馬樹杰，李雪嬌，馬志卿,2，張　興,2

(1 西北農(nóng)林科技大學(xué) 無公害農(nóng)藥研究服務(wù)中心，陜西 楊凌 712100；2 陜西省生物農(nóng)藥工程技術(shù)研究中心，陜西 楊凌 712100)

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中國粗榧?xì)⑾x活性初步研究

馬樹杰1，李雪嬌1，馬志卿1,2，張興1,2

(1 西北農(nóng)林科技大學(xué) 無公害農(nóng)藥研究服務(wù)中心，陜西 楊凌 712100；2 陜西省生物農(nóng)藥工程技術(shù)研究中心，陜西 楊凌 712100)

【目的】 明確中國粗榧的殺蟲活性并初步探索其活性成分分離條件，為進(jìn)一步深入研究中國粗榧的殺蟲作用奠定基礎(chǔ)?！痉椒ā?采用室內(nèi)生物活性測定方法，評價(jià)中國粗榧丙酮提取物對小菜蛾、粘蟲、玉米象、淡色庫蚊、家蠅、煙蚜和酢漿草茹葉螨等7種重要害蟲的殺蟲活性；并以粘蟲3齡幼蟲為試蟲，采用活性追蹤初步探索中國粗榧中殺蟲活性成分的分離條件?！窘Y(jié)果】 中國粗榧丙酮提取物對供試的7種重要害蟲均具有一定的生物活性，其中對小菜蛾和粘蟲幼蟲的殺蟲活性較好，處理48 h后，其對小菜蛾3齡幼蟲的胃毒致死中濃度(LC50)為74.94 mg/mL，拒食中濃度(AFC50)為45.39 mg/mL，對粘蟲3 齡幼蟲的胃毒LC50為 562.28 mg/mL，AFC50為 71.96 mg/mL；處理24 h后，對粘蟲3 齡幼蟲的觸殺致死中量(LD50)為0.22 mg/頭；初步分離結(jié)果表明，中國粗榧?xì)⑾x活性成分主要集中在石油醚萃取物中的Y5和Y6組分中，點(diǎn)滴量為0.05 μg/頭時(shí)，其觸殺死亡率均為100%?！窘Y(jié)論】 中國粗榧丙酮提取物具有較好的殺蟲活性，其作用方式表現(xiàn)為拒食、胃毒及觸殺，活性成分主要是非極性親脂物質(zhì)。

中國粗榧；小菜蛾；粘蟲；殺蟲活性；植物源農(nóng)藥

篩選和評價(jià)植物資源的殺蟲活性是植物源農(nóng)藥研發(fā)的重要基礎(chǔ)性工作[1-2]。西北農(nóng)林科技大學(xué)無公害農(nóng)藥研究服務(wù)中心在對西北地區(qū)殺蟲活性植物廣泛篩選時(shí)發(fā)現(xiàn)，中國粗榧(Cephalotaxussinensis)對粘蟲具有較強(qiáng)的拒食和胃毒活性[3]，有進(jìn)一步研究價(jià)值。中國粗榧隸屬三尖杉科三尖杉屬，該科僅三尖杉屬1屬，有9個(gè)種，中國產(chǎn)7種3變種及1引種栽培變種[4-5]。在我國民間，三尖杉屬植物常被作為消積驅(qū)蟲藥，同時(shí)具有消炎、潤肺的功能，主治蛔蟲病、鉤蟲病、食積等病癥[6]。20世紀(jì)60年代，Powell等[7]首次發(fā)現(xiàn)三尖杉屬植物中的三尖杉酯堿類化合物具有抑制小鼠白血病細(xì)胞生長的作用，之后國內(nèi)外對三尖杉屬植物的化學(xué)成分、藥用活性及活性化合物合成開展了廣泛研究[8-10]。然而，目前有關(guān)該植物殺蟲活性的相關(guān)研究尚未見系統(tǒng)報(bào)道。

因此，本研究采用室內(nèi)生物活性測定方法，評價(jià)了中國粗榧丙酮提取物對小菜蛾(Plutellaxylostella)、粘蟲(Mythimnaseparata)、玉米象(Sitophiluszeamais)、淡色庫蚊(Culexpipienspallens)、家蠅(Muscadomestica)、煙蚜(Myzuspersicae)和酢漿草茹葉螨(Tetranychinahani)等7種重要害蟲的殺蟲活性；并以粘蟲3齡幼蟲為試蟲，采用活性追蹤法探索了中國粗榧中殺蟲活性成分的初步分離條件，以期為進(jìn)一步深入研究該植物的殺蟲作用奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1供試材料

1.1.1供試植物樣品中國粗榧2011年8月采自陜西省眉縣營頭林場，由西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院李琰博士鑒定，取其枝葉，置于室內(nèi)通風(fēng)處陰干后，于40 ℃恒溫烘干，粉碎后過孔徑0.425 mm篩，放入密封袋中備用。

1.1.2供試?yán)ハx小菜蛾、粘蟲、玉米象、淡色庫蚊和家蠅均為室內(nèi)(溫度(26±1) ℃，相對濕度(65±5)%，光/暗周期為12 h/12 h)長期飼養(yǎng)的敏感品系，由西北農(nóng)林科技大學(xué)無公害農(nóng)藥研究服務(wù)中心養(yǎng)蟲室提供。分別選擇小菜蛾、粘蟲和淡色庫蚊的3齡幼蟲及玉米象和家蠅成蟲用于試驗(yàn)，試蟲個(gè)體大小一致、健康活潑。

煙蚜和酢漿草茹葉螨采自西北農(nóng)林科技大學(xué)無公害農(nóng)藥研究服務(wù)中心溫室，選取大小一致、健康活潑的無翅成蚜或成螨供試。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1中國粗榧提取物的制備采用超聲波法[11]進(jìn)行試驗(yàn)。稱取植物干粉300 g，加入丙酮(料(g)液(mL)比為1∶10)進(jìn)行超聲波提取，每次30 min，重復(fù)提取3次；過濾，濾液在50 ℃減壓蒸餾濃縮，即得到20.32 g丙酮浸膏，置于4 ℃冰箱內(nèi)保存，用于殺蟲活性測定。

1.2.2中國粗榧?xì)⑾x活性的追蹤以粘蟲3齡幼蟲為試蟲進(jìn)行活性追蹤試驗(yàn)。取上述浸膏17.32 g，用飽和食鹽水捏溶分散，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，各萃取物分別濃縮制得石油醚浸膏7.15 g、乙酸乙酯浸膏2.96 g和正丁醇浸膏6.54 g。對上述3種浸膏進(jìn)行同等劑量(500 mg/mL)下的生測比較，確定石油醚浸膏的殺蟲活性最高，對其進(jìn)一步進(jìn)行柱層析分離，具體步驟為：將石油醚相浸膏6.50 g用少量石油醚溶解后吸附在適量硅膠上進(jìn)行硅膠柱層析，用石油醚/乙酸乙酯(體積比100∶1，50∶1，30∶1，25∶1，20∶1，15∶1，10∶1，8∶1，5∶1，3∶1，1∶1)、乙酸乙酯、丙酮和甲醇依次洗脫。測定各洗脫組分的殺蟲活性，進(jìn)一步選取高活性組分段進(jìn)行二次硅膠柱層析，依次用石油醚/丙酮(體積比同上)、丙酮和甲醇洗脫。

1.2.3殺蟲活性的測定采用小葉碟添加法[12]測定供試材料對粘蟲3 齡幼蟲的拒食及胃毒活性。具體方法為：將新鮮的玉米葉片用圓形打孔器(直徑1.0 cm)打成葉碟，置于配制好的藥液(質(zhì)量濃度100,500 mg/mL)中浸漬3 s，自然晾干后，放入培養(yǎng)皿(直徑為9 cm)中，再接入饑餓4 h的試蟲。

采用葉片浸漬法[12]測定試材對小菜蛾3齡幼蟲的拒食及胃毒活性。將新鮮的甘藍(lán)葉片用圓形打孔器(直徑1.5 cm)打成葉碟，放入提取物藥液(質(zhì)量濃度100,500 mg/mL)中浸 3 s，自然晾干，放入直徑9 cm的培養(yǎng)皿中，每皿內(nèi)等距離放4片葉碟，十字交叉型排列，4個(gè)對照葉碟另皿放置，接入饑餓4 h的小菜蛾3齡幼蟲。

采用浸蟲浸葉法[13]測定試材對煙蚜的觸殺活性。稱取一定量提取物，用吐溫-80水溶液稀釋到供試質(zhì)量濃度(50,100 mg/mL)，將挑好的試蟲連帶葉片一起在藥液中浸漬 5 s后取出，用吸水紙吸干藥液，以吐溫-80水溶液作為空白對照。

采用玻片浸漬法[13]測定試材對酢漿草茹葉螨的觸殺作用。以吐溫-80水溶液稀釋中國粗榧丙酮浸膏至供試質(zhì)量濃度(100,200 mg/mL)，將粘好的酢漿草茹葉螨玻片在藥液中浸漬5 s取出，用吸水紙吸去多余藥液，以吐溫-80水溶液作為空白對照。

采用浸液法[12]測定試材對淡色庫蚊幼蟲的觸殺作用。以吐溫-80水溶液稀釋中國粗榧丙酮浸膏到質(zhì)量濃度(2.5,5.0 mg/mL)，再接入事先挑好的試蟲，以吐溫-80水溶液作為空白對照。

采用微量點(diǎn)滴法[12]測定試材對粘蟲、家蠅和玉米象的觸殺作用。以微量點(diǎn)滴儀點(diǎn)滴藥液至粘蟲3齡幼蟲前胸背板(藥物質(zhì)量濃度為250,500 mg/mL)、家蠅成蟲前胸背板(藥物質(zhì)量濃度為500,1 000 mg/mL)及玉米象成蟲腹面(藥物質(zhì)量濃度為500,1 000 mg/mL)，以點(diǎn)滴等量丙酮為對照。

上述生測試驗(yàn)中，各處理均重復(fù)3次，其中粘蟲、小菜蛾、淡色庫蚊幼蟲、家蠅和玉米象每重復(fù)10頭試蟲，酢漿草茹葉螨和蚜蟲每重復(fù)30頭試蟲。處理后，均放置于養(yǎng)蟲室(溫度(26±1) ℃，相對濕度(65±5)%，光/暗周期為12 h/12 h)培養(yǎng)，分別于處理后24，48和72 h進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，計(jì)算死亡率、拒食率及校正死亡率。

1.3數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 16.0軟件的機(jī)率值分析法求出致死中濃度(LC50)、拒食中濃度(AFC50)和致死中量(LD50)及95%置信限。

2　結(jié)果與分析

2.1中國粗榧丙酮提取物的殺蟲活性

按照1.2.3節(jié)的殺蟲活性測定方法，中國粗榧丙酮提取物的殺蟲活性測定結(jié)果見表1～4。

表 1　中國粗榧丙酮提取物對粘蟲和小菜蛾3齡幼蟲的拒食與胃毒活性Table 1　Antifeedant and stomach poisoning activity of Cephalotaxus sinensis extracts against 3rd larva ofMythimna separata and Plutella xylostella

表 2　中國粗榧丙酮提取物對6種害蟲的觸殺活性Table 2　Insecticidal activity of Cephalotaxus sinensis extracts against six pests

注：“-”表示未測定。

Note：“-” means not tested.

從表1和表2可知，中國粗榧丙酮提取物對7 種害蟲均具有一定的殺滅活性，其中對粘蟲和小菜蛾3齡幼蟲均具有較好的拒食和胃毒作用，且對粘蟲兼具觸殺作用；對煙蚜和酢漿草茹葉螨也表現(xiàn)出一定的觸殺活性，在100 mg/mL的質(zhì)量濃度下，煙蚜24 h死亡率為38.90%，酢漿草茹葉螨的24 h死亡率為 32.10%；對淡色庫蚊幼蟲的毒殺活性明顯，隨著丙酮提取物質(zhì)量濃度的升高和處理時(shí)間的延長，試蟲的死亡率明顯增高；對玉米象和家蠅的觸殺活性較差，在500 mg/mL的質(zhì)量濃度下，處理48 h后，玉米象和家蠅死亡率分別為30.00%和 26.67%。

表 3　中國粗榧丙酮提取物對粘蟲和小菜蛾3齡幼蟲的拒食毒力分析Table 3　Antifeedant of Cephalotaxus sinensis extracts against 3rd larva of Mythimna separate and Plutella xylostella

Note：Equation fits the fact unless “χ2” is less than 7.81.The same for Table 4.

表 4　中國粗榧丙酮提取物對粘蟲和小菜蛾3齡幼蟲的胃毒和觸殺毒力分析Table 4　Stomach and contact toxicity of Cephalotaxus sinensisex tracts against 3rd larva ofMythimna separata and Plutella xylostella

由表3可見，中國粗榧丙酮提取物對粘蟲和小菜蛾3齡幼蟲均表現(xiàn)出較強(qiáng)的拒食作用，其中對小菜蛾的拒食活性高于粘蟲，且24 h的 AFC50值略高于48 h；處理48 h后，丙酮提取物對粘蟲的AFC50為71.96 mg/mL，而小菜蛾的AFC50為45.39 mg/mL。

由表4可見，中國粗榧丙酮提取物對粘蟲和小菜蛾3齡幼蟲表現(xiàn)出較好的胃毒作用，且隨著處理時(shí)間的延長，胃毒作用增強(qiáng)，其中對小菜蛾的胃毒作用明顯高于粘蟲， 48 h的LC50分別為74.94和562.28 mg/mL。中國粗榧丙酮提取物對粘蟲具有較好的觸殺作用，處理24 h后，對粘蟲的LD50為 0.22 mg/頭。

2.2中國粗榧不同極性溶劑萃取物對粘蟲的殺蟲活性

為了進(jìn)一步明確中國粗榧活性成分的極性范圍，以粘蟲3齡幼蟲為試蟲，采用小葉碟添加法測定中國粗榧丙酮提取物不同極性溶劑萃取物在500 mg/mL下的殺蟲活性，結(jié)果見表5。

表 5　中國粗榧不同極性溶劑萃取物對粘蟲3齡幼蟲的殺蟲活性Table 5　Insecticidal activity of different solvent extracts from Cephalotaxus sinensisagainst 3rd larva of Mythimna separate

由表5可以看出，中國粗榧不同極性溶劑萃取物的殺蟲活性差異較大，其中石油醚相和乙酸乙酯相均表現(xiàn)出強(qiáng)拒食作用，24 h的拒食率均為 100.00%；僅石油醚相表現(xiàn)出較好的胃毒和觸殺作用，48 h胃毒死亡率達(dá)86.20%，24 h的觸殺死亡率為93.33%；正丁醇相無明顯活性?？梢娭袊珠贾袑φ诚x具有殺蟲活性的物質(zhì)主要集中在石油醚萃取相中，乙酸乙酯相也存在拒食活性成分。

2.3中國粗榧石油醚相萃取物柱層析不同組分對粘蟲的殺蟲活性

對石油醚相進(jìn)行柱層析分離，經(jīng)薄層層析檢測，濃縮合并得到19個(gè)組分，按洗脫順序分別記為 S1～S19。生測結(jié)果(表6)表明，殺蟲活性成分主要集中在S6組分中，對其進(jìn)行二次硅膠柱層析，經(jīng)薄層層析檢測，濃縮合并得到9個(gè)組分，按洗脫順序分別記為Y1～Y9。生測結(jié)果(表7)表明，殺蟲活性成分主要集中在Y5與Y6組分中，其24 h的死亡率均為100%；而Y2、Y4與Y7中也存在一定的活性成分，24 h的死亡率在40%～60%。

表 6　中國粗榧石油醚相萃取物一次柱層析不同組分對粘蟲3齡幼蟲的觸殺活性Table 6　Contact pinioning of fractions from C.sinensis column chromatography against 3rd larva of M.separata

3　討　論

中國粗榧丙酮提取物具有較好的殺蟲活性且作用方式多樣，作用譜較廣，有必要對其進(jìn)行深入研究。本研究結(jié)果表明，中國粗榧丙酮提取物對鱗翅目、同翅目、雙翅目和鞘翅目的供試害蟲均具有一定的殺蟲作用，且兼具殺螨活性；同時(shí)表現(xiàn)出拒食、胃毒和觸殺等不同的作用方式。蒼耳(XanthiumsibiricumPatrin ex Widder)氯仿提取物對粘蟲3 齡幼蟲72 h的AFC50為198.5 mg/mL，胃毒和觸殺LC50分別為899.7和198.5 mg/mL[14]；節(jié)裂角茴香(HypecoumleptpcarpumHook.f.et Thoms)乙醇提取物(1 g/mL)對粘蟲48 h的拒食率為90.78%，觸殺和胃毒校正死亡率最高為33.33%和 23.3%[15]；穗花馬先蒿(PedicularisspicataPall)乙醇提取物對小菜蛾3 齡幼蟲48 h的LC50為 4.663 g/L[16]。與上述研究結(jié)果相比，中國粗榧提取物的殺蟲活性較好，對粘蟲3 齡幼蟲的48 h胃毒LC50為562.28 mg/mL，AFC50為71.96 mg/mL，處理24 h后，對粘蟲3 齡幼蟲的觸殺致死中量(LD50)為0.22 mg/頭。相比而言，中國粗榧丙酮提取物的殺蟲活性有進(jìn)一步研究的價(jià)值。

中國粗榧?xì)⑾x活性成分是非極性親脂物質(zhì)。本研究結(jié)果表明，中國粗榧中殺蟲活性物質(zhì)主要集中在石油醚相，石油醚為親脂性非極性化學(xué)溶劑，根據(jù)“相似相溶”原理，中國粗榧的殺蟲活性物質(zhì)屬非極性親脂物質(zhì)。目前，雖然對中國粗榧的化學(xué)成分尚未見系統(tǒng)報(bào)道，但三尖杉屬植物黔產(chǎn)三尖杉和貢山三尖杉中均存在大量小極性化合物，主要有二環(huán)倍半萜(β-石竹烯等)、鏈狀倍半萜(金合歡醇等)以及棕櫚酸等[17-22]。因此，有必要針對中國粗榧中的小極性化合物進(jìn)行分離，有望獲得殺蟲活性成分。

另外，中國粗榧提取物的其他農(nóng)用活性研究也值得關(guān)注。除殺蟲活性外，其對線蟲有較強(qiáng)的毒殺活性[23]，其生物堿衍生物對煙草花葉病毒具較好的鈍化作用[24]，并具有除草活性[25-26]，但至今未見系統(tǒng)研究。鑒于中國粗榧為我國特有植物，其資源豐富，農(nóng)用活性多樣，有必要對該植物進(jìn)行深入研究。

4　結(jié)　論

中國粗榧提取物對粘蟲、小菜蛾、玉米象、家蠅、淡色庫蚊、煙蚜和酢漿草茹葉螨等多種害蟲均具有較好的殺蟲活性，且表現(xiàn)出拒食、胃毒和觸殺等多種作用方式，其活性成分主要是非極性親脂物質(zhì)，有開發(fā)為新型植物源殺蟲劑的潛力，值得進(jìn)一步研究。

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Preliminary study on insecticidal activity of extracts fromCephalotaxussinensis

MA Shujie1,LI Xuejiao1,MA Zhiqing1,2,ZHANG Xing1,2

(1Research&DevelopmentCenterofBiorationalPesticide,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China;2ResearchCenterofBiopesticideTechnology&Engineering,ShaanxiProvince,Yangling,Shaanxi712100,China)

【Objective】 This research preliminarily evaluated insecticidal activity of extracts fromCephalotaxussinensisagainst seven pests and explored the separation conditions.【Method】 Activities ofC.sinensisagainst seven pests (Plutellaxylostella,Mythimnaseparate,Sitophiluszeamais,Culexpipienspallens,Muscadomestica,MyzuspersicaeandTetranychinahani) were determined by laboratory bioactivity method,and the separation conditions of main active ingredients inC.sinensisextracts were explored by bio-assay guided method.【Result】C.sinensisextracts had high toxic effects against all tested pests,among which larva ofP.xylostellaandM.separatewere more susceptive than others.After 48 h,the LC50and AFC50against 3rd larva ofP.xylostellawere 74.94 mg/mL and 45.39 mg/mL,and those against 3rdlarva ofM.separatewere 562.28 mg/mL and 71.96 mg/mL,respectively.C.sinensisextracts also exhibited contact poisoning activity against 3rdlarva ofM.separatawith LD50of 0.22 mg/larva after 24 h.The main active ingredients existed in the Y5 and Y6 fractions of petroleum ether extracts by column chromatography isolation under bioassay guided method, with the contact mortality of 100% at the dosage of 0.05 μg/larva.【Conclusion】C.sinensisextracts showed potentially insecticidal activity against many pests through antifeedant,stomach poisoning and contact poisoning.The active ingredients were nonpolar lipid materials.

Cephalotaxussinensis;Plutellaxylostella;Mythimnaseparate;insecticidal activity;botanical pesticide

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間:2016-07-1208:4510.13207/j.cnki.jnwafu.2016.08.023

2015-01-18

陜西省科技計(jì)劃項(xiàng)目“中國粗榧?xì)⑾x作用及其產(chǎn)品研究”(2014K02-10-03)

馬樹杰(1990-)，男，山東茌平人，在讀博士，主要從事植物源殺蟲劑研究。E-mail：mashujie89@126.com

馬志卿(1975-)，男，新疆奇臺人，教授，主要從事農(nóng)藥毒理學(xué)研究。E-mail：mazhiqing2000@126.com

S482.5+2

A

1671-9387(2016)08-0155-07

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