lèi)對(duì)抗生素的濫用，人們非常關(guān)注棲息于人體的腸球菌耐藥性及其致病性，對(duì)其遺傳結(jié)構(gòu)差異的研究非常深入，其中萬(wàn)古霉素抗性腸球菌（vancomycin-resistant enterococci，VRE）可攜帶相關(guān)抗性基因通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體，大大增強(qiáng)了致病風(fēng)險(xiǎn)而更加備受關(guān)注［7］。與此相比較，對(duì)于棲息于乳制品中的腸球菌，作為非主流的乳酸菌，對(duì)它們的遺傳多樣性和代謝特征、耐藥性研究報(bào)道相對(duì)較少。

本研究對(duì)新疆北疆3個(gè)地區(qū)5個(gè)縣的15份干酪樣品中的腸球菌進(jìn)行了分離篩選，在種屬特異引物鑒定的基礎(chǔ)上，采用基于聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）的兩種指紋分型技術(shù)和萬(wàn)古霉素抗性基因檢測(cè)，對(duì)不同地域來(lái)源干酪中腸球菌的種群分布和遺傳差異進(jìn)行了分析，為開(kāi)發(fā)具有特殊益生功能的、安全的腸球菌菌種資源，加工制作不同風(fēng)味、不同感官品質(zhì)的肉、乳制品的生產(chǎn)實(shí)踐提供參考依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1樣品來(lái)源及模式菌株

樣品采集自新疆北疆地區(qū)5個(gè)縣，即伊寧縣、昭蘇縣、尼勒克縣、哈巴河縣及和豐縣，每個(gè)采樣區(qū)各3份樣品，共15份。貼上標(biāo)簽，置于4℃車(chē)載冰箱內(nèi)，運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，保存于-20℃。模式菌株糞腸球菌（Enterococcus faecalis）CGMCC 1.2135T、屎腸球菌（Enterococcus faecium）CGMCC 1.2136T、耐久腸球菌（Enterococcus durans）CGMCC 1.2489T、海氏腸球菌（Enterococcus hirae）CGMCC1.2490T和鳥(niǎo)腸球菌（Enterococcus avium）CGMCC 1.2505T購(gòu)于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心（ChinaGeneralM icrobiologicalCulture Collection Center，CGMCC）；萬(wàn)古霉素抗性菌株糞腸球菌（E.faecalis）ATCC 700802、鶉雞腸球菌（Enterococcus gallinarum）ATCC 49573T和鉛黃腸球菌（Enterococcus cas seliflavu）ATCC 25788T購(gòu)于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（American for Type Culture Collection，ATCC）。

1.1.2培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基、膽汁七葉靈苷疊氮鈉（bile esculin azide，BEA）培養(yǎng)基：青島高科技園海博生物技術(shù)有限公司。

1.1.3主要試劑

PCR反應(yīng)試劑：生工生物工程（上海）有限公司；擴(kuò)增引物：上海捷瑞生物工程有限公司；脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）、不同分子質(zhì)量Marker：北京全式金生物技術(shù)（TransGen Biotech）有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

5810R高速冷凍離心機(jī)：德國(guó)Eppendorf公司；TC-512 PCR擴(kuò)增儀：英國(guó)Techne公司；PowerPacUniversal水平電泳儀、SUBCELLGT（20 cm×25 cm）電泳槽：美國(guó)Bio-Rad公司；QUANTUM-ST5凝膠成像系統(tǒng)：法國(guó)Vilber Lourmat公司。

1.3方法

1.3.1菌株的分離與純化

每份樣品取10 g加入190 m L無(wú)菌水于37℃搖床振蕩1 h制成樣品菌懸液。采用梯度稀釋法稀釋至10-5，取0.2 m L 10-3、10-4、10-5的稀釋液分別涂布于MRS和BEA選擇性瓊脂培養(yǎng)基上，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)48 h。根據(jù)菌落顏色、形態(tài)、大小進(jìn)行初步篩選，對(duì)疑似菌落繼續(xù)進(jìn)行純化培養(yǎng)，純化2～3次，直至為單一菌落。然后對(duì)單菌落進(jìn)行革蘭氏染色以及接觸酶試驗(yàn)［8］進(jìn)一步篩選疑似菌株。將篩選出的菌株液體純培養(yǎng)物補(bǔ)充20%的滅菌甘油，冷凍保存于-80℃冰箱。

1.3.2菌株DNA的提取

參考ATUL K S等［9］提取菌株DNA的方法，略有改動(dòng)。1 m L菌株純培養(yǎng)物5 000 r/m in離心3 m in，棄上清液，用磷酸緩沖液（pH 7.4）洗滌3次，無(wú)菌水洗滌1次；加入0.5 m L 6mol/L尿素和0.1m L 10%十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）重懸；37℃水浴20min，沸水浴5min；8000 r/min離心10 m in，棄上清液，加入0.1 m L 0.2 mol/L NaOH溶液37℃水浴10 min；3 000 r/m in離心3 min，吸取上清液，加入2.5倍體積的無(wú)水乙醇-20℃條件下靜置2 h；4℃條件下12 000 r/min離心15min，體積分?jǐn)?shù)為70%預(yù)冷酒精洗滌2次，最后溶解于0.1 m L TE緩沖溶液中。

1.3.3腸球菌種屬特異引物鑒定

先采用腸球菌屬特異引物（Ent1/Ent2）［7］擴(kuò)增疑似菌株確定其為腸球菌屬，模式菌株作為陽(yáng)性對(duì)照，再采用種特異引物（Fk1/Fk2、Fae1/Fae2、Dur1/Dur2、Hi1/Hi2和Av1/Av2）［7］進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，確定其具體種。屬擴(kuò)增PCR反應(yīng)程序?yàn)椋鹤冃?6℃、3 min；變性95℃、1 min，退火55℃、30 s，延伸72℃、1 min，35個(gè)循環(huán)，終延伸7 min。種擴(kuò)增PCR反應(yīng)程序?yàn)椋鹤冃?6℃、3 m in；變性95℃、1 m in，退火60℃、30s，延伸72℃、1 min，35個(gè)循環(huán)，終延伸7 min。PCR反應(yīng)體系詳見(jiàn)參考文獻(xiàn)［7］。

1.3.4rep-PCR分型

指紋圖譜所采用的引物及PCR反應(yīng)條件如表1所示，取10 μL擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠、0.5×Tris硼酸電泳緩沖液（TBE），在160 V條件下電泳2 h 15 min，凝膠用溴化乙錠（ethidium bromide，EB）染色30 min，于凝膠成像系統(tǒng)觀察。對(duì)所得基因組重復(fù)序列聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（repetitive extragenic palindromic polymerase chain reaction，rep-PCR）指紋圖譜采用GelCompar II 5.10軟件進(jìn)行分析，相似性分析采用Pearson系數(shù)，使用UPGMA輸出樹(shù)狀圖。

表1　rep-PCR引物和PCR反應(yīng)條件Table 1 Primers of rep-PCR and PCR reaction conditions

1.3.5萬(wàn)古霉素抗性基因擴(kuò)增

采用多重PCR來(lái)鑒定萬(wàn)古霉素抗性腸球菌（VRE），引物和反應(yīng)體系詳見(jiàn)文獻(xiàn)［7］，菌株E.faecium BM 4147（van A）、E.faecalis ATCC 700802（van B）、E.gallinarum ATCC 49573T（van C1）、E.casseliflavu ATCC 25788T（van C2/C3）作為陽(yáng)性對(duì)照。擴(kuò)增PCR反應(yīng)程序?yàn)椋鹤冃?4℃、3min；變性94℃、1 min，退火56℃、1 min，延伸72℃、1 min，30個(gè)循環(huán)，終延伸5 min。

2　結(jié)果與分析

2.1菌株分離鑒定及種群分布

利用MRS和BEA選擇性瓊脂培養(yǎng)基對(duì)干酪中腸球菌進(jìn)行初篩，依據(jù)菌落大小、形態(tài)和顏色，油鏡觀察以及革蘭氏染色和接觸酶試驗(yàn)對(duì)菌株進(jìn)行篩選，呈現(xiàn)球狀，革蘭氏陽(yáng)性，接觸酶陰性的疑似菌株87株。圖1顯示了部分菌株擴(kuò)增結(jié)果，經(jīng)屬特異性引物鑒定，有52株菌株鑒定結(jié)果顯示為陽(yáng)性（圖1a）屬特異引物擴(kuò)增產(chǎn)物大小為112 bp），再利用種特異性引物鑒定，52株腸球菌分別隸屬于3個(gè)種，耐久腸球菌（E.durans）31株、糞腸球菌（E.faecalis）18株和3株屎腸球菌（E.faecium）（圖1b）耐久腸球菌（E.durans）特異引物擴(kuò)增產(chǎn)物大小為295 bp，糞腸球菌（E.faecalis）特異引物擴(kuò)增產(chǎn)物大小為941 bp，屎腸球菌（E.faecium）特異引物擴(kuò)增產(chǎn)物大小為550 bp）。其中伊寧縣樣品9株（9株E.durans），昭蘇縣樣品13株（3株耐久腸球菌（E. durans），9株糞腸球菌（E.faecalis），1株屎腸球菌（E.faecium），尼勒克縣樣品12株（2株耐久腸球菌（E.durans），9株糞腸球菌（E.faecalis），1株屎腸球菌（E.faecium）），哈巴河縣10株（10株均為耐久腸球菌（E.durans）），和豐縣8株（7株耐久腸球菌（E.durans），1株屎腸球菌（E.faecium）。

圖1　部分菌株屬特異引物（a）及種特異引物（b）擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig．1 Am plification products electrophoregram of genus specific primers（a）and species specific primers（b）of partial strains

不同取樣點(diǎn)的干酪中腸球菌種群的分布情況見(jiàn)圖2。由圖2可知，伊寧縣、哈巴河縣及和豐縣樣品中的優(yōu)勢(shì)種為耐久腸球菌（E.durans），而昭蘇縣和尼勒克縣樣品的優(yōu)勢(shì)種為糞腸球菌（E.faecalis）。IRIGOYEN A等［7，11-12］研究發(fā)現(xiàn)干酪中糞腸球菌（E.faecalis）和屎腸球菌（E.faecium）是常見(jiàn)的優(yōu)勢(shì)種，也有研究表明屎腸球菌（E.faecium）和耐久腸球菌（E.durans）是干酪中的優(yōu)勢(shì)種［13］。結(jié)果表明，在完全成熟的干酪中糞腸球菌（E.faecalis）和屎腸球菌（E.faecium）占據(jù)優(yōu)勢(shì)，而耐久腸球菌（E.durans）則在未完全成熟的干酪中大量存在［14-15］。

圖2　各采樣點(diǎn)腸球菌種群的分布Fig．2 Species d istribution o f enterococci at various sam p ling points

2.2rep-PCR分型結(jié)果

為了得到準(zhǔn)確的分析，對(duì)所得52株腸球菌的rep-PCR指紋圖譜采用GelCompar II 5.10凝膠分析軟件進(jìn)行分析，輸出樹(shù)狀圖，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，引物BOXAIR擴(kuò)增產(chǎn)物的大小在300～3 000 bp之間，條帶數(shù)為2到16不等，大多數(shù)產(chǎn)物的條帶數(shù)都多于4條。引物（GTG）5擴(kuò)增產(chǎn)物的大小在100～5 000 bp之間，條帶數(shù)為3到20不等，大多數(shù)產(chǎn)物的條帶數(shù)在10條以上。

由圖3可知，52株腸球菌大約在40%的相似水平上被聚類(lèi)為7群（Cluster），ClusterⅠ為5株耐久腸球菌（E.durans），帶型相近；ClusterⅡ僅僅包括帶型極為相近的2株屎腸球菌（E.faecium）；ClusterⅢ包括4株耐久腸球菌（E.durans）和1株屎腸球菌（E.faecium），4株耐久腸球菌（E.durans）中，菌株HF3-B-1、HF3-R-6和HF3-R-3的帶型更相似，菌株ZS2-R-4的帶型與它們相差較大，尤其是BOXAIR引物擴(kuò)增圖譜中比較明顯，而另1株屎腸球菌（E.faecium）HF3-R-2也被劃分在這一組中，與另外2株屎腸球菌（E.faecium）不同，預(yù)示了該菌株獨(dú)特的遺傳結(jié)構(gòu)；ClusterⅣ由15株耐久腸球菌（E.durans）組成，在45%的相似性水平上可進(jìn)一步分為三小組，其中菌株NLK3-R-2與其它菌株的帶型相差很大，獨(dú)自成1組，菌株YN3-B-4是第二小組中差異最大的菌株；ClusterⅤ由16株帶型相近糞腸球菌（E.faecalis）組成，在45%的相似性水平上仍然可分為3小組，其中菌株NLK 3-B-4兩種指紋帶譜與其他菌株明顯不同，遺傳差異較大；ClusterⅥ僅有2株E.faecalis組成，與劃分在ClusterⅤ的所有其他糞腸球菌（E.faecalis）菌株相比，BOXAIR指紋帶譜差異更顯著，顯示了明顯的種內(nèi)遺傳差異；耐久腸球菌（E.durans）顯示了最大種內(nèi)遺傳差異，ClusterⅦ也由7株耐久腸球菌（E.durans）構(gòu)成，但與隸屬于前四組的耐久腸球菌（E.durans）相比，帶譜差異極其明顯，其中HBH3-R-2是本組遺傳差異最大的菌株。帶型統(tǒng)計(jì)顯示，31株耐久腸球菌（E.durans）有10種帶型，18株糞腸球菌（E.faecalis）有3種帶型，3株屎腸球菌（E.faecium）有2種帶型。

圖3　52株腸球菌基于rep-PCR擴(kuò)增的聚類(lèi)圖及萬(wàn)古霉素抗性腸球菌鑒定結(jié)果Fig.3 Dendrogram of 52 strains of enterococci based on rep-PCR am plification and identification results of enterococci w ith vancomycin-resistance

rep-PCR分型結(jié)果顯示3個(gè)腸球菌種間具有明顯的差異，種內(nèi)帶型多樣，存在極高的遺傳多態(tài)性，與DALBB等［16］的研究結(jié)果一致。屎腸球菌（E.faecium）和耐久腸球菌（E.durans）兩個(gè)種間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系較糞腸球菌（E.faecalis）更為接近，但作為優(yōu)勢(shì)種群的耐久腸球菌（E.durans）表現(xiàn)出更大的遺傳多態(tài)性。指紋圖譜以及綜合實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，引物（GTG）5產(chǎn)生的指紋更清晰、條帶數(shù)有較高的多樣性，擴(kuò)增效果明顯優(yōu)于引物BOXAIR的擴(kuò)增效果。因此，（GTG）5更適合于Enterococcus的遺傳差異研究，與VANCANNEYT M等［17］的研究結(jié)論基本一致。

2.3萬(wàn)古霉素抗性基因腸球菌的鑒定

本研究分離的52株腸球菌，采用4種萬(wàn)古霉素抗性基因特異引物檢測(cè)到其中24株腸球菌攜帶有萬(wàn)古霉素抗性基因，包括4種基因型，其中VanC2/C3型出現(xiàn)在17株耐久腸球菌（E.durans）中，這17株菌均來(lái)自耐久腸球菌（E.durans）構(gòu)成的ClusterⅠ、Ⅲ和Ⅳ，而同樣由耐久腸球菌（E.durans）菌株組成的ClusterⅦ中沒(méi)有檢測(cè)到（見(jiàn)圖3）。在4株糞腸球菌（E.faecalis）中檢測(cè)到VanC1型，而隸屬于ClusterⅡ的2株屎腸球菌（E.faecium）為VanB型，僅有屎腸球菌（E.faecium）HF3-R-2檢測(cè)到vanA基因（見(jiàn)圖3）。部分菌株萬(wàn)古霉素抗性基因擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖見(jiàn)圖4。由圖4可知，van A基因擴(kuò)增產(chǎn)物大小為732 bp；van B基因擴(kuò)增產(chǎn)物大小為635 bp，van C基因擴(kuò)增產(chǎn)物大小為822 bp，van C2/C3基因擴(kuò)增產(chǎn)物大小為438 bp。

圖4　部分菌株萬(wàn)古霉素抗性基因擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.4 Am plification products electrophoregram of vancomycinresistance genes of partia l strains

2株屎腸球菌（E.faecium）含有基因van B，1株屎腸球菌（E.faecium）含有基因van A，而在干酪中分布廣泛的耐久腸球菌（E.durans）和糞腸球菌（E.faecalis）種群均沒(méi)有檢測(cè)到這兩種抗性基因。迄今為止，中國(guó)的臨床環(huán)境中萬(wàn)古霉素抗性腸球菌普遍存在［18］，但是養(yǎng)殖動(dòng)物中很少報(bào)道萬(wàn)古霉素抗性腸球菌的存在。雖然可以認(rèn)為新疆地區(qū)干酪中的腸球菌有可能來(lái)自養(yǎng)殖動(dòng)物，但是干酪大部分是家庭作坊式手工加工，來(lái)自加工者自身的腸球菌也有可能進(jìn)入干酪，而且可能攜帶萬(wàn)古霉素抗性腸球菌的概率更高。本研究從干酪中篩選到的屎腸球菌（E.faecium）菌株較少，但都攜帶有萬(wàn)古霉素抗性基因，因此實(shí)驗(yàn)室后期對(duì)于屎腸球菌（E.faecium）將會(huì)進(jìn)一步關(guān)注，分離到更多的菌株，以便更全面地評(píng)價(jià)干酪、人體和動(dòng)物原奶中腸球菌的安全性，為科學(xué)評(píng)價(jià)近年來(lái)我國(guó)畜牧養(yǎng)殖業(yè)中濫用抗生素引起的耐藥基因擴(kuò)散問(wèn)題提供理論參考依據(jù)。

3　結(jié)論

與食品相關(guān)的乳酸菌中，腸球菌是最受爭(zhēng)議的一類(lèi)，最近越來(lái)越受到大家的關(guān)注，成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。本研究從新疆北疆地區(qū)5個(gè)縣的干酪樣品中分離培養(yǎng)腸球菌，采用屬、種特異引物擴(kuò)增鑒定最終確定52株腸球菌，分別屬于耐久腸球菌（E.durans）、糞腸球菌（E.faecalis）和屎腸球菌（E.faecium）這三個(gè)種。根據(jù)rep-PCR分型結(jié)果，52株菌可以聚類(lèi)成7個(gè)群，其中4個(gè)由E.durans構(gòu)成。萬(wàn)古霉素耐藥基因檢測(cè)結(jié)果顯示，24株腸球菌含有萬(wàn)古霉素耐藥基因，分屬4種基因型。

新疆北疆地區(qū)干酪中腸球菌種群分布較為廣泛，地域之間優(yōu)勢(shì)種群和基因型不同，同種內(nèi)腸球菌菌株之間存在比較廣泛的遺傳差異。在24株腸球菌中檢測(cè)到萬(wàn)古霉素抗性基因，且在兩株E.faecium中檢測(cè)到含有van B，1株E.faecium含有van A，這是國(guó)內(nèi)首次報(bào)道干酪中腸球菌檢測(cè)到有van A和van B抗性基因，本實(shí)驗(yàn)室后續(xù)會(huì)做進(jìn)一步研究。

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Genetic divergence and vancomycin-resistance genes analysis ofenterococci isolated from cheese samples

YU Yang，NI Yongqing*
（School of Food Science，Shihezi University，Shihezi 832000）

The genetic structure differences of coccus from cheese samples in the north of Xinjiang were analyzed by specific amplification of species and genus primers，rep-PCR technology and the detection of vancomycin-resistance gene.The results showed that 52 strains of enterococci were obtained from 15 samples，including 31 strains of Enterococcus durans，18 strains of Enterococcus faecalis and 3 strains of Enterococcus faecium.According to the analysis of rep-PCR genetic fingerprint spectrum，the 52 strains could be clustered into seven groups，in which four groups were constituted by E.durans.The vancomycin-resistance gene was detected from 24 strains of enterococci，in which 17 strains of E.durans were identified as VanC2/C3，4 strains of E.durans were identified as VanC1，2 strains of E.durans were identified as VanB，only one of E.durans was VanA.The enterococci strains were w idely distributed in cheese from the north of Xinjiang.The dom inant population and genotype were different between different regions.There were high genetic differences among enterococci intraspecies.

cheese；enterococci；rep-PCR；vancomycin

Q566

0254-5071（2016）05-0149-05

10．11882/j．issn．0254-5071．2016．05．031

2016-03-25

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31360001）；新疆兵團(tuán)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技攻關(guān)與成果轉(zhuǎn)化項(xiàng)目（2015AC003）

于洋（1989-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。

倪永清（1969-），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。