叢凡淏，趙金喬，劉　毅，楊競(jìng)平，張林波

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春130118)

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hGDF-15基因的克隆及原核表達(dá)

叢凡淏，趙金喬，劉毅，楊競(jìng)平，張林波

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春130118)

【目的】 克隆人生長(zhǎng)分化因子-15(Human growth differentiation factor-15，hGDF-15)成熟肽基因，構(gòu)建其原核表達(dá)載體，并進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，為hGDF-15藥理活性和生物學(xué)功能研究奠定基礎(chǔ)。【方法】 利用PCR技術(shù)克隆人hGDF-15成熟肽基因，將其連接到pET-28a載體上構(gòu)建pET-28a-hGDF-15原核表達(dá)載體，并將此載體轉(zhuǎn)入Rosetta(DE3)大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，獲得重組大腸桿菌，對(duì)目的蛋白分別采用不同溫度(16，25，37 ℃)、IPTG濃度(0.10，0.25，0.50，0.75，1.00 mmol/L)和時(shí)間(12，24，36，48 h)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE電泳和Western blot檢測(cè)，利用Gel Quant Express軟件對(duì)菌體破碎離心的上清組分和沉淀組分中的蛋白含量進(jìn)行測(cè)定，通過(guò)正交試驗(yàn)，分析上清組分和沉淀組分的最適誘導(dǎo)表達(dá)條件?！窘Y(jié)果】 成功獲得hGDF-15成熟肽基因，其長(zhǎng)度為339 bp；構(gòu)建了pET-28a-hGDF-15原核表達(dá)載體，并誘導(dǎo)表達(dá)了hGDF-15蛋白；優(yōu)化的上清組分最適誘導(dǎo)條件為IPTG濃度0.25 mmol/L、溫度16 ℃、時(shí)間24 h，沉淀組分最適誘導(dǎo)條件為溫度37 ℃、時(shí)間36 h、IPTG濃度1.00 mmol/L?！窘Y(jié)論】 成功克隆了hGDF-15基因，在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)出其編碼蛋白，并優(yōu)化出了最適誘導(dǎo)表達(dá)條件。

生長(zhǎng)分化因子-15；原核表達(dá)；IPTG濃度；誘導(dǎo)時(shí)間；誘導(dǎo)溫度

生長(zhǎng)分化因子-15(Growth differentiation factor-15，GDF-15)，是TGF-β超家族成員，廣泛分布于哺乳動(dòng)物組織中，在多種病癥(包括炎癥、腫瘤、心血管疾病和肥胖)中扮演多重角色[1]。人GDF-15基因(hGDF-15)編碼序列全長(zhǎng)885 bp，由2個(gè)外顯子組成，其中外顯子1由238 bp的編碼序列和71 bp的非編碼序列組成，外顯子2由647 bp的編碼序列和244 bp的非編碼序列組成[2-5]。hGDF-15前體蛋白單體(pro-hGDF-15 monomer)由295個(gè)氨基酸殘基組成，相對(duì)分子質(zhì)量約為33 ku，其中N-末端信號(hào)肽(N-terminal signal sequence)含有16個(gè)氨基酸殘基，前區(qū)蛋白(pro-region)含有167個(gè)氨基酸殘基，成熟肽蛋白(mature region)含有112個(gè)氨基酸殘基[6-7]。hGDF-15前體蛋白單體經(jīng)跨膜進(jìn)入粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，N-末端信號(hào)肽被信號(hào)肽水解酶水解，同時(shí)2個(gè)hGDF-15前體蛋白單體通過(guò)成熟肽部位的4個(gè)二硫鍵連接形成hGDF-15前體蛋白二聚體(pro-hGDF-15 dimer)[8]。hGDF-15前體蛋白二聚體的相對(duì)分子質(zhì)量約為62 ku，通過(guò)Notch信號(hào)通路活化成熟后，于Notch成熟過(guò)程中在高爾基體內(nèi)furin-like轉(zhuǎn)化酶(furin-like protease)的作用下發(fā)生裂解，經(jīng)酶切裂解切除前區(qū)蛋白，形成分子質(zhì)量約為25 ku的二聚體形式的hGDF-15成熟肽[9]。

二聚體形式的hGDF-15成熟肽是一種分泌型應(yīng)激性蛋白，在心血管疾病的檢測(cè)和治療[10-12]、炎癥反應(yīng)[13-14]、癌癥治療[15-17]和神經(jīng)元的保護(hù)[18-19]等生理病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用，但國(guó)內(nèi)對(duì)其研究較少，特別是對(duì)hGDF-15藥理活性、生物學(xué)功能、作用機(jī)理和信號(hào)通路等的研究報(bào)道更少。詹峰等[20]曾構(gòu)建pGEX-4T-2-hGDF-15原核表達(dá)載體，并用其制備抗hGDF-15單克隆抗體(mAb)。本試驗(yàn)設(shè)計(jì)并合成了hGDF-15成熟肽基因引物，利用PCR技術(shù)對(duì)其進(jìn)行克隆，構(gòu)建原核表達(dá)載體，在此基礎(chǔ)上利用正交試驗(yàn)對(duì)hGDF-15的誘導(dǎo)表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化，以期為hGDF-15的制備、藥理活性和生物學(xué)功能研究奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

攜帶hGDF-15成熟肽基因的質(zhì)粒、大腸桿菌菌株Rosetta(DE3)和原核表達(dá)載體pET-28a，由本實(shí)驗(yàn)室保存；Ex-Taq聚合酶、dNTPs、DL2000核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)、限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶，購(gòu)自TaKaRa公司；SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)低分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生物化學(xué)研究所；丙烯酰胺(Acrylamide)、甲叉雙丙烯酰胺(Bis-acrylamide)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、甘氨酸(Gly)、聚偏氟乙烯膜(PVDF)，購(gòu)自Solarbio公司；質(zhì)粒提取試劑盒和DNA凝膠回收試劑盒，購(gòu)自愛(ài)思進(jìn)生物技術(shù)有限公司；預(yù)染蛋白Marker(mid)，購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；鼠抗His-Tag抗體和羊抗鼠IgG(H+L)，購(gòu)自Proteintech公司；增強(qiáng)型HRP-DAB底物顯色試劑盒，購(gòu)自Tiangen公司。

1.2方法

1.2.1hGDF-15成熟肽基因的克隆根據(jù)GenBank中的hGDF-15基因序列(ID：9518)設(shè)計(jì)引物，上游引物序列：5′-CATGCTAGCGCGCGCAACGGAGACCAC-3′，5′端下劃線部分為添加的NheⅠ酶切位點(diǎn)；下游引物序列：5′-CCCAAGCTTTCAT-ATGCAGTGGCAGTC-3′，5′端下劃線部分為添加的Hind Ⅲ酶切位點(diǎn)。以攜帶hGDF-15成熟肽基因的原始質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為：hGDF-15原質(zhì)粒1 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，Ex-TaqDNA聚合酶1 μL，10×Ex-TaqBuffer 2 μL，dNTP(2.5 mmol/L)2 μL，ddH2O 12 μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)參數(shù)：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存10 min。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，并用DNA凝膠回收試劑盒對(duì)目的條帶進(jìn)行回收，回收的PCR產(chǎn)物-20 ℃保存，備用。

1.2.2重組原核表達(dá)載體pET-28a-hGDF-15的構(gòu)建將PCR產(chǎn)物和pET-28a載體分別用NheⅠ和Hind Ⅲ進(jìn)行雙酶切，回收目的片段后用T4連接酶于16 ℃連接16 h。將所得重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌Rosetta(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含 0.1 mg/mL卡那霉素(Kan)的LB平板培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)箱中過(guò)夜培養(yǎng)12 h。挑選陽(yáng)性克隆菌株，提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR驗(yàn)證和NheⅠ、Hind Ⅲ雙酶切驗(yàn)證，將驗(yàn)證正確的菌株送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序鑒定，將序列編碼的氨基酸序列與GenBank中的hGDF-15成熟肽氨基酸序列進(jìn)行對(duì)比，用DNAMAN Version5.2.2分析。序列正確的克隆菌株命名為pET-28a-hGDF-15。

1.2.3hGDF-15蛋白誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化將pET-28a-hGDF-15 Rosetta(DE3)菌株以1∶1 000的體積比接種于含0.1 mg/mL Kan的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)12 h。再將培養(yǎng)物以1∶100的體積比接入新的含0.1 mg/mL Kan的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)4～6 h，至OD600為0.4～0.6時(shí)，分別在不同溫度(16，25，37 ℃)、IPTG濃度(終濃度為0.10，0.25，0.50，0.75，1.00 mmol/L)、時(shí)間(12，24，36，48 h)條件下進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，同時(shí)對(duì)相同溫度和時(shí)間的每組設(shè)置相應(yīng)未誘導(dǎo)為對(duì)照組。取等體積的菌液，于4 ℃下10 000 r/min離心10 min，收集菌體，用等體積PBS(pH 7.9)重懸菌體，洗滌1次，4 ℃下10 000 r/min離心10 min，收集菌體，加入1/10體積的裂解緩沖液充分裂解，超聲破碎(超聲功率260 W，工作時(shí)間5 s，間隔時(shí)間10 s，超聲時(shí)間10 min)后，于4 ℃下10 000 r/min離心20 min，分別取等體積上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)。

利用Gel Quant Express軟件對(duì)上述SDS-PAGE電泳結(jié)果進(jìn)行分析，測(cè)定目的蛋白的表達(dá)量，根據(jù)數(shù)據(jù)分析的蛋白含量，從IPTG濃度(終濃度為0.10，0.25，0.50，0.75，1.00 mmol/L)、時(shí)間(12，24，36，48 h)中選取3個(gè)適合的水平，與誘導(dǎo)時(shí)間組成3因素 3水平的正交試驗(yàn)(表1)，分析各條件組合菌體破碎離心后上清組分和沉淀組分的蛋白含量，確定最佳溫度、IPTG終濃度和時(shí)間，優(yōu)化表達(dá)條件。

表 1　hGDF-15蛋白誘導(dǎo)表達(dá)條件優(yōu)化的L9(33)正交試驗(yàn)方案Table 1　Orthogonal test L9(33)for optimization of hGDF-15 protein induced conditions

1.2.4hGDF-15蛋白的Western blot檢測(cè)將誘導(dǎo)后獲得的hGDF-15蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，采用濕法轉(zhuǎn)印于PVDF膜上，轉(zhuǎn)印條件：300 mA，20 min。轉(zhuǎn)膜完成后，將PVDF膜放入封閉液(50 g/L脫脂乳粉)中平穩(wěn)振蕩2 h；用TBST(10 mmol/L Tris-HCL，100 mmol/L NaCl，體積分?jǐn)?shù)0.05% Tween-20，pH 7.4)洗滌3次，每次5 min；一抗(TBS稀釋的鼠抗His-Tag抗體，1∶20 000)4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗滌3次；二抗(TBS稀釋的羊抗鼠IgG(H+L)，1∶10 000) 37 ℃孵育1 h,TBST洗滌3次；用增強(qiáng)型HRP-DAB底物顯色試劑盒顯色10 min，清水沖洗終止顯色后分析。同時(shí)利用質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%BSA代替一抗作為空白對(duì)照。

2　結(jié)果與分析

2.1hGDF-15成熟肽基因的克隆

以hGDF-15原始質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，克隆hGDF-15成熟肽基因，結(jié)果(圖1)獲得了約339 bp的片段，與預(yù)期結(jié)果一致。

圖 1　hGDF-15成熟肽基因的PCR擴(kuò)增M.DL2000 DNA Marker;1.hGDF-15 PCR產(chǎn)物Fig.1　Electrophoresis of hGDF-15 mature peptide gene amplified with PCRM.DL2000 DNA Marker;1.hGDF-15 PCR products

2.2重組表達(dá)載體pET-28a-hGDF-15的鑒定

PCR驗(yàn)證獲得了約339 bp的片段，片段長(zhǎng)度與目的基因一致(圖2-A)。將質(zhì)粒PCR驗(yàn)證為陽(yáng)性的重組質(zhì)粒進(jìn)行NheⅠ和Hind Ⅲ雙酶切驗(yàn)證，酶切片段長(zhǎng)度與目的基因一致(圖2-B)。對(duì)測(cè)序鑒定所得核苷酸序列編碼的氨基酸序列與GenBank中的hGDF-15成熟肽氨基酸序列進(jìn)行對(duì)比，經(jīng)DNAMAN Version 5.2.2分析顯示，二者氨基酸序列同源性100%，說(shuō)明重組原核表達(dá)載體pET-28a-hGDF-15構(gòu)建成功。

圖 2　重組質(zhì)粒pET-28a-hGDF-15 PCR(A)和雙酶切(B)鑒定M.DL2000 DNA Marker;1.pET-28a-hGDF-15 PCR產(chǎn)物;2.pET-28a-hGDF-15 NheⅠ和Hind Ⅲ雙酶切產(chǎn)物Fig.2　Electrophoresis of pET-28a-hGDF-15 amplified with PCR and double digestionM.DL2000 DNA Marker;1.pET-28a-hGDF-15 PCR products;2.pET-28a-hGDF-15 double digested by NheⅠand Hind Ⅲ

2.3hGDF-15蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

本試驗(yàn)采用的pET-28a載體攜帶有His標(biāo)簽，不含標(biāo)簽的hGDF-15蛋白分子質(zhì)量為12.5 ku，經(jīng)ProParam分析，預(yù)計(jì)攜帶His標(biāo)簽的hGDF-15蛋白分子質(zhì)量為15 ku。

試驗(yàn)結(jié)果(圖3～5)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)誘導(dǎo)溫度為16 ℃時(shí)，菌體破碎離心后的上清組分在15 ku處有明顯的目的蛋白條帶，目的蛋白濃度隨IPTG濃度和誘導(dǎo)時(shí)間的變化無(wú)明顯差異；在25 和37 ℃條件下，菌體破碎離心后的上清組分在15 ku處無(wú)明顯的目的蛋白條帶。當(dāng)誘導(dǎo)溫度為16和37 ℃時(shí)，菌體破碎離心后的沉淀組分中在15 ku處有明顯的目的蛋白條帶；25 ℃條件下，菌體破碎離心后的沉淀組分在15 ku處無(wú)明顯的目的蛋白條帶。

圖 316 ℃誘導(dǎo)條件下pET-28a-hGDF-15表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳分析

a.裂解離心后的上清,b.裂解離心后的沉淀;M.蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1.未誘導(dǎo)pET-28a-hGDF-15;

2～6.分別為終濃度為0.10，0.25，0.50，0.75,1.00 mmol/L IPTG誘導(dǎo)下pET-28a-hGDF-15表達(dá)產(chǎn)物。下圖同

Fig.3SDS-PAGE electrophoretic analysis of pET-28a-hGDF-15 expression products under 16 ℃ inducing conditions

a.Supernatant after lysis centrifugation；b.Precipitation after lysis centrifugation；M.Protein Marker;1.pET-28a-hGDF-15 without induction by IPTG;2-6.Induced pET-28a-hGDF-15 with different levels of IPTG(0.10,0.25,0.50,0.75,1.00 mmol/L).The same for below

圖 4　25 ℃誘導(dǎo)條件下pET-28a-hGDF-15表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳分析Fig.4　SDS-PAGE electrophoretic analysis of pET-28a-hGDF-15 expression products under 25 ℃ inducing conditions

圖 5　37 ℃誘導(dǎo)條件下pET-28a-hGDF-15表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳分析Fig.5　SDS-PAGE electrophoretic analysis of pET-28a-hGDF-15 expression products under 37 ℃ inducing conditions

菌體裂解離心后上清和沉淀中hGDF-15蛋白含量的正交試驗(yàn)結(jié)果分別如表2和表3所示。由表2可知，各因素對(duì)菌體裂解離心后上清組分中hGDF-15蛋白含量的影響大小為IPTG濃度>溫度>時(shí)間，最佳表達(dá)條件為IPTG濃度0.25 mmol/L、溫度16 ℃、時(shí)間24 h，對(duì)應(yīng)上清組分中目的蛋白含量最高值為0.455 μg/μL，占菌體上清蛋白的43%。由表3可知，各因素對(duì)菌體裂解離心后沉淀中hGDF-15蛋白含量的影響大小為溫度>時(shí)間>IPTG濃度，最佳表達(dá)條件為溫度37 ℃、時(shí)間36 h、IPTG濃度1.00 mmol/L，對(duì)應(yīng)沉淀組分蛋白含量最高值為0.476 μg/μL，占菌體沉淀蛋白的36%。正交試驗(yàn)優(yōu)化出的最佳表達(dá)條件與試驗(yàn)實(shí)際測(cè)定結(jié)果相同。

表 2　菌體裂解離心后上清中hGDF-15蛋白含量的正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2　Orthogonal test results for supernatant of hGDF-15 products after lysis centrifugation

表 3　菌體裂解離心后沉淀中hGDF-15蛋白含量的正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3　Orthogonal test results for precipitate of hGDF-15 expression products after lysis centrifugation

2.4hGDF-15蛋白的Western blot檢測(cè)

圖6為hGDF-15蛋白的Western blot 檢測(cè)結(jié)果，空白對(duì)照經(jīng)DAB顯色反應(yīng)后無(wú)明顯藍(lán)紫色目的條帶出現(xiàn)，而待檢測(cè)的hGDF-15樣品在15 ku左右有一條明顯的目的條帶，說(shuō)明待檢測(cè)的樣品為hGDF-15蛋白。

3　討　論

目前，利用基因工程技術(shù)在大腸桿菌中表達(dá)外源蛋白應(yīng)用已較為廣泛，但是表達(dá)條件的確立、表達(dá)產(chǎn)率低等問(wèn)題是藥用蛋白生產(chǎn)工藝的技術(shù)難點(diǎn)，而且外源蛋白在大腸桿菌等原核工程菌中高效表達(dá)會(huì)發(fā)生空間結(jié)構(gòu)折疊錯(cuò)誤、氨基酸錯(cuò)配、二硫鍵形成不完全、無(wú)活性等問(wèn)題，即以包涵體形式存在。雖然包涵體形式表達(dá)的蛋白產(chǎn)量較穩(wěn)定，但是純化條件復(fù)雜、復(fù)性產(chǎn)率低，這制約著基因工程技術(shù)在藥用蛋白生產(chǎn)中的應(yīng)用。因此，通過(guò)融合表達(dá)、系統(tǒng)優(yōu)化表達(dá)條件等方法，適當(dāng)降低誘導(dǎo)表達(dá)溫度、減少IPTG用量，直接表達(dá)出具有生物活性的可溶性蛋白，成為減少包涵體形式蛋白表達(dá)的有效途徑之一。

圖 6　hGDF-15蛋白的Western blot檢測(cè)M.預(yù)染蛋白Marker(mid);1.空白;2.hGDF-15Fig.6　Western blot analysis of hGDF-15M.Premixed(mid)protein Marker; 1.Control;2.Sample of hGDF-15

Rosetta(DE3) 是BL21大腸桿菌工程菌的衍生菌，其含有BL21不具備的稀有密碼子。劉侃等[21]在BL21中表達(dá)胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF-1)，該包涵體蛋白的表達(dá)比例為30%，而本試驗(yàn)所表達(dá)的hGDF-15包涵體蛋白比例為36%，說(shuō)明Roestta系列菌株可以補(bǔ)充BL21所缺乏的稀有密碼子對(duì)應(yīng)的tRNA，更適合表達(dá)含稀有密碼子的真核蛋白，提高真核蛋白表達(dá)量。楊漸等[22]利用乳糖誘導(dǎo)IGF-1在大腸桿菌中表達(dá)的研究表明，相對(duì)低溫(30 ℃以下)條件能促進(jìn)可溶性蛋白表達(dá)，減少包涵體的形成，但其在20 ℃下誘導(dǎo)表達(dá)含量較低，僅為 11.3%，無(wú)法達(dá)到試驗(yàn)要求。本試驗(yàn)在相對(duì)低溫16 ℃的基礎(chǔ)上采用IPTG替代乳糖作為誘導(dǎo)劑，目的蛋白表達(dá)量占全菌體蛋白的43%，明顯高于楊漸等[2]的結(jié)果，其原因是IPTG為非代謝性誘導(dǎo)劑，不會(huì)被菌體消耗，而乳糖會(huì)在酶作用下異化被代謝消耗，導(dǎo)致誘導(dǎo)效果不理想。張守濤等[23]在IGF-1可溶性表達(dá)研究中，分別在15 ℃/20 h、25 ℃/14 h、30 ℃/7 h和37 ℃/4 h條件下進(jìn)行最佳誘導(dǎo)條件的摸索，IGF-1表達(dá)量為35%。本試驗(yàn)對(duì)誘導(dǎo)時(shí)間、溫度和IPTG濃度進(jìn)行梯度設(shè)計(jì)，利用正交試驗(yàn)方法較為系統(tǒng)地對(duì)hGDF-15可溶性和難溶性表達(dá)條件進(jìn)行了摸索，優(yōu)化出的最佳表達(dá)條件為：上清組分IPTG濃度0.25 mmol/L、溫度16 ℃、時(shí)間24 h；沉淀組分溫度37 ℃、時(shí)間36 h、IPTG濃度1.00 mmol/L。

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Cloning and prokaryotic expression ofhGDF-15

CONG Fanhao,ZHAO Jinqiao,LIU Yi,YANG Jingping,ZHANG Linbo

(SchoolofLifeSciences,JilinAgriculturalUniversity,Changchun,Jilin130118,China)

【Objective】 This study cloned the mature peptide gene of human growth differentiation factor-15 (hGDF-15),constructed its prokaryotic expression vector and induced its expression to provide foundation for research on pharmacological activity and biological function of hGDF-15.【Method】 PCR technology was used to clonehGDF-15 mature peptide gene,and the prokaryotic expression vector pET-28a-hGDF-15 was constructed and transformed intoE.coliRosetta(DE3)for expression.After being induced by different temperatures (16,25,and 37 ℃),IPTG concentrations (0.10,0.25,0.50,0.75,and 1.00 mmol/L) and durations (12,24,36,and 48 h),the expression products were analyzed by SDS-PAGE and Western blot.Using Gel Quant Express software,the content in the crushed bacteria centrifugal supernatant and precipitate was determined.The optimal expression conditions of supernatant and precipitate were then analyzed by orthogonal experiment.【Result】 ThehGDF-15 mature peptide gene (339 bp) was successfully cloned into pET28a prokaryotic expression vector and proteins were confirmed by Western blot.The optimal expression conditions for supernatant were 0.25 mmol/L IPTG,24 h at 16 ℃ and those for precipitate were 1.00 mmol/L IPTG,36 h at 37 ℃.【Conclusion】 ThehGDF-15 mature peptide gene was successfully cloned,the hGDF-15 proteins were expressed,and the optimal expression conditions were obtained.

GDF-15;prokaryotic expression;IPTG concentration;inductive duration;inductive temperature

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間:2016-07-1208:4510.13207/j.cnki.jnwafu.2016.08.029

2015-01-04

吉林省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(20130101105JC，20140204018YY)；國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)計(jì)劃項(xiàng)目；吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)大學(xué)生科技創(chuàng)新基金項(xiàng)目

叢凡淏(1989-)，男，吉林通化人，在讀碩士，主要從事免疫生物化學(xué)研究。E-mail:congfanhao@126.com

張林波(1973-)，男，吉林四平人，教授，博士，碩士生導(dǎo)師,主要從事免疫生物化學(xué)研究。E-mail:cczlb@126.com

R392.11

A

1671-9387(2016)08-0197-08

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