馬小娟，韋小敏，來航線，房艷華，胡軼倫

(西北農林科技大學 a 資源環(huán)境學院，b 生命科學學院，陜西 楊凌 712100)

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斜臥青霉轉錄調控蛋白Hac1過表達菌株的構建

馬小娟a，韋小敏a，來航線a，房艷華a，胡軼倫b

(西北農林科技大學 a 資源環(huán)境學院，b 生命科學學院，陜西 楊凌 712100)

【目的】 以增強型綠色熒光蛋白為報告基因，構建斜臥青霉轉錄調控蛋白Hac1激活形式基因(Hac1i)隨機插入過表達菌株和非激活形式基因(Hac1u)原位插入過表達菌株，并初步觀察Hac1基因的2種不同編碼蛋白在菌絲內部的運動情況，為進一步研究轉錄調控蛋白Hac1的功能奠定基礎。【方法】 分別克隆ptrA篩選標記、gpdA啟動子、Hac1i編碼區(qū)、eGFP編碼區(qū)及終止子，利用融合PCR融合克隆片段，構建Hac1i隨機插入表達盒；再分別克隆Hac1上游臂及編碼區(qū)、eGFP編碼區(qū)及終止子、ptrA篩選標記、Hac1下游臂序列，融合克隆片段，構建Hac1u原位插入表達盒。將2種表達盒分別轉化斜臥青霉原生質體，通過吡啶硫胺素篩選標記、PCR擴增等檢測獲得陽性轉化子，熒光顯微鏡觀察融合蛋白的表達及運動情況?！窘Y果】 成功構建了Hac1i基因隨機插入表達盒和Hac1u基因原位插入表達盒，利用原生質體轉化將2種表達盒轉入宿主斜臥青霉菌株，經PCR初步驗證，得到了陽性轉化子。陽性轉化子在麩皮培養(yǎng)基上培養(yǎng)2～4 d后，可在菌絲內部清晰觀察到強烈的綠色熒光信號，表明融合蛋白在菌絲體內得到了正確表達?！窘Y論】 成功構建了Hac1i基因隨機插入和Hac1u基因原位插入菌株。

斜臥青霉；熒光蛋白；轉錄調控蛋白Hac1

絲狀真菌由于具有卓越的蛋白分泌能力，已被廣泛應用于多種工業(yè)用酶，如纖維素酶、半纖維素酶、淀粉酶、果膠酶等的生產中[1-2]。此外，由于具有接近高等真核生物的蛋白質分子折疊和修飾系統(tǒng)，絲狀真菌在異源蛋白的活性重組表達方面也頗具吸引力[3]。由于工業(yè)生產的需要，人們常用基因工程方法(如強啟動子控制、引入多拷貝、表達融合蛋白、缺失蛋白酶活力等)來提高絲狀真菌異源蛋白的產量。然而，已有研究顯示，絲狀真菌在某些條件下的蛋白分泌通路仍然不夠“通暢”，蛋白的分泌速率受到了制約，其表達的異源蛋白更是遠遠低于自身分泌蛋白的產量，這成為其工業(yè)應用中的一個主要限制因素[4-5]。

目前，研究者將研究重點集中在胞內蛋白質量控制的細胞機制、分泌途徑改造、蛋白修飾加工以及工程菌穩(wěn)定性等方面[6]，以期能充分挖掘絲狀真菌作為宿主生產異源蛋白的巨大潛力。但過量表達的異源蛋白超出了細胞的承受能力，使多肽鏈不能及時正確折疊，導致內質網中的錯誤折疊或者未折疊蛋白累積，嚴重影響蛋白的轉運和分泌，這是造成異源蛋白產量低的一個重要原因。當過量蛋白尤其是那些未折疊的蛋白和錯誤折疊的蛋白流經真核細胞內質網(Endoplasmic reticulum，ER)時，可以誘發(fā)所謂的蛋白分泌壓力響應或ER壓力響應的一系列調節(jié)反應，以實現(xiàn)對內質網壓力的緩解。未折疊蛋白響應(Unfolded protein response，UPR)是這一響應中最為重要的一種調控機制[7]，UPR通過上調分子伴侶BIP1、二硫鍵異構酶PDI1等相關基因的表達量，使胞外蛋白的分泌量得到提高[8]。因此，誘導未折疊蛋白響應成為研究蛋白分泌調控機制的熱點。

本研究通過克隆UPR途徑中重要調控蛋白Hac1的激活形式蛋白編碼基因(Hac1i)和非激活形式蛋白編碼基因(Hac1u)，利用抗吡啶硫胺素的基因(ptrA)為篩選標記、eGFP為報告基因，分別構建了Hac1i基因隨機插入表達盒和Hac1u基因原位插入表達盒，并成功將表達盒引入宿主體內,觀察激活蛋白和非激活蛋白的表達情況，以期為進一步研究Hac1轉錄調控蛋白功能及絲狀真菌蛋白分泌調控機制提供基礎。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株和質粒斜臥青霉114-2菌株、質粒pME2892 (含抗吡啶硫胺素的基因ptrA，用作選擇標記)和質粒pIG1783(含有增強型綠色熒光蛋白基因eGFP)，均由山東大學提供；質粒pEASY-Hac1i(含Hac1的激活形式蛋白編碼框)，由西北農林科技大學資源環(huán)境學院農科樓705實驗室構建；大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α購自北京全式金公司。

1.1.2工具酶及試劑EasyTaqDNA聚合酶、高保真High Fidelity DNA聚合酶、FastPfuFly DNA聚合酶、DNA Marker 2k、2k Plus Marker、λHind Ⅲ DNA Marker，購自北京全式金公司；限制性內切酶EcoRⅠ、XhoⅠ、Hind Ⅲ，購自TaKaRa公司；質粒提取試劑盒，購自BioTeKe公司；膠回收試劑盒，購自Omega公司；吡啶硫胺素、溶菌酶，購自Sigma公司。PCR引物合成由上海生工生物工程公司完成；培養(yǎng)基組分、試劑均為國產分析純試劑。

1.1.3培養(yǎng)基LB液體培養(yǎng)基：蛋白胨1 g/L，酵母粉0.5 g/L，NaCl 1 g/L，pH 7.0～7.4。

斜臥青霉菌菌絲生長固體培養(yǎng)基：20 g/L瓊脂粉，麩皮0.1 g/mL，煮沸30 min后，4層紗布過濾，擠出麩皮汁，定容，加瓊脂粉，加熱融化，分裝。

菌絲基礎培養(yǎng)基Mandels’營養(yǎng)鹽液：KH2PO43 g/L，NaNO32.6 g/L，尿素0.5 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 7.5 mg/L，MnSO4·H2O 2.5 mg/L，ZnSO4·7H2O 3.6 mg/L，CoCl2·6H2O 3.7 mg/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，CaCl20.5 g/L，蛋白胨1 g/L，pH約5.5。

50×的Vegol’s鹽溶液：Na3C6H5O7·2H2O 125 g/L，KH2PO4250 g/L，NH4NO3100 g/L，MgSO4·7H2O 10 g/L，CaCl2·2H2O (單獨溶解后加入) 5 g/L，C6H8O7·H2O 0.05 g/mL，ZnSO4·7H2O 0.05 g/L，F(xiàn)e(NH4)2(SO4)2·6H2O 0.01 g/L，CuSO4·5H2O 2.5 g/L，MnSO4·H2O 0.5 g/L，H3BO3(無水) 0.5 g/L，Na2MoO4·2H2O 0.5 g/L，生物素0.1 g/L。

吡啶硫胺素：1 mg吡啶硫胺素溶于20 mL水，細菌過濾器過濾，分裝保存。

轉化子篩選培養(yǎng)基：1×Vegol’s鹽溶液，質量分數(shù)0.4 %吡啶硫胺素，葡萄糖20 g/L，瓊脂粉20 g/L。

再生培養(yǎng)基上層：1×Vegol’s鹽溶液，葡萄糖20 g/L，山梨醇182 g/L，瓊脂糖0.8 g/L，分裝每瓶20 mL。

再生培養(yǎng)基下層：山梨醇182 g/L，瓊脂糖0.8 g/L。

1.2方法

1.2.1斜臥青霉基因組DNA的提取及檢測參照曲音波[9]的方法提取斜臥青霉基因組DNA，用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質量。

1.2.2PCR引物設計根據已知序列，運用Primer 5.0軟件設計引物。PCR引物由上海生工生物工程公司合成，具體所用引物序列見表1。

表 1　本研究所用引物Table 1　Primers used in this study

1.2.3Hac1i基因隨機插入表達盒的構建(1)ptrA篩選標記、gpdA啟動子、Hac1i和eGFP編碼區(qū)及終止子序列的擴增。在高保真FastPfuFly DNA聚合酶的作用下，以質粒pME2892為模板使用引物PtraF和PtraR擴增ptrA篩選標記，預期片段長度2 008 bp。使用引物PgpdA-F-PtraR(攜帶ptrA基因上的25個堿基作為重疊序列)和PgpdA-R-HacF(末端攜帶斜臥青霉基因組編碼區(qū)的25個堿基作為重疊序列)從斜臥青霉基因組中擴增gpdA啟動子，預期片段長度1 350 bp。使用引物Hac-AC-F和Hac-AC-R-gfp(末端攜帶質粒pIG1783中eGFP編碼區(qū)的24個堿基作為重疊序列)從質粒pEASY-Hac1i擴增Hac1i編碼區(qū)，預期片段長度為1 100 bp。以質粒pIG1783為模板，用引物gfpT-F和gfpT-R擴增eGFP編碼區(qū)及終止子，預期片段長度為1 500 bp。對4個擴增片段進行8%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，切膠回收純化目的片段。

(2)表達盒的構建。上述4個片段中，片段ptrA篩選標記末端和gpdA啟動子連接處、gpdA啟動子和Hac1i編碼區(qū)連接處、Hac1i編碼區(qū)和eGFP編碼區(qū)及終止子連接處形成相同的粘性末端，片段末端互為引物，連城一條片段。將ptrA篩選標記、gpdA啟動子、Hac1i編碼區(qū)、eGFP編碼區(qū)及終止子以物質的量比為1∶2∶2∶1的比例通過融合PCR[10]克隆片段，使用巢式引物Ptra-NF2和gfpT-NS1對融合片段進行克隆，構建Hac1激活形式基因隨機插入表達盒(圖1)，預期表達盒長度為 5 500 bp。用Primer 5.0軟件分析限制性內切酶EcoRⅠ、XhoⅠ、Hind Ⅲ在融合片段內的酶切位點，獲得預期酶切片段長度；對融合片段分別進行相應的酶切，酶切產物進行8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，驗證融合的正確性。

1.2.4Hac1u原位插入表達盒的構建(1)Hac1上游臂及編碼區(qū)、eGFP編碼區(qū)及終止子、ptrA篩選標記和Hac1下游臂序列的擴增。在高保真FastPfuFly DNA聚合酶作用下，使用引物Hac1-NS1和Hac-NAC-R-gfp(末端攜帶eGFP編碼區(qū)的24個堿基作為重疊序列)，從斜臥青霉基因組中克隆Hac1上游臂及編碼區(qū)，預期片段長度為 3 907 bp。以質粒pIG1783為模板，使用引物gfpT-F和gfpT-R擴增eGFP編碼區(qū)及終止子，預期片段長度為 1 500 bp。以質粒pME2892為模板，使用引物PtraF-gfpT(攜帶eGFP編碼區(qū)后部的25個堿基作為重疊序列)和PtraR擴增ptrA篩選標記，預期片段長度為2 008 bp。使用引物Hac1-LD1(前端攜帶ptrA基因的24個堿基作為重疊序列)和Hac1-LD2，從斜臥青霉基因組中克隆Hac1下游臂序列，預期片段長度為2 182 bp。對4個擴增片段進行8%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，切膠回收純化目的片段。

圖 1　Hac1i基因隨機插入表達盒的構建示意圖Fig.1　Construction of expression cassette of random integration of Hac1i

(2)表達盒的構建。將Hac1上游臂和編碼區(qū)、eGFP編碼區(qū)和終止子、ptrA篩選標記、Hac1下游臂以物質的量比1∶2∶2∶1的比例通過PCR融合克隆片段，用巢式引物Hac1-NS1-1和Hac1-NS2對融合片段進行克隆，構建預期長度為9 000 bp的Hac1非激活形式基因原位插入表達盒(圖2)。用Primer 5.0軟件分析融合片段的酶切位點，采用限制性內切酶EcoRⅠ、XhoⅠ、HindⅢ進行酶切反應，對酶切產物進行8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，驗證融合的正確性。

圖 2　Hac1u基因原位插入表達盒的構建Fig.2　Construction of expression cassette of situ integration of Hac1u

1.2.5原生質體轉化及轉化子的鑒定參照韋小敏[11]的方法并稍加改動(玻璃紙改為稱量紙，玻璃絲改為擦鏡紙)，進行原生質體的制備和轉化，將上述Hac1i基因隨機插入表達盒和Hac1u原位插入表達盒轉化到斜臥青霉原生質體中。將轉化好的原生質體倒在含有質量分數(shù)0.4%吡啶硫胺素的再生平板上層，然后將培養(yǎng)基倒在下層培養(yǎng)基上，待凝固后，30 ℃避光培養(yǎng)3～5 d，待陽性轉化子長出后進行傳代培養(yǎng)，同時將陽性轉化子接種于菌絲生長培養(yǎng)基，提取轉化子DNA作為模板，以斜臥青霉菌株114-2 DNA為陰性對照模板，用引物PtrA-ZSF和PtrA-ZSR(表1)進行PCR檢測，Hac1i基因隨機插入表達盒是否已經整合入斜臥青霉基因組中，若是整合成功則會得到長度為1 526 bp的PtrA條帶，而對照模板不會擴增出條帶；Hac1u基因原位插入表達用PtrA-ZSF、PtrA-ZSR及PtrA-YZF、Hac1-LD2 2對引物(表1)分別檢測，整合成功時會得到 1 526 bpPtrA條帶和2 324 bp的連接PtrA和Hac1下游臂的條帶。

1.2.6綠色熒光蛋白的檢測選取經PCR檢測較好的陽性轉化子接種于菌絲生長培養(yǎng)基上，30 ℃、190 r/min培養(yǎng)2～3 d后挑取菌絲制成壓片，在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的表達，用藍紫外光激發(fā)，分別用40倍鏡和100倍鏡對菌絲進行觀察。

2　結果與分析

2.1斜臥青霉基因組DNA的提取

用8%瓊脂糖凝膠電泳檢測斜臥青霉基因組DNA，得到與預期長度一致的約20 000 bp的片段，且條帶均一，沒有雜代或拖尾(圖3)，表明所得DNA較純，可用于后續(xù)試驗。

2.2Hac1i基因隨機插入表達盒的構建

2.2.1表達盒各部件的擴增以質粒pME2892為模板擴增得到ptrA篩選標記片段，長度為2 008 bp(圖4泳道1)；以斜臥青霉基因組為模板擴增得到gpdA啟動子片段，長度為1 350 bp(圖4泳道2)；從質粒pEASY-Hac1i中擴增得到Hac1i編碼區(qū)片段，長度為1 100 bp(圖4泳道3)；以質粒pIG1783為模板擴增出eGFP編碼區(qū)及終止子，長度為1 500 bp(圖4泳道4)。

毛澤東思想是一個完整的科學體系，它具有多方面內容，在關于新民主主義革命、社會主義革命和建設、革命軍隊建設和軍事戰(zhàn)略、政策和策略、思想政治工作和文化工作及黨的建設等方面，都以獨創(chuàng)的理論豐富和發(fā)展了馬克思列寧主義。毛澤東思想作為中國化的馬克思列寧主義，一方面，它是與馬克思列寧主義一脈相承的科學體系，其基本理論原則無不根源于馬克思列寧主義；另一方面，毛澤東思想中的許多理論原則和經驗總結，又都是同中國革命和建設的實際緊密結合在一起的，是以往的馬克思列寧主義經典作家從未論述過的，或僅僅是提出了問題而未來得及解決的，凝結著中華民族的優(yōu)秀思想和中國共產黨人的實踐經驗。

圖 3斜臥青霉基因組DNA的質量檢測

M.λHind Ⅲ DNA Marker；1.斜臥青霉基因組

Fig.3Detection ofPenicilliumdecumbensDNA

M.λHind Ⅲ DNA Marker;1.Penicilliumdecumbensgenome

2.2.2表達盒的組裝采用融合PCR方法將ptrA篩選標記、gpdA啟動子、Hac1i編碼區(qū)以及eGFP編碼區(qū)和終止子片段進行融合，獲得Hac1i基因隨機插入表達盒，采用巢式PCR對該融合片段進行擴增，獲得了長度約為5 500 bp的片段(圖5泳道1)，與預期結果一致。用限制性內切酶EcoRⅠ、XhoⅠ、Hind Ⅲ分別對巢式PCR得到的DNA片段進行酶切，結果Hind Ⅲ酶切得2 524和3 283 bp的2條條帶(圖5泳道2、3)，XhoⅠ酶切得2 182和 3 625 bp的2條條帶(圖5泳道4、5)，EcoRⅠ酶切后只有1條4 900 bp的條帶(圖5泳道6、7),與預期結果一致，說明片段融合正確。

圖 4　Hac1i基因隨機插入表達盒4個片段的PCR擴增M.2k Plus Marker；1.ptrA篩選標記；2.gpdA啟動子； 3.Hac1i編碼區(qū)； 4.eGFP編碼區(qū)及終止子Fig.4　PCR amplification 4 fragments of activation gene of Hac1 random expression boxM.2k Plus Marker;1.Expression cassette of ptrA gene; 2.Promoter of gpdA;3.The protein-coding region of active Hac1; 4.The protein-coding region of eGFP and terminator圖 5　Hac1i基因隨機表達盒的巢式PCR擴增和 限制性酶切驗證M.2k Plus Marker;1.Hac1i基因隨機插入表達盒的巢式擴增 產物；2～3.HindⅢ酶切；4～5.XhoⅠ酶切；6～7.EcoRⅠ酶切Fig.5　Amplification of Hac1i random expression cassette using nest PCR and restricted enzyme cutting to examineM.2k Plus Marker;1.PCR products of random expression cassette；2-3.Digested by Hind Ⅲ；4-5.Digested by XhoⅠ； 6-7.Digested by EcoRⅠ

2.3Hac1u基因原位插入表達盒的構建

2.3.1表達盒各部件的擴增以斜臥青霉基因組為模板擴增得到表達盒的Hac1上游臂及編碼區(qū)片段，長度為3 907 bp(圖6泳道2)；以質粒pIG1783為模板擴增出eGFP編碼區(qū)及終止子，長度為1 500 bp(圖6泳道1)；以質粒pME2892為模板擴增出ptrA篩選標記片段，長度為2 008 bp(圖6泳道3)；以斜臥青霉基因組為模板擴增得到Hac1下游臂片段，長度為2 182 bp(圖6泳道4)。

2.3.2表達盒的組裝用融合PCR方法將Hac1上游臂及編碼區(qū)、eGFP編碼區(qū)及終止子、ptrA篩選標記和Hac1下游臂4段序列融合，獲得Hac1u基因原位插入表達盒，用巢式PCR方法對該表達盒進行擴增，獲得了長度約為9 000 bp的片段(圖7泳道1)。采用限制性內切酶EcoRⅠ、XhoⅠ、Hind Ⅲ分別對巢式PCR得到的DNA片段進行酶切，其中XhoⅠ酶切得2 133和6 600 bp的2條片段(圖7泳道2)，EcoRⅠ酶切得667，1 153，1 900，5 632 bp的4條片段(圖7泳道3)，Hind Ⅲ酶切沒有獲得相應的酶切片段，與預期結果一致，說明片段融合正確。

圖 6　Hac1u基因原位插入表達盒4個片段的PCR擴增M.2k Plus Marker;1.eGFP編碼區(qū)及終止子; 2.Hac1上游臂及編碼區(qū);3.ptrA篩選標記;4.Hac1下游臂Fig.6　PCR amplification 4 fragments of non-activation gene of Hac1 in situ expression cassetteM.2k Plus Marker;1.The protein-coding region of eGFP and terminator;2.Up-stream sequence and conding region ofHac1;3.ptrA genome;4.Down-stream sequence of Hac1圖 7　Hac1u基因原位插入表達盒的巢式 PCR和限制性酶切驗證M.λHind Ⅲ DNA Marker;1.Hac1u基因原位插入表達 盒巢式PCR擴增產物；2.EcoRⅠ酶切；3.XhoⅠ酶切；4.Hind Ⅲ酶切Fig.7　Amplification of situ expression cassette using nest PCR and identificationusingrestricted enzyme cuttingM.λHind Ⅲ DNA Marker;1.PCR products of situ expression cassette; 2.Digested by EcoRⅠ；3.Digested by XhoⅠ；4.Digested by Hind Ⅲ

2.4陽性轉化子的PCR鑒定

由圖8可知，Hac1i基因過表達菌株擴增出 1 526 bp的ptrA基因條帶，陰性對照無擴增條帶產生，表明Hac1i基因隨機插入表達盒已經成功整合入轉化菌株基因組中。

圖 8　Hac1i基因和Hac1u基因表達盒的陽性轉化子鑒定結果M.2k DNA Marker;1,5，7.陰性對照;2.Hac1i隨機插入表達盒ptrA基因； 3～4.Hac1u原位插入表達盒ptrA基因；6.連接ptrA和Hac1下游臂的片段Fig.8　Identification of positive trans-formants of activation and non-activation genes of Hac1M.2k DNA Marker;1,5,7.Negative control;2.Hac1iptrA genom;3-4.Hac1u ptrA genom; 6.The fragment connecting ptrA and Hac1 downstream arm

2.5構建菌株的綠色熒光觀察

40倍鏡觀察結果顯示，Hac1i基因過表達菌株(圖9-A1)和Hac1u基因過表達菌株(圖9-B1)菌絲體內部均產生了強烈的熒光信號，說明融合蛋白在菌絲體內得到了正確表達;菌絲體外部未檢測到熒光信號。當顯微鏡放大到100倍時，可以清晰觀察到熒光信號呈點狀分布，在菌絲邊緣及頂端未發(fā)現(xiàn)綠色熒光顆粒(圖9-A2、B2)，說明Hac1i和Hac1u均在菌絲內部有分布。

圖 9　Hac1i基因和Hac1u基因表達盒陽性轉化子的綠色熒光觀察 A1,A2.分別為Hac1i隨機插入菌株40倍鏡和100倍鏡下菌絲熒光觀察； B1,B2.分別為Hac1u原位插入菌株40倍鏡和100倍鏡下菌絲熒光觀察Fig.9　Observation of green fluorescence of positive trans-formants of activation and non-activation genes of Hac1 A1,A2.Observation of green fluorescenceof Hac1i under 40 times and 100 times microscope; B1,B2.Observation of green fluorescenceof Hac1u under 40 times and 100 times microscope

3　討　論

絲狀真菌卓越的蛋白分泌能力確立了其在工業(yè)用酶生產中的核心地位，一些菌株已成為優(yōu)良的工業(yè)生產菌株。許多同源和異源真菌蛋白在絲狀真菌中已實現(xiàn)了高效表達，但是來源于其他高等生物的基因的表達受到瓶頸限制，產量不高[12]。因此一些基因工程手段被應用到菌株改造中，以期充分挖掘絲狀真菌作為細胞工廠生產異源蛋白的巨大潛力。

近年來，絲狀真菌蛋白合成分泌調控機制研究取得很大進展，UPR機制是研究較多的蛋白分泌調控機制之一，UPR的作用是當過量未折疊蛋白和錯誤折疊蛋白流經真核細胞內質網時，其可以上調分子伴侶BIP1、二硫鍵異構酶PDI1等相關基因表達量，促進蛋白質的折疊和運輸，減輕細胞壓力[13-14]。Hac1是UPR途徑中的重要轉錄調控蛋白，當細胞中發(fā)生UPR時，激活的Hac1進入細胞核后與UPR靶標基因啟動子區(qū)的未折疊蛋白響應元件區(qū)域(unfolded protein response element，UPRE)結合，造成UPR途徑相關的折疊酶、分子伴侶、糖基化修飾酶和蛋白易位及膜泡運輸?shù)认嚓P蛋白編碼基因表達量上調[15]。雖然Hac1及其激活機制在酵母、絲狀真菌里氏木霉和構巢曲霉上的研究較為深入，但Hac1轉錄調控蛋白的功能仍未得到全面解析。

在已有研究基礎上，本研究構建了斜臥青霉114-2菌株轉錄調控蛋白Hac1的激活形式蛋白編碼框和非激活形式蛋白編碼框，并分別以gpdA基因啟動子和Hac1基因啟動子為指引，以綠色熒光蛋白基因為報告基因，成功構建了Hac1基因的過表達菌株。Hac1激活形式蛋白過表達菌株以gpdA組成型啟動子為指引，Hac1的激活形式基因隨機插入轉化子基因組中，其表達不受培養(yǎng)條件影響，能在無藥物或異源蛋白表達的條件下誘導細胞UPR響應，可用于分析Hac1蛋白對細胞產生的影響，以及Hac1可能對下游基因表達產生的影響；以綠色熒光蛋白為報告基因，激活的Hac1攜帶綠色熒光信號，使動態(tài)觀察Hac1在胞內運動行為成為可能。Hac1非激活形式蛋白過表達菌株以自身基因啟動子為指引，以綠色熒光蛋白為報告基因，原位替換了原有基因，使在原始條件下觀察非激活Hac1在胞內的運動行為成為可能。對激活與非激活Hac1在胞內的運動行為進行對比分析，將有助于對Hac1功能進行全面解析。本試驗構建的2株不同表達形式的轉錄調控蛋白Hac1過表達菌株為研究Hac1轉錄調控蛋白的功能提供了研究材料，也為進一步探討絲狀真菌蛋白分泌調控機制奠定了基礎。

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Construction of over expression strain of green fluorescent protein labeled transcription regulation proteinHac1

MA Xiaojuana，WEI Xiaomina，LAI Hangxiana，F(xiàn)ANG Yanhuaa，HU Yilunb

(aCollegeofNaturalResourcesandEnvironment，bCollegeofLifeSciences，NorthwestA&FUniversity，Yangling，Shaanxi712100，China)

【Objective】 This paper constructedover expression strain by randomly inserting activated transcription regulation protein geneHac1(Hac1i) and stain in-situ inserted by non-activated transcription regulation protein geneHac1(Hac1u) ofPenicilliumdecumbenswith enhanced green fluore scent protein as a reporter gene.The motion of these two encoded proteins in the strains was also observed.This paper would provide basis for further investigating the function of transcription regulation proteinHac1.【Method】 The random integration expression cassette ofHac1iwas constructed by cloning selection marker,gpd Apromoter,Hac1iprotein-coding region,eGFP protein-coding region and terminatorand fusing these fragmentsusing PCR fusion.The in-situ integration expression cassette ofHac1uwas constructed by cloningup-stream sequence and coding region ofHac1,protein-coding region ofeGFPand terminator,selection marker and down-stream sequence ofHac1,and fusing these fragments.Then these two expression cassettes were put intoPenicilliumdecumbensprotoplasts,positive trans-formants were detected by thiamine pyridine resistance and PCR amplification,andeGFPwas observed under microscope.【Result】 The random integration ofHac1iand situ integration ofHac1uwere success fully cloned by fusion PCR,and they were inserted into hostPenicilliumdecumbensstrainusing protoplast transformation.PCR verification indicated that positive trans-formants were success fully obtained.Green fluorescence distribution emerged on hyphae carryingthe expression cassettesHac1iandHac1uafter 2 to 4 days culture on bran medium.【Conclusion】 Strainswithrandom integrationHac1iand situ integrationHac1uwere constructed successfully.

Penicilliumdecumbens;fluorescent protein;transcription regulation proteinHac1

網絡出版時間:2016-07-1208:4510.13207/j.cnki.jnwafu.2016.08.030

2015-01-30

國家自然科學基金項目(31200058)

馬小娟(1989-)，女，山西呂梁人，在讀碩士，主要從事微生物資源與利用研究。E-mail：daidaich@foxmail.com

來航線(1964-)，男，陜西禮泉人，副教授，博士，主要從事微生物生態(tài)和微生物資源與利用研究。

E-mail：laihangxian@163.com

Q93

A

1671-9387(2016)08-0205-08

網絡出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20160712.0845.060.html