梅莎莎，宋恩峰，項(xiàng)　瓊

（武漢大學(xué)人民醫(yī)院中醫(yī)科，武漢　430060）

黃芪注射液對(duì)高糖介導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞NF-κB表達(dá)的影響

梅莎莎，宋恩峰，項(xiàng)瓊

（武漢大學(xué)人民醫(yī)院中醫(yī)科，武漢430060）

［目的］觀察黃芪注射液對(duì)高糖環(huán)境下腎小管上皮細(xì)胞（HK-2）核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-κB）蛋白表達(dá)的影響。［方法］傳代培養(yǎng)人近曲腎小管上皮細(xì)胞，細(xì)胞用無(wú)血清培養(yǎng)基同步化24 h后，將細(xì)胞分為5組：低糖對(duì)照組、高糖組、高糖+不同濃度黃芪注射液組（2、20、200mg/L），每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。將細(xì)胞置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至24、48、72 h，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，Western Blot方法測(cè)定細(xì)胞中NF-κB蛋白表達(dá)量。［結(jié)果］黃芪注射液干預(yù)組與高糖組細(xì)胞相比，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)較好，NF-κB蛋白表達(dá)量降低（P＜0.05），并呈劑量依賴性。［結(jié)論］高糖環(huán)境下培養(yǎng)HK-2細(xì)胞可導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)變差，NF-κB蛋白表達(dá)增加，黃芪注射液對(duì)細(xì)胞有保護(hù)作用，能降低NF-κB蛋白表達(dá)。

糖尿病腎??；腎小管上皮細(xì)胞；核轉(zhuǎn)錄因子-κB；黃芪注射液

近年來(lái)糖尿病腎病（DN）嚴(yán)重威脅著人們的健康。腎小管病變?cè)谔悄虿∧I病的發(fā)病機(jī)制中有重要作用，而高血糖可作為獨(dú)立的危險(xiǎn)因子損傷腎小管。體外高糖培養(yǎng)腎小管上皮細(xì)胞（HK-2），可激活核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）的表達(dá)，調(diào)節(jié)炎性介質(zhì)，是DN炎性反應(yīng)的中心環(huán)節(jié)，也是炎癥細(xì)胞積聚的重要特征，其表達(dá)量的增加可能誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞的凋亡，致使腎小管損傷。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為糖尿病腎病發(fā)病機(jī)制為本虛標(biāo)實(shí)之癥，治療以扶正祛邪，攻補(bǔ)兼施為主［1-3］。研究表明黃芪對(duì)NF-κB具有抑制作用，能夠降低腎炎大鼠腎皮質(zhì)NF-κB的表達(dá)，改善腎臟組織病理學(xué)損傷［4］，但黃芪注射液能否降低HK-2細(xì)胞NF-κB的表達(dá)尚不清楚。本文用黃芪注射液對(duì)高糖環(huán)境下HK-2細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，探討其是否降低NF-κB蛋白表達(dá)，保護(hù)HK-2細(xì)胞，從而起到治療糖尿病腎病的作用。

1　材料與方法

1.1材料人近端腎小管上皮細(xì)胞株（HK-2），武漢大學(xué)人民醫(yī)院腎內(nèi)科實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)；DMEM高糖、低糖培養(yǎng)液，吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司；胎牛血清，賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司；0.25%胰酶溶液、青-鏈霉素溶液、磷酸鹽緩沖液（PBS），吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司；苯甲基磧酰氟（PMSF）、RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒，碧云天；GAPDH抗體，杭州賢至生物有限公司；HRP標(biāo)記羊抗兔二抗，武漢博士德生物工程有限公司；NF-ΚBp65，Bioworlde；黃芪注射液，哈爾濱圣泰制藥股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z23020820。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)HK-2細(xì)胞用含10%胎牛血清及1%雙抗的DMEM低糖培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。倒置顯微鏡觀察細(xì)胞鋪滿瓶底約80%～90%時(shí)可進(jìn)行細(xì)胞傳代。

1.2.2細(xì)胞分組將細(xì)胞移至六孔板中培養(yǎng)至細(xì)胞融合至80%，將培養(yǎng)基換成無(wú)血清DMEM低糖培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，棄去無(wú)血清培養(yǎng)基。將細(xì)胞分為5組：1）低糖對(duì)照組（A組）：低糖培養(yǎng)基含D-葡萄糖5.5 mmol/L；2）高糖組（B組）：高糖培養(yǎng)基含D-葡萄糖25mmol/L；3）高糖+黃芪注射液小劑量組（C組）：高糖培養(yǎng)基+2mg/L黃芪注射液；4）高糖+黃芪注射液中劑量組（D組）：高糖培養(yǎng)基+20mg/L黃芪注射液；5）高糖+黃芪注射液大劑量組（E組）：高糖培養(yǎng)基+200mg/L黃芪注射液，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48、72 h，收集細(xì)胞及細(xì)胞上清液用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3細(xì)胞形態(tài)觀察倒置相差顯微鏡觀察HK-2細(xì)胞形態(tài)變化。

1.2.4Western Blot檢測(cè)NF-κB蛋白表達(dá)收集細(xì)胞，配制裂解液提取蛋白，測(cè)定蛋白濃度，將蛋白上樣進(jìn)行電泳。電泳結(jié)束后將凝膠移入轉(zhuǎn)膜緩沖液固定，按轉(zhuǎn)膜電極板陰極至陽(yáng)極方向，依次疊放濾紙、電泳凝膠、膜及濾紙。轉(zhuǎn)膜完畢后將膜置人含5%（W/V）脫脂奶粉的磷酸鹽吐溫緩沖液（PBST）中，室溫下封閉1 h。封閉液稀釋一抗，室溫下反應(yīng)2h，或4℃反應(yīng)過(guò)夜，用PBST洗滌3次，每次5min用封閉液稀釋熒光二抗，室溫下反應(yīng)30 min，用PBST洗滌3次，每次5min。每張膜滴加適量的ECL底物液，孵育數(shù)分鐘。等熒光條帶顯示清楚后，將多余的底物液用濾紙吸出，并將保鮮膜覆蓋其上，待X膠片壓片好后，依次放入顯影液、定影進(jìn)行顯影和定影。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 18.0軟件處理。所有的數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析，組間比較用LSD檢驗(yàn)，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1HK-2細(xì)胞形態(tài)變化A組細(xì)胞呈多邊形生長(zhǎng)，貼壁緊密，呈鋪路石樣排列，細(xì)胞間緊密連接，有較強(qiáng)折光性，分裂相明顯。B組細(xì)胞呈梭形生長(zhǎng)，貼壁性差，排列不規(guī)則，細(xì)胞連接松散，折光性差，分裂相及數(shù)量明顯減少。C組細(xì)胞形態(tài)較B組變化不大，貼壁性較差，折光性較差。D組細(xì)胞成梭形，呈小片散在分布，折光性較弱，細(xì)胞數(shù)量較B組多，細(xì)胞連接較松散。E組細(xì)胞成梭形，貼壁較B組好，折光性減弱，細(xì)胞數(shù)量較多，連接較緊密。見(jiàn)圖1。

2.2細(xì)胞NF-κB的表達(dá)HK-2細(xì)胞在24、48、72h 3個(gè)時(shí)間段A組中NF-κB蛋白表達(dá)量低，與B組有顯著差異（P＜0.05），表明高糖環(huán)境能誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞NF-κB蛋白表達(dá)量的增加。24 h時(shí)間段E組與B組比較有顯著性差異（P＜0.05）。48 h和72 h兩時(shí)間段C、D、E組與B組比較均有顯著性差異（P＜0.05），C、D、E組之間比較均有顯著性差異（P＜0.05）。以上結(jié)果表明，E組24 h能夠明顯抑制NF-κB蛋白表達(dá)。E、D、C組48、72 h均能夠明顯抑制NF-κB蛋白表達(dá)，且E、D、C 3組之間也有明顯差異。見(jiàn)表1。

24、48、72 h NF-κB蛋白表達(dá)以A、E、D、C、B依次增加，柱狀圖中可見(jiàn)柱高依次增加，Western條帶顏色依次加深，寬度增加。見(jiàn)圖2、圖3。

圖1 48 h各組HK-2細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變

表1 不同濃度黃芪注射液對(duì)HK-2細(xì)胞NF-κB蛋白表達(dá)的影響

表1 不同濃度黃芪注射液對(duì)HK-2細(xì)胞NF-κB蛋白表達(dá)的影響

注：與B組比較，*P＜0.05；與E組比較，#P＜0.05；與D組比較，ΔP＜0.05。

組別24 h　48 h　72 h A組　0.271 3±0.048 8　0.297 0±0.061 5　0.303 7±0.096 8 B組　0.606 3±0.091 9　0.854 0±0.030 6　0.921 7±0.057 1 C組　0.537 7±0.103 3#　0.617 7±0.009 1*#Δ　0.578 7±0.031 3*#ΔD組　0.462 3±0.071 2　0.514 0±0.022 3*#　0.469 7±0.022 7*#E組　0.371 0±0.075 0*　0.408 3±0.068 3*　0.345 3±0.031 9*

3　討論

近年來(lái)隨著糖尿病發(fā)病率的不斷升高，其常見(jiàn)并發(fā)癥糖尿病腎病發(fā)病人數(shù)也不斷上升，并引起了人們的關(guān)注。腎小球、腎小管、腎間質(zhì)的損傷是糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制，其中腎小球損傷是DN的主要發(fā)病機(jī)制，近年研究發(fā)現(xiàn)腎小管損傷可能早于腎小球損傷，在DN患者蛋白尿排泄率正常時(shí)可能就已經(jīng)發(fā)生了腎小管的損傷。腎間質(zhì)纖維化和腎功能與腎小管病變聯(lián)系密切，其密切程度優(yōu)于腎小球硬化與腎功能的關(guān)系。

圖2　依次為24、48、72 h不同濃度黃芪注射液對(duì)HK-2細(xì)胞NF-κB蛋白表達(dá)的影響

在糖尿病腎病發(fā)病過(guò)程中腎小管損傷的發(fā)生主要見(jiàn)于以下幾方面：1）腎小管上皮細(xì)胞的凋亡。有研究表明對(duì)DN患者取腎臟組織進(jìn)行病理檢查發(fā)現(xiàn)腎小管及腎小球細(xì)胞都有明顯凋亡，腎小管的凋亡程度與糖尿病病程及低密度脂蛋白膽固醇有相關(guān)性［5］。2）糖尿病腎病發(fā)病過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量細(xì)胞因子及細(xì)胞產(chǎn)物，可導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞肥大，腎小管基底膜受損及細(xì)胞外基質(zhì)堆積，這些細(xì)胞產(chǎn)物及因子主要包括血管緊張素Ⅱ、活性氧簇（ROS）、晚期糖基化終末產(chǎn)物、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β等。3）炎癥反應(yīng)。炎癥反應(yīng)對(duì)腎小管及腎間質(zhì)的損傷有重要作用。4）腎小管間質(zhì)纖維化。各種促進(jìn)腎小管纖維化因子對(duì)糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展有重要作用，如結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（CTGF）、NF-κB、單核細(xì)胞趨化蛋白（MCP-1）等。

圖3　依次為24、48、72h不同濃度黃芪注射液對(duì)HK-2細(xì)胞NF-κB表達(dá)的影響

腎小管上皮細(xì)胞的損傷在多種腎臟病的進(jìn)展中發(fā)揮著重要作用［6］，該細(xì)胞被各種因素激活后可產(chǎn)生大量細(xì)胞因子及炎癥介質(zhì)，如白介素、腫瘤壞死因子、趨化因子、黏附分子等［7］。NF-κB在腎小管損傷中表達(dá)明顯增加，可調(diào)控免疫因子及轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，參與炎癥、纖維化及細(xì)胞凋亡的過(guò)程。在腎臟組織中NF-κB主要表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞［8］。NF-κB在細(xì)胞中為無(wú)活性狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞受到刺激后，即以激活狀態(tài)存在，并發(fā)揮其調(diào)控作用［9］。糖尿病腎病發(fā)病過(guò)程中NF-κB為炎癥信號(hào)的主要傳導(dǎo)通路［10］。有研究發(fā)現(xiàn)抑制NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)通路，可減輕糖尿病小鼠腎臟病變［11］，而激活NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)通路，則可誘導(dǎo)炎癥因子的釋放及巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，促進(jìn)糖尿病腎病的發(fā)病進(jìn)程，其中高糖環(huán)境是常見(jiàn)的激活該通路的因素之一［12］。

在糖尿病腎病發(fā)病過(guò)程中高血糖是一個(gè)重要的獨(dú)立危險(xiǎn)因子，有研究證明長(zhǎng)期高血糖誘發(fā)糖尿病腎病，從20世紀(jì)80年代開(kāi)始的兩個(gè)研究—糖尿病前瞻性研究和糖尿病控制與并發(fā)癥實(shí)驗(yàn)都得出結(jié)論：控制高血糖可以減少DN的發(fā)生［13-14］。常規(guī)體外培養(yǎng)近端腎小管上皮細(xì)胞發(fā)現(xiàn)NF-κB蛋白主要表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞的胞漿中，且為無(wú)活性狀態(tài)，而在培養(yǎng)基中加入高濃度葡萄糖后發(fā)現(xiàn)NF-κB蛋白表達(dá)活性增強(qiáng)，并與培養(yǎng)的時(shí)間成正相關(guān)，表明高糖能夠誘導(dǎo)NF-κB蛋白及基因的表達(dá)［15］。NF-κB表達(dá)的增加可能誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞的凋亡，致使腎小管損傷。本實(shí)驗(yàn)中高糖組NF-κB蛋白表達(dá)及細(xì)胞凋亡率明顯較正常對(duì)照組高，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。

黃芪是是補(bǔ)氣的傳統(tǒng)中藥。黃芪歸脾、肺經(jīng)，性味甘溫，有益氣固表，托毒生肌，利水消腫等作用。黃芪主要用于治療氣虛乏力，中氣下陷，久瀉脫肛，便血崩漏，表虛自汗，氣虛水腫，癰疽難潰，久潰不斂，血虛萎黃，內(nèi)熱消渴。在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)領(lǐng)域主要治療糖尿病、慢性腎炎、冠心病、心力衰竭、腦梗死等。藥理實(shí)驗(yàn)表明黃芪能增加機(jī)體免疫力，還具有清除體內(nèi)自由基抗衰老作用，對(duì)肝臟也有一定的保護(hù)作用，對(duì)人體多個(gè)系統(tǒng)都有影響，如泌尿系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、血液系統(tǒng)及中樞神經(jīng)系統(tǒng)。

黃芪注射液的有效成分是黃芪甲甙，從黃芪草本植物中提取出來(lái)。黃芪的主要有效成分是黃酮類、氨基酸類、多糖類、皂苷類等，但黃芪注射液的具體組成成分還不明確，現(xiàn)在大多數(shù)研究認(rèn)為皂苷類、黃芪多糖及大量微量元素是黃芪注射液的有效治療成分，其中多糖成分是重要的免疫活性物質(zhì)，微量元素可以調(diào)節(jié)機(jī)體的元素失調(diào)。黃芪注射液的治療作用與黃芪基本相似，有益氣養(yǎng)元、扶正祛邪、養(yǎng)心通脈、健脾利濕等作用?？捎糜谥委煵《拘孕募⊙?、心力衰竭、免疫力低下導(dǎo)致的慢性活動(dòng)性肝炎、慢性肝炎、白細(xì)胞減少癥、血小板減少性紫癜、慢性腎炎、腎病綜合征、糖尿病腎病等。

研究發(fā)現(xiàn)黃芪注射液能夠明顯降低腎炎大鼠腎皮質(zhì)NF-κB的表達(dá)［16］。新生兒窒息血清誘導(dǎo)人近曲小管上皮細(xì)胞損傷后，NF-κB核轉(zhuǎn)位增加顯著，用黃芪注射液干預(yù)后能夠明顯抑制NF-κB的激活，降低其表達(dá)［17］。黃芪注射液不僅對(duì)腎臟組織有抑制NF-κB的作用，對(duì)其他組織細(xì)胞也有抑制作用。黃芪注射液可通過(guò)提高肺組織熱休克蛋白70的表達(dá)，抑制NF-κB活性，并下調(diào)一系列炎癥因子TNF-α、IL-6，以減輕炎癥反應(yīng)，起到對(duì)肺臟的保護(hù)作用［18］。黃芪注射液能夠明顯抑制大鼠胰腺炎胰腺組織中NF-κB蛋白表達(dá)，抑制急性胰腺炎的發(fā)展及損傷［19］。黃芪注射液還能夠抑制膿毒血癥大鼠腎臟組織中NF-κB蛋白的表達(dá)，對(duì)大鼠腎臟有保護(hù)作用［20］。

本實(shí)驗(yàn)用高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)HK-2細(xì)胞，不同時(shí)間點(diǎn)測(cè)定細(xì)胞內(nèi)NF-κB蛋白含量，以此證明高糖環(huán)境能誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞中NF-κB蛋白表達(dá)，高糖環(huán)境下HK-2細(xì)胞形態(tài)也發(fā)生明顯變化，A組與B組比較發(fā)現(xiàn)細(xì)胞在高糖環(huán)境下生長(zhǎng)狀態(tài)較低糖組差，生長(zhǎng)緩慢，貼壁性差，細(xì)胞密度減小，分裂相減少，折光性減弱，形態(tài)由正常鋪路石樣變?yōu)殚L(zhǎng)梭形。表1可見(jiàn)在24、48、72 h 3個(gè)時(shí)間點(diǎn)，B組NF-κB蛋白表達(dá)較A組明顯增加，表明高糖環(huán)境能夠誘導(dǎo)NF-κB蛋白表達(dá)。黃芪注射液干預(yù)組則表現(xiàn)為對(duì)NF-κB蛋白表達(dá)的抑制作用。

黃芪注射液可通過(guò)抑制NF-κB表達(dá)，對(duì)HK-2細(xì)胞起到保護(hù)作用，但黃芪注射液作為中藥提取物，其成分復(fù)雜，對(duì)HK-2細(xì)胞有保護(hù)作用的成分并不十分清楚，所以還有待進(jìn)一步研究，以明確黃芪注射液的具體作用機(jī)制，為臨床治療糖尿病腎病提供依據(jù)。

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［20］沈建明，沈蕾，天少江，等.黃芪注射液對(duì)膿毒癥大鼠急性腎損傷的保護(hù)作用［J］.重慶醫(yī)學(xué)，2011，40（16）:1619-1621.

Influenceof Astragaluson expression of nuclear factor-κB induced by high glucose in human proximal renal tubular epithelialcells

MEISha-sha，SONGEn-feng，XIANGQiong
（Departmentof traditional Chinesemedicine，Renmin HospitalofWuhan University，Wuhan 430060，China）

［Objective］To investigate the influence of Astragalus on expression of nuclear factor-κb（NF-κB）induced by high glucose in human proximal renal tubular epithelial cells（HK-2）.［M ethods］Human renal proximal tubular cellswere cultured and divided into five groups:low glucose as control group；high glucose group；astragalus pretreatment group with concentration of 2μg/mL，20μg/mL and 200μg/mL.Each group has three samples. Culturing in 37℃ incubator for 24 hours，48 hours and 72 hours，inverted microscope observe the cells.The expression levelof NF-κB protein wasdetected byWestern blotting.［Results］Compared with high glucose groups，the drug intervention groups groupedmore better，expressed NF-κB protein levelwas lower（P＜0.05），and the effect of astragaluswere showed in dose-dependentmanner.［Conclusion］High glucosemay induce HK-2 cells to express NF-κB and decrease growth.Astragalus has protective effect to HK-2 cells by inhibiting HK-2 cells expression of NF-κB.

diabetic nephropathy；renal tubularepithelialcell；nuclear factor-κB；Astragalus

R587.1

A

1673-9043（2016）04-0253-05

10.11656/j.issn.1673-9043.2016.04.09

梅莎莎（1986-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)樘悄虿∧I病的發(fā)病機(jī)制及中西醫(yī)結(jié)合治療。

宋恩峰，E-mail:songef@126.com。

2016-04-15）