陳 浙，宋 革，周雪平，吳建祥

（浙江大學(xué)生物技術(shù)研究所/國家水稻生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 310058）

西瓜花葉病毒（WMV）單克隆抗體的制備及其應(yīng)用

陳 浙，宋 革，周雪平，吳建祥

（浙江大學(xué)生物技術(shù)研究所/國家水稻生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 310058）

【目的】制備抗西瓜花葉病毒（Watermelon mosaic virus，WMV）的特異性單克隆抗體，并以其為核心建立能快速有效地檢測WMV的血清學(xué)方法，從而為中國田間西瓜花葉病毒病的診斷和檢測、預(yù)測預(yù)警及科學(xué)防控體系的建立提供物質(zhì)和技術(shù)支撐?！痉椒ā坑锰峒兊腤MV病毒粒子免疫BALB/c小鼠，經(jīng)細(xì)胞融合和細(xì)胞培養(yǎng)、抗體篩選和細(xì)胞克隆等雜交瘤細(xì)胞技術(shù)，獲得能穩(wěn)定分泌抗WMV單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，將雜交瘤細(xì)胞注射入 BALB/c小鼠腹腔制備其單抗腹水，并以制備的單抗為核心建立能準(zhǔn)確、特異、靈敏地檢測田間植物中 WMV的ACP-ELISA、DAS-ELISA、dot-ELISA、Tissue blot-ELISA和IC-RT-PCR方法，以及能檢測單頭傳毒介體蚜蟲體內(nèi)WMV的dot-ELISA方法。【結(jié)果】3株能穩(wěn)定分泌WMV單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株（2C8、15A8和16C12）及其單抗腹水被制備，3株雜交瘤細(xì)胞分泌的單抗腹水的間接ELISA效價(jià)均達(dá)到了10-6以上，抗體類型及亞類均為IgG1、kappa輕鏈。Western blot分析發(fā)現(xiàn)，這3個(gè)單抗均與WMV的外殼蛋白亞基有特異性反應(yīng)。靈敏度分析結(jié)果表明，ACP-ELISA、DAS-ELISA、dot-ELISA和IC-RT-PCR方法檢測WMV病葉的靈敏度分別達(dá)到1∶163 840、1∶327 680、1∶5 120和1∶1 310 720倍稀釋（w/v，g/mL）。特異性分析結(jié)果表明，以這3個(gè)單抗為核心建立的ACP-ELISA、DAS-ELISA、dot-ELISA、Tissue blot-ELISA和IC-RT-PCR 5種血清學(xué)檢測方法均能與感染W(wǎng)MV的病葉發(fā)生特異性免疫反應(yīng)，而與感染小西葫蘆黃花葉病毒（Zucchini yellow mosaic virus，ZYMV）、黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）、黃瓜綠斑駁花葉病毒（Cucumber green mottle mosaic virus，CGMMV）、馬鈴薯Y病毒（Potato virus Y，PVY）的植物樣品、健康白南瓜、西瓜、葫蘆和煙草的植物組織均呈陰性反應(yīng)，且dot-ELISA方法還能特異性地檢測單頭蚜蟲體內(nèi)的 WMV，而在檢測無毒蚜蟲時(shí)呈陰性反應(yīng)。利用建立的血清學(xué)檢測方法對采自浙江省、江蘇省、山東省和海南省的275株葫蘆科疑似病株進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)187株植物感染W(wǎng)MV，發(fā)病率達(dá)68%，說明WMV在中國田間葫蘆科植物中廣泛流行發(fā)生，且血清學(xué)方法的檢測結(jié)果與RT-PCR方法的檢測結(jié)果完全一致，將部分PCR產(chǎn)物進(jìn)行核酸測序和序列比對分析，結(jié)果表明這些PCR產(chǎn)物是WMV CP基因片段，證明血清學(xué)方法檢測陽性的樣品確實(shí)感染W(wǎng)MV?！窘Y(jié)論】獲得了3株特異、靈敏的WMV單克隆抗體，以其為核心建立的5種血清學(xué)方法能準(zhǔn)確、靈敏、可靠地應(yīng)用于田間樣品中WMV的檢測，從而為中國WMV田間樣品的大規(guī)?？焖贆z測和診斷、該病害預(yù)報(bào)預(yù)警和科學(xué)防控提供物質(zhì)和技術(shù)支撐。

西瓜花葉病毒（WMV）；單克隆抗體；ACP-ELISA；DAS-ELISA；dot-ELISA；Tissue blot-ELISA；IC-RT-PCR

0　引言

【研究意義】西瓜花葉病毒（Watermelon mosaic virus，WMV）是世界上第一個(gè)鑒定的馬鈴薯Y病毒屬成員，由蚜蟲進(jìn)行非持久性傳播［1］。該病毒遍布世界各地，主要流行于溫帶和地中海地區(qū)。WMV在中國廣泛發(fā)生，已在陜西、山東、云南、遼寧、山西、新疆、河南和黑龍江等地鑒定到不同的分離物［2］。自然條件下，WMV可侵染葫蘆科、藜科、豆科等27科170多種植物，并常與黃瓜花葉病毒 （Cucumber mosaic virus，CMV）、小西葫蘆黃花葉病毒（Zucchini yellow mosaic virus，ZYMV）和南瓜花葉病毒 （Squash mosaic virus，SqMV）等病毒復(fù)合侵染［3］。WMV主要侵害西瓜和甜瓜等各種瓜類作物，近幾年在中國的發(fā)病率更是呈急劇上升趨勢，大部分地區(qū)因其造成的損失高達(dá)30%—50%，甚至絕產(chǎn)，WMV已經(jīng)成為制約西瓜和甜瓜高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的最主要因素之一［3-4］。因此，亟需建立一種快速、靈敏且可靠的WMV檢測體系，以完善中國西瓜花葉病毒病的預(yù)警和監(jiān)測體系?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前國內(nèi)外針對WMV的檢測方法主要包括生物學(xué)檢測方法、電鏡觀察檢測方法、分子生物學(xué)檢測方法和血清學(xué)檢測方法4種。2002年，李鳳梅等［5］發(fā)現(xiàn)可以用莧色藜和西葫蘆等指示植物鑒別 WMV；2015年，宋西嬌等［6］用透射電鏡負(fù)染色觀察病毒粒子形態(tài)，診斷出采自浙江龍游的疑似南瓜病株為 WMV 和ZYMV 兩種病毒復(fù)合侵染；ELBESHEHY等［1］根據(jù)WMV的CP序列設(shè)計(jì)引物，用RT-PCR方法檢測到了西瓜上的WMV；KWON等［7］在普通RT-PCR的基礎(chǔ)上，對多重RT-PCR體系各成分及反應(yīng)程序進(jìn)行摸索和優(yōu)化，建立了一種能同時(shí)檢測ZYMV、WMV、番木瓜環(huán)斑病毒（Papaya ringspot virus，PRSV）3種病毒的多重RT-PCR方法，大大節(jié)省了檢測成本及時(shí)間；孟娟等［8］以構(gòu)建的重組質(zhì)粒為模板，用PCR方法合成了相應(yīng)的地高辛標(biāo)記的cDNA探針，從而建立了WMV的斑點(diǎn)雜交檢測技術(shù)體系。但是，生物學(xué)檢測方法周期長且準(zhǔn)確性不高，而電鏡觀察和分子生物學(xué)檢測方法需要昂貴精密的儀器及專業(yè)的操作人員，均不適于大批量田間樣品檢測。血清學(xué)檢測方法憑借其操作簡單、特異性好、靈敏度高、快速和適于大批量檢測等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于植物病毒的檢測中。LIN等［9］利用Dr. Jan提供的WMV多抗建立了檢測WMV 的ACP-ELISA方法；LECOQ等［10］制備了WMV多抗，并建立了檢測WMV的DAS-ELISA方法；DESBIEZ等［11］建立了檢測WMV的TAS-ELISA方法；2013年，梁新苗等［12］以制備的WMV單克隆抗體為核心研發(fā)了TAS-ELISA試劑盒；而孔德昭等［13］也于2015年利用WMV CP的鼠單抗與兔多抗建立了TAS-ELISA和電化學(xué)紙質(zhì)免疫檢測傳感器檢測方法。【本研究切入點(diǎn)】以上這些方法中，前幾種以多抗建立的血清學(xué)方法并未見其在田間樣品大規(guī)模檢測中應(yīng)用的報(bào)道，且多抗在特異性、靈敏度等多方面均不如單抗，而后幾種方法所利用的WMV單抗的靈敏度均低于1∶640倍稀釋（w/v，g/mL），且未建立檢測蚜蟲的方法?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以提純的WMV病毒粒子作為免疫原，采用雜交瘤技術(shù)制備抗WMV的高特異性及靈敏度的單克隆抗體，并以其為核心建立能快速、特異、靈敏地檢測WMV的ACP-ELISA、DAS-ELISA、dot-ELISA、Tissue blot-ELISA和IC-RT-PCR方法，從而為中國田間WMV的診斷和科學(xué)防控提供技術(shù)和物質(zhì)支撐。

1　材料與方法

試驗(yàn)于 2015年在浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院完成。

1.1材料

1.1.1病毒 感染W(wǎng)MV的西瓜病葉采自浙江龍游，經(jīng)RT-PCR鑒定后種植于玻璃溫室中。感染W(wǎng)MV的蚜蟲是將健康蚜蟲飼養(yǎng)在WMV病株上而獲毒。感染ZYMV、CMV、黃瓜綠斑駁花葉病毒 （Cucumber green mottle mosaic，CGMMV）、馬鈴薯Y病毒（Potato virus Y，PVY）的植物及健康白南瓜、西瓜、葫蘆和煙草植物均種植于筆者實(shí)驗(yàn)室的玻璃溫室中。

1.1.2試劑及試驗(yàn)材料 RPMI-1640培養(yǎng)基、HAT、HT、抗體類型及亞類鑒定試劑盒、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AP）、AP標(biāo)記的羊抗鼠IgG二抗、辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的羊抗鼠IgG二抗均購自于Sigma公司。硝酸纖維素膜購自Amersham Pharmacia公司。NBT/BCIP底物及TMB顯色底物為Promega公司產(chǎn)品。其他試劑為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.2西瓜花葉病毒的提純

WMV的提純參照周雪平等［14］的方法，并作適當(dāng)?shù)母倪M(jìn)：稱取200 g病葉，每100 g病葉中加入pH 7.5 的0.5 mol·L-1磷酸鹽緩沖液（PB緩沖液）200 mL（含0.01 mol·L-1Na-EDTA和0.1%巰基乙醇），在組織攪拌器勻漿2 min后用雙層棉紗布過濾，濾液6 000 r/min離心20 min去植物組織殘?jiān)?；所得上清液在攪拌過程中加至終濃度為2.5% Triton X-100、4% PEG（分子量為6 000）和0.1 mol·L-1NaCl，然后4℃攪拌4 h以上；11 000 r/min離心15 min去上清；沉淀用pH 7.5的0.5 mol·L-1PB（含0.01 mol·L-1MgCl2和0.5 mol·L-1脲）充分懸浮，6 000 r/min離心15 min后吸出上清置于新的超離管中，沉淀再懸浮、離心，重復(fù)3次；合并上清液，33 000 r/min超速離心100 min，沉淀用PB懸浮后8 000 r/min離心15 min，沉淀再懸浮、離心，重復(fù)3次；合并上清液加至30%蔗糖墊上，33 000 r/min超速離心100 min；所得沉淀用pH 7.5的0.01 mol·L-1PB（含0.01 mol·L-1MgCl2）懸浮，33 000 r/min超速離心100 min，以去除蔗糖；所得沉淀用0.01 mol·L-1PBS懸浮，所得懸浮液即為病毒提純液；病毒提純液經(jīng)2%磷酸鎢（pH 6.7）負(fù)染后置JEOL JEM-1200EX電鏡下觀察粒子形態(tài)。純化的病毒粒子即可用于小鼠的免疫及單抗的制備。

1.3小鼠免疫、細(xì)胞融合、篩選及克隆

以提純的WMV病毒粒子作為免疫原，參照WU等［15］的免疫程序?qū)?周齡的BALB/c小鼠進(jìn)行免疫。四免之后3 d即可根據(jù)SHANG等［16］的方法將小鼠的脾臟細(xì)胞與SP2/0鼠骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合。篩選時(shí)，以健康西瓜汁液為陰性對照，提純的WMV病毒和感染 WMV的西瓜病汁液（1∶20倍稀釋，w/v，g/mL）為篩選抗原，用間接ELISA方法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中是否含有特異性抗WMV抗體。用有限稀釋法對特異性和靈敏度好的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行 2—3次單克隆化克隆。將最終篩選到的能穩(wěn)定傳代并持續(xù)分泌抗WMV單抗的雜交瘤細(xì)胞注射入小鼠腹腔制備腹水單抗，純化后保存于-80℃超低溫冰箱待用。

1.4腹水效價(jià)測定、抗體類型及亞類的鑒定

將感染W(wǎng)MV的西瓜病汁液（1∶20倍稀釋，w/v，g/mL）作為抗原進(jìn)行包被，采用間接ELISA方法測定腹水效價(jià)。并用Sigma公司的免疫球蛋白標(biāo)準(zhǔn)亞類鑒定試劑盒及其產(chǎn)品說明書的方法鑒定WMV單抗的抗體類型和亞類。

1.5Western blot分析單抗的特異性

參照LI等［17］的方法進(jìn)行Western blot分析，分別取0.1 g感染W(wǎng)MV的西瓜病葉、感染ZYMV的白南瓜病葉、感染CMV的西瓜病葉、感染CGMMV的西瓜病葉、感染PVY的煙草病葉、健康西瓜、白南瓜、葫蘆及煙草葉片，用液氮研磨后加入100 μL的2×上樣緩沖液，熱變性后離心取上清進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）并轉(zhuǎn)膜，以WMV單抗作為一抗，AP酶標(biāo)記的羊抗鼠 IgG為二抗，進(jìn)行Western blot，分析WMV單抗的特異性。

1.6ACP-ELISA方法的建立及其檢測應(yīng)用

1.6.1ACP-ELISA方法的建立 參照SHANG等［16］的方法，用方陣試驗(yàn)確定ACP-ELISA一抗和二抗的最適工作濃度，并根據(jù) LIU等［18］的方法建立檢測 WMV的ACP-ELISA方法。即將感染W(wǎng)MV的西瓜病葉用液氮研磨，并用0.05 mol·L-1碳酸鹽緩沖液（pH 9.6）按1∶30倍稀釋（w/v，g/mL）后，加入ELISA板孔中（100 μL/孔），置4℃過夜或37℃溫育2—3 h，用PBST洗滌3次，每次5 min；加入含3%脫脂奶粉的PBS封閉液（250 μL/孔），封閉30 min；棄封閉液拍干后，加入含3%脫脂奶粉的WMV單抗稀釋液或雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清（100 μL/孔），37℃孵育1 h；棄二抗反應(yīng)液后，用PBST洗滌4次，每次5 min，拍干后每孔加入顯色底物液100 μL（顯色底物液用pH為9.8的10%乙二醇銨和PNPP按1 mL∶1 mg的比例配制），置室溫下待其充分顯色；顯色30—50 min后，用2 mol·L-1氫氧化鈉終止反應(yīng)，將酶標(biāo)板置于Bio-Rad 680酶標(biāo)儀上測各孔OD405值，以P/N＞3.1作為陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.6.2分析ACP-ELISA方法及WMV單抗的特異性 用感染ZYMV、CMV、CGMMV和PVY的植物樣品粗提液為檢測抗原，同時(shí)以感染W(wǎng)MV的西瓜樣品為陽性對照，以健康白南瓜、西瓜、葫蘆和煙草作陰性對照，用包被液（0.05 mol·L-1碳酸鹽緩沖液，pH 9.6）按1∶30倍稀釋（w/v，g/mL），離心后加入ELISA板，分析WMV單抗及建立的ACP-ELISA方法檢測植物樣品的特異性。

1.6.3分析ACP-ELISA方法及WMV單抗的靈敏度 將感染W(wǎng)MV的西瓜病葉用液氮磨碎后，用包被緩沖液從1∶10到1∶1 310 720（w/v，g/mL）倍比稀釋病毒粗提液，健康西瓜葉片也作同樣倍比稀釋。按梯度順序包被ELISA板，用建立的ACP-ELISA方法測定檢測靈敏度。

1.7dot-ELISA和Tissue blot-ELISA方法的建立及其檢測應(yīng)用

1.7.1dot-ELISA和Tissue blot-ELISA方法的建立參照 SHANG等［16］的方法建立檢測 WMV的dot-ELISA和Tissue blot-ELISA方法。用方陣實(shí)驗(yàn)確定一抗及二抗的最適工作濃度，進(jìn)行dot-ELISA方法時(shí)，將植物樣品用液氮研磨后，按1∶20（w/v，g/mL）加入0.01 mol·L-1磷酸緩沖液（PBS，pH 7.4），5 000 r/min離心3 min后得到的上清即為病毒粗提液；蚜蟲樣品按每頭加入10 μL PBS并用牙簽搗爛，離心上清即為昆蟲病毒粗提液；取2.5 μL粗提液點(diǎn)到硝酸纖維素膜（NC膜）上，室溫干燥 10 min；進(jìn)行 Tissue blot-ELISA方法時(shí)，先將硝酸纖維素膜剪成適當(dāng)大小，鋪墊在一層干凈的吸水紙上。然后用手術(shù)刀片將植物莖迅速橫切，葉片需緊卷成筒后用刀片橫切，并將橫切面在膜上壓印3—5 s，印跡膜同樣需在室溫干燥10 min；將NC膜浸入到含5%脫脂奶粉的PBST封閉液中37℃封閉1 h；然后將NC膜放入含WMV單克隆抗體的5%脫脂奶粉PBST抗體稀釋液中，在水平搖床上緩慢搖動(dòng)1 h；棄一抗反應(yīng)液，用PBST于搖床上洗滌3次，每次5 min，然后置于用5%脫脂奶粉PBST抗體稀釋液稀釋的AP或者HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG二抗反應(yīng)液中，在水平搖床上緩慢搖動(dòng)1 h；棄二抗反應(yīng)液，用PBST洗滌5次，每次5 min，最后用PBS洗滌1次以去除膜表面的吐溫-20。 植物樣品用每10 mL底物緩沖液（0.1 mol·L-1Tris-HCl，0.1 mol·L-1NaCl，0.025 mol·L-1MgCl2，pH 9.5）加入66 μL NBT和33 μL BCIP底物進(jìn)行顯色反應(yīng)，肉眼觀察結(jié)果，陽性顯色為紫色，用自來水終止反應(yīng)，拍照記錄結(jié)果；而蚜蟲樣品因用HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG作為二抗，用TMB底物來進(jìn)行顯色，肉眼觀察結(jié)果，陽性顯色為藍(lán)色，拍照記錄結(jié)果。

1.7.2dot-ELISA方法的特異性分析 用感染ZYMV、CMV、CGMMV和PVY的植物樣品粗提液為檢測抗原，同時(shí)以感染W(wǎng)MV的西瓜樣品和蚜蟲為陽性對照，以健康白南瓜、西瓜、葫蘆和煙草及無毒蚜作陰性對照，用0.01 mol·L-1PBS（pH 7.4）按1∶30倍稀釋（w/v，g/mL），離心后取2.5 μL點(diǎn)于硝酸纖維素膜上，分析單抗及建立的dot-ELISA方法的特異性。

1.7.3Tissue blot-ELISA方法的特異性分析 用感染ZYMV、CMV、CGMMV和PVY的植物樣品為檢測抗原，同時(shí)以感染W(wǎng)MV的西瓜樣品為陽性對照，以健康白南瓜、西瓜、葫蘆和煙草作陰性對照，將其幼莖或者葉片用刀片橫切之后在硝酸纖維素膜上印跡，用建立的Tissue blot-ELISA方法分析WMV單抗及該方法的特異性。

1.7.4dot-ELISA方法的靈敏度分析 將感染 WMV的西瓜病葉用液氮磨碎后，用0.01 mol·L-1PBS（pH 7.4）從1∶20到1∶10 240（w/v，g/mL）倍比稀釋病毒粗提液，健康西瓜葉片也作同樣的倍比稀釋，按梯度順序取 2.5 μL稀釋液點(diǎn)到 NC膜上，用建立的dot-ELISA方法分析檢測靈敏度。

1.8DAS-ELISA方法的建立及其檢測應(yīng)用

1.8.1DAS-ELISA方法的建立 選擇針對WMV外殼蛋白且靈敏度高、特異性好的抗體，參照LING等［19］將其與 AP（Sigma，Missouri，USA）偶聯(lián)。將其他的WMV單抗與AP偶聯(lián)單抗進(jìn)行一對一配對，并分別分析各種組合的檢測靈敏度和特異性，根據(jù)CHEN等［20］的方法用靈敏度和特異性最好的捕獲抗體和酶標(biāo)抗體組合建立DAS-ELISA檢測方法。將捕獲抗體用包被液稀釋后，加入ELISA板（100 μL/孔），置4℃過夜或37℃溫育2—3 h后用PBST洗滌3次，每次3 min；加入含3%脫脂奶粉的PBS封閉液（250 μL/孔），于37℃孵育30 min；將植物樣品用液氮研磨，并用0.01 mol·L-1PBS（pH 7.4）按1∶30倍稀釋（w/v，g/mL）后，加入ELISA板孔中（100 μL/孔），37℃溫育1 h后用PBST洗滌3次，每次3 min；拍干后往ELISA板中加入用含3%脫脂奶粉PBS抗體稀釋液稀釋后的AP偶聯(lián)抗體（100 μL/孔），37℃溫育1 h；用PBST洗滌4次，每次3 min，拍干后每孔加入顯色底物液100 μL（顯色底物液用pH 9.8的10%乙二醇銨和PNPP按1 mL∶1 mg的比例配制），置室溫下待其充分顯色；顯色30—40 min后用2 mol·L-1氫氧化鈉終止反應(yīng)，將酶標(biāo)板置于 Bio-Rad680酶標(biāo)儀上測各孔OD405，以P/N＞3.1作為陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.8.2DAS-ELISA方法的特異性 用感染 ZYMV、CMV、CGMMV和PVY的植物樣品粗提液為檢測抗原，同時(shí)以感染W(wǎng)MV的西瓜樣品為陽性對照，以健康白南瓜、西瓜、葫蘆和煙草植物組織為陰性對照，用0.01 mol·L-1PBS（pH 7.4）按1∶30倍稀釋（w/v，g/mL）后加到已包被捕獲抗體的ELISA板中，分析建立的DAS-ELISA方法的檢測特異性。

1.8.3DAS-ELISA方法的靈敏度 將感染W(wǎng)MV的西瓜病葉用液氮磨碎后，用0.01 mol·L-1PBS（pH 7.4）從1∶10到1∶1 310 720（w/v，g/mL）倍比稀釋，健康西瓜葉片也作同樣的倍比稀釋。按梯度順序加到已包被捕獲抗體的ELISA板，分析DAS-ELISA方法的檢測靈敏度。

1.9IC-RT-PCR的建立

根據(jù) GenBank中報(bào)道的 WMV衣殼蛋白基因（CP）序列設(shè)計(jì)引物：WMV-CP-F： 5′-CATTGAAAA TGGAGTGACACTG-3′（對應(yīng)CP 4 953—4 974位）和WMV-CP-R：5′-GCCAAAACCTGCATCGCAC-3′（對應(yīng)CP 5 574—5 592位），并由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。參照WU等［15］的方法建立檢測WMV的IC-RT-PCR方法。

2　結(jié)果

2.1西瓜花葉病毒的提純

將提純的西瓜花葉病毒用2%磷酸鎢（pH 6.7）負(fù)染后置JEOL JEM-1200EX電鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)病毒粒子含量很高，粒子形態(tài)呈長約750 nm的線狀（圖1）。

圖1　提純的WMV病毒粒子電鏡照片F(xiàn)ig.1 Electron micrograph of the purified WMV

2.2雜交瘤細(xì)胞的篩選和克隆

將用WMV提純病毒免疫后的小鼠脾臟細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0進(jìn)行融合，并用HAT培養(yǎng)基篩選培養(yǎng) 12 d。經(jīng)觀察，24塊 96孔細(xì)胞板的融合率為100%。當(dāng)雜交瘤細(xì)胞生長至覆蓋孔底20%—30%時(shí)，采用病葉粗提液包被的ACP-ELISA方法分析細(xì)胞上清液中是否含WMV抗體，結(jié)果顯示有150個(gè)孔呈陽性，陽性率為6.5%。選出其中特異性和靈敏度好的細(xì)胞孔的細(xì)胞，進(jìn)行3次有限稀釋法克隆細(xì)胞，最終得到 3株能穩(wěn)定分泌WMV單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞（2C8、15A8和16C12）。

2.3腹水抗體制備、效價(jià)測定、抗體類型及亞類鑒定

8周齡的BALB/c小鼠腹腔注射0.3—0.5 mL降植烷，7—10 d后腹腔注射WMV雜交瘤細(xì)胞，約7—10 d后小鼠腹部明顯膨大，用采血針收集其腹水，每株雜交瘤細(xì)胞均獲得10 mL左右單抗腹水。腹水純化后測得IgG含量在7.32—10.27 mg·mL-1，抗體類型及亞類鑒定結(jié)果表明，這3個(gè)細(xì)胞株的抗體類型均為IgG1，輕鏈均為κ鏈，間接ELISA方法測得3株單抗腹水效價(jià)在10-6—10-7（表1）。

表1　抗WMV單克隆抗體的特性Table 1 Properties of monoclonal antibodies against WMV

2.4ACP-ELISA和Western blot方法的建立及其特性分析

方陣試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)檢測植物樣品時(shí)，單抗2C8、15A8和16C12的最適工作濃度為1∶5 000倍稀釋，而AP標(biāo)記的羊抗鼠IgG二抗以1∶8 000倍稀釋為佳。根據(jù)抗體的最適濃度建立檢測植物中 WMV 的ACP-ELISA方法，靈敏度分析表明，以單抗2C8、15A8或16C12為核心建立的ACP-ELISA方法對WMV病葉的檢測靈敏度達(dá)到1∶163 840倍稀釋（w/v，g/mL）（圖2）。特異性分析表明，這 3個(gè)單抗均只與感染W(wǎng)MV的植物組織發(fā)生強(qiáng)烈的陽性反應(yīng)，而不與感染ZYMV、CMV、CGMMV和PVY的植物組織、健康西瓜、白南瓜、葫蘆和煙草的植物組織發(fā)生任何反應(yīng)，且對比差異顯著 （圖3），說明這3個(gè)WMV單抗及建立的ACP-ELISA方法的特異性均很好。

圖2　建立的ACP-ELISA方法的靈敏度分析Fig.2 Sensitivity analyses of the developed ACP-ELISA

Western blot分析顯示這3個(gè)抗體均可以雜到一條近似37 kD的明顯條帶，與報(bào)道的WMV的CP蛋白大小相同，而在感染其他病毒的病葉和健康葉片中沒有雜到任何信號，與ACP-ELISA方法的檢測結(jié)果一致，表明這3個(gè)單抗對WMV具有很好的特異性（圖4）。

2.5dot-ELISA和Tissue blot-ELISA方法的建立及其特異性和靈敏度分析

方陣試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)檢測植物樣品時(shí)，單抗2C8、15A8和16C12的最適工作濃度為1∶5 000倍稀釋，而AP標(biāo)記的羊抗鼠IgG二抗以1∶8 000倍稀釋為佳；在檢測蚜蟲時(shí)，單抗15A8和16C12的最適工作濃度均為1∶5 000倍稀釋，單抗2C8以1∶4 000倍稀釋為宜，而HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG二抗以1∶7 000倍稀釋為佳。以抗體的最適濃度建立檢測植物和蚜蟲中WMV的dot-ELISA方法，以及檢測植物中WMV 的Tissue blot-ELISA方法。dot-ELISA方法特異性分析表明，這3個(gè)單抗均只與感染W(wǎng)MV的植物組織和攜帶WMV的蚜蟲發(fā)生強(qiáng)烈的陽性反應(yīng)，而不與感染ZYMV、CMV、CGMMV和PVY的植物組織、健康西瓜、白南瓜、葫蘆、煙草的植物組織及不帶毒蚜蟲發(fā)生任何反應(yīng)，說明這3個(gè)單抗及建立的dot-ELISA方法具有很好的特異性（圖5）。dot-ELISA方法靈敏度分析表明，以單抗15A8、16C12或2C8為核心建立的dot-ELISA方法對WMV病葉的檢測靈敏度達(dá)到1∶5 120倍稀釋（w/v，g/mL）（圖6）。

圖3　建立的ACP-ELISA方法的特異性分析Fig.3 Specificity analyses of the developed ACP-ELISA

圖4　Western blot分析單抗的特異性Fig.4 Specificity analyses of MAbs by Western blot

Tissue blot-ELISA方法特異性分析表明，用建立的Tissue blot-ELISA方法檢測感染W(wǎng)MV的西瓜植物組織時(shí)呈強(qiáng)烈的陽性反應(yīng)，而檢測感染ZYMV、CMV、CGMMV和PVY的植物組織、健康白南瓜、西瓜、葫蘆和煙草的植物組織時(shí)呈陰性反應(yīng)（圖 7），說明建立的Tissue blot-ELISA方法具有非常好的特異性。

2.6DAS-ELISA方法的建立及其特異性和靈敏度分析

經(jīng)不同單抗的組合配對試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)16C12單抗作為捕獲抗體，AP偶聯(lián)15A8單抗作為檢測抗體時(shí)，DAS-ELISA的檢測效果最好。方陣試驗(yàn)結(jié)果表明，捕獲抗體16C12以1∶5 000倍稀釋，AP偶聯(lián)15A8檢測抗體以1∶4 000倍稀釋時(shí)，DAS-ELISA的檢測靈敏度和特異性最好，因此將上述抗體的稀釋度作為該方法的最適濃度。根據(jù)抗體的最適濃度建立檢測WMV的DAS-ELISA方法。特異性分析發(fā)現(xiàn)，該方法檢測感染 WMV的西瓜植物組織時(shí)呈強(qiáng)烈的陽性反應(yīng)，而檢測感染ZYMV、CMV、CGMMV和PVY的植物組織、健康白南瓜、西瓜、葫蘆和煙草的植物組織時(shí)呈陰性反應(yīng)，且對比差異顯著（圖 8），說明該方法具有很好的特異性。靈敏度分析結(jié)果表明，該方法對WMV病葉的檢測靈敏度達(dá)到1∶327 680倍稀釋（w/v，g/mL）（圖9）。

圖5　建立的dot-ELISA方法的特異性分析Fig.5 Specificity analysis of the developed dot-ELISA

圖6　建立的dot-ELISA方法的檢測靈敏度分析Fig.6 Sensitivity analysis of the developed dot-ELISA

2.7IC-RT-PCR的建立

將單抗15A8作為捕獲抗體和設(shè)計(jì)的引物建立檢測WMV的IC-RT-PCR方法，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該方法能從感染W(wǎng)MV的病葉中擴(kuò)增到與預(yù)期大小一致的700 bp左右的特異性條帶（圖10-A）。用建立的 IC-PT-PCR方法檢測1∶1 310 720倍稀釋（w/v，g/mL）的感染W(wǎng)MV的西瓜病葉時(shí)，仍能夠擴(kuò)增到特異性的700 bp左右基因片段（圖10-B），而沒有用抗體捕獲的對照的靈敏度僅為1∶2 560倍稀釋（w/v，g/mL）（圖10-C）。將擴(kuò)增到的目的片段進(jìn)行克隆、測序和序列分析，結(jié)果表明其為WMV的外殼蛋白的基因片段，說明建立的IC-RT-PCR靈敏度高、特異性好，可用于WMV的檢測和診斷。

圖7　建立的Tissue blot-ELISA方法的特異性分析Fig.7 Specificity analysis of the developed Tissue blot-ELISA

圖8　建立的DAS-ELISA方法的特異性分析Fig.8 Specificity analysis of the developed DAS-ELISA

圖9　建立的DAS-ELISA方法的靈敏度分析Fig.9 Sensitivity analysis of the developed DAS-ELISA

圖10　建立的IC-RT-PCR檢測WMV的特異性（A）和靈敏度（B、C）Fig.10 Specificity （A） and sensitivity （B，C） analyses of the developed IC-RT-PCR

2.8血清學(xué)方法的田間應(yīng)用

以 WMV單抗為核心建立的 ACP-ELISA、dot-ELISA、Tissue blot-ELISA及DAS-ELISA方法特異性好、靈敏度高，且適于大批量田間樣品的檢測。利用這4種血清學(xué)方法及IC-RT-PCR、RT-PCR對采自浙江省、江蘇省、山東省和海南省的275株葫蘆科疑似病株進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中有187株植物感染W(wǎng)MV，發(fā)病率達(dá)68%（表2），說明WMV在中國田間葫蘆科植物的廣泛流行發(fā)生。部分代表性的dot-ELISA、Tissue blot-ELISA、DAS-ELISA和IC-RTPCR檢測結(jié)果如圖11所示。血清學(xué)方法的檢測結(jié)果與IC-RT-PCR、RT-PCR方法的檢測結(jié)果完全一致，部分PCR產(chǎn)物進(jìn)行核酸測序和序列比對分析表明，這些PCR產(chǎn)物是WMV CP基因片段，證明血清學(xué)方法檢測陽性的樣品確實(shí)感染W(wǎng)MV。

圖11　dot-ELISA （A）、Tissue blot-ELISA （B）、DAS-ELISA （C） 和IC-RT-PCR方法 （D） 檢測田間樣品的代表性結(jié)果Fig.11 Representative detection results of field samples by dot-ELISA （A），Tissue blot-ELISA （B），DAS-ELISA （C） and IC-RT-PCR （D）

3　討論

WMV是瓜類作物病毒最重要的病毒之一。自1954年首先于Florida的西瓜上發(fā)現(xiàn)后［21］，世界各地相繼報(bào)道了這種病毒，WMV迅速成為一種全球性的作物病毒，主要流行于溫帶和地中海地區(qū)［22］。中國山西、廣西、天津、安徽、遼中地區(qū)、陜西、新疆、山東、浙江和江蘇等多個(gè)地區(qū)均有WMV的報(bào)道［2］。隨著人們生活水平的不斷提高，葫蘆科作物在日常生活中的相對地位也不斷提高，而WMV的存在卻導(dǎo)致其損失慘重［9］。近幾年西瓜花葉病毒病在中國大部分地區(qū)造成的損失高達(dá)20%—50%，已成為生產(chǎn)上亟待解決的問題之一［23］。建立快速、特異、靈敏和高通量的檢測方法，對于檢測、診斷和科學(xué)防控西瓜花葉病毒病具有重要實(shí)際意義。

表2　田間樣品檢測Table 2 Detection of field samples

隨著生物技術(shù)的發(fā)展，植物病毒的檢測方法也被不斷改進(jìn)，血清學(xué)方法更是憑借其特有的優(yōu)點(diǎn)在實(shí)際的檢測中得到了廣泛的推廣和應(yīng)用。LIN等［9］利用Dr. Jan提供的WMV多抗建立了ACP-ELISA方法，以比較接種后轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因植物中 WMV的含量變化；LECOQ等［10］為了檢測進(jìn)口瓜果中的WMV，制備了WMV多抗，并建立了DAS-ELISA方法；DESBIEZ等［11］建立了WMV的TAS-ELISA檢測方法，以檢測不同地區(qū)的WMV分離物，分析其分子變異性。以上這些均是以WMV多抗為核心建立的血清學(xué)方法，但并未見其在田間樣品大規(guī)模檢測中應(yīng)用的報(bào)道，且多抗在特異性、靈敏度等多方面均不如單抗。2013年，梁新苗等［12］以制備的 WMV單克隆抗體為核心研發(fā)了TAS-ELISA試劑盒，但其抗體的效價(jià)只有10-5，且該試劑盒與同屬的一些病毒存在弱陽性反應(yīng)；孔德昭等［13］利用 WMV CP的鼠單抗與兔多抗建立了TAS-ELISA檢測方法和電化學(xué)紙質(zhì)免疫檢測傳感器，其中 TAS-ELISA方法的檢測靈敏度僅達(dá)到 1∶640 （w/v，g/mL），而電化學(xué)紙質(zhì)免疫檢測傳感器的靈敏度更低。眾所周知，血清學(xué)方法的主要缺點(diǎn)是靈敏度不如分子檢測方法，導(dǎo)致假陰性結(jié)果，而血清學(xué)方法的靈敏度主要由抗體的質(zhì)量決定。另外，還未見有能檢測蚜蟲中 WMV的抗體及血清學(xué)方法的相關(guān)報(bào)道。

本研究利用提純的WMV作為免疫原，經(jīng)細(xì)胞融合、篩選、克隆和腹水制備，共獲得了7株WMV特異性單克隆抗體，并建立了ACP-ELISA、dot-ELISA、Tissue blot-ELISA和 DAS-ELISA 4種血清學(xué)檢測方法。該 4種方法均能特異性地檢測 WMV，且dot-ELISA、ACP-ELISA和DAS-ELIS方法檢測植物樣品的靈敏度分別達(dá)到1∶5 120、1∶163 840和1∶327 680倍稀釋（w/v，g/mL）。據(jù)筆者所知，這是該病毒血清學(xué)檢測方法迄今為止最高的檢測靈敏度，從而為該病毒的準(zhǔn)確診斷和檢測提供可靠的檢測技術(shù)和檢測試劑。而且，在國內(nèi)外首次建立特異性地檢測單頭傳毒介體蚜蟲體內(nèi)WMV的dot-ELISA方法。Tissue blot-ELISA操作更簡單，成本更低，耗時(shí)短，尤其適合田間樣品的大規(guī)模檢測和診斷。另外，本研究還建立了檢測WMV的IC-RT-PCR方法，它將血清學(xué)方法和分子生物學(xué)手段進(jìn)行有機(jī)地結(jié)合，與常規(guī)的RT-PCR檢測相比，省去了提取RNA的步驟，避免了RNA提取過程中造成的損失和污染，且提高了血清學(xué)方法的檢測靈敏度和特異性，該建立的方法對感病植物組織的檢測靈敏度最高，達(dá)到1∶1 310 720（w/v，g/mL）。這些方法的建立為WMV田間樣品的大規(guī)?？焖贆z測提供了物質(zhì)和技術(shù)支撐，為中國西瓜花葉病毒病的預(yù)報(bào)預(yù)警體系和科學(xué)防控體系的建立打下了基礎(chǔ)。

4　結(jié)論

以提純的西瓜花葉病毒粒子為抗原，通過雜交瘤技術(shù)獲得了3株能穩(wěn)定傳代并分泌WMV單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株2C8、15A8和16C12，并以其分泌的單抗為核心建立了能準(zhǔn)確、特異、靈敏地檢測田間植物中WMV的ACP-ELISA、DAS-ELISA、dot-ELISA、Tissue blot-ELISA和IC-RT-PCR方法，以及能檢測傳毒介體蚜蟲體內(nèi)WMV的dot-ELISA方法。建立的5種血清學(xué)方法的田間樣品檢測結(jié)果表明，西瓜花葉病毒病在中國葫蘆科植物中廣泛發(fā)生流行。

References

［1］ ELBESHEHY E K F，METWALI E M R，ALMAGHRABI O A. Antiviral activity of Thuja orientalis extracts against Watermelon mosaic virus （WMV） on Citrullus lanatus. Saudi Journal of Biological Sciences，2015，22: 211-219.

［2］ 周健，顧興芳，張圣平，苗晗，程斐. 黃瓜對西瓜花葉病毒病抗性的研究進(jìn)展. 中國蔬菜，2012（10）: 7-13. ZHOU J，GU X F，ZHANG S P，MIAO H，CHENG F. Research progress in cucumber resistance to Watermelon mosaic virus. China Vegetables，2012（10）: 7-13. （in Chinese）

［3］ 張建新，劉起麗，吳云鋒. 西瓜花葉病毒外殼蛋白基因的克隆與原核表達(dá). 河南師范大學(xué)學(xué)報(bào) （自然科學(xué)版），2008，36（4）: 117-119. ZHANG J X，LIU Q L，WU Y F. Cloning and prokaryotic expression of coat protein gene from watermelon mosaic virus. Journal of Henan Normal University （Natural Science），2008，36（4）: 117-119. （in Chinese）

［4］ 王慧中，趙培潔，徐吉臣，趙懷，張紅生. 轉(zhuǎn)WMV-2外殼蛋白基因西瓜植株的病毒抗性. 遺傳學(xué)報(bào)，2003，30（1）: 70-75. WANG H Z，ZHAO P J，XU J C，ZHAO H，ZHANG H S. Virus resistance in transgenic watermelon plants containing a WMV-2 coat protein gene. Acta Genetica Sinica，2003，30（1）: 70-75. （in Chinese）

［5］ 李鳳梅，崔崇士，張耀偉. 西瓜花葉病毒的研究進(jìn)展. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，33（4）: 407-411. LI F M，CUI C S，ZHANG Y W. Research advance of Watermelon mosaic virus. Journal of Northeast Agricultural University，2002，33（4）: 407-411. （in Chinese）

［6］ 宋西嬌，陳浙，何步遠(yuǎn)，李艷敏，王榮洲，吳建祥，洪健. 西瓜花葉病毒和小西葫蘆黃花葉病毒復(fù)合侵染南瓜的透射電鏡診斷. 電子顯微學(xué)報(bào)，2015，34（2）: 126-131. SONG X J，CHEN Z，HE B Y，LI Y M，WANG R Z，WU J X，HONG J. Electron microscopic diagnosis of multiple pathogen of Watermelon mosaic virus and Zucchini yellow mosaic virus in infected Cucurbita moschata. Journal of Chinese Electron Microscopy Society，2015，34（2）: 126-131. （in Chinese）

［7］ KWON J Y，HONG J S，KIM M J，CHOI S H，MIN B E，SONG E G，KIM H H，RYU K H. Simultaneous multiplex PCR detection of seven cucurbit-infecting viruses. Journal of Virological Methods，2014，206: 133-139.

［8］ 孟娟，古勤生，林石明，彭斌，劉麗鋒，田延平，李莉. 地高辛標(biāo)記探針檢測 5種葫蘆科作物病毒的斑點(diǎn)雜交方法. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，40（12）: 2741-2746. MENG J，GU Q S，LIN S M，PENG B，LIU L F，TIAN Y P，LI L. Dot-blot hybridization for detection of five cucurbit viruses by digoxigenin-labelled cDNA probes. Scientia Agricultura Sinica，2007，40（12）: 2741-2746. （in Chinese）

［9］ LIN C Y，KU H M，CHIANG Y H，HO H Y，YU T A，JAN F J. Development of transgenic watermelon resistant to Cucumber mosaic virus and Watermelon mosaic virus by using a single chimeric transgene construct. Transgenic Research，2012，21（5）: 983-993.

［10］ LECOQ H，DESBIEZ C，WIPF-SCHEIBEL C，GIRARD M. Potential involvement of melon fruit in the long distance dissemination of cucurbit potyviruses. Plant Disease，2003，87: 955-959.

［11］ DESBIEZ C，COSTA C，GIRARD C M，LECOQ H. Serological and molecular variability of Watermelon mosaic virus （genus Potyvirus）. Archives of Virology，2007，152（4）: 775-781.

［12］ 梁新苗，李桂芬，馬潔，鄧叢良，邊勇，張永江，李建光，駱衛(wèi)峰，周琦. 西瓜花葉病毒單克隆抗體及TAS-ELISA試劑盒的研制. 植物檢疫，2013，27（2）: 53-56. LIANG X M，LI G F，MA J，DENG C L，BIAN Y，ZHANG Y J，LI J G，LUO W F，ZHOU Q. Preparation of the monoclonal antibody against Watermelon mosaic virus and TAS-ELISA kit. Plant Quarantine，2013，27（2）: 53-56. （in Chinese）

［13］ 孔德昭，朱怡橙，馬偉，徐麗廣，胥傳來. 西瓜花葉病毒三抗體夾心法與紙質(zhì)免疫檢測傳感器檢測方法的建立. 食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2015，34（4）: 367-371. KONG D Z，ZHU Y C，MA W，XU L G，XU C L. TAS-ELISA and electrochemical paper assisted immunosensor for the detection of Watermelon mosaic virus. Journal of Food Science and Biotechnology，2015，34（4）: 367-371. （in Chinese）

［14］ 周雪平，陳集雙，李德葆，李尉民. 馬鈴薯Y病毒組病毒高產(chǎn)量提取方法的建立. 微生物學(xué)通報(bào)，1994，21（3）: 184-186. ZHOU X P，CHEN J S，LI D B，LI W M. A method for high field extraction of potyviruses. Microbiology China，1994，21（3）: 184-186. （in Chinese）

［15］ WU J X，NI Y Q，LIU H，DING M，ZHOU X P. Monoclonal antibody-based serological assays and immunocapture-RT-PCR for detecting Rice dwarf virus in field rice plants and leafhopper vectors. Journal of Virological Methods，2014，195: 134-140.

［16］ SHANG H L，XIE Y，ZHOU X P，QIAN Y J，WU J X. Monoclonal antibody-based serological methods for detection of Cucumber green mottle mosaic virus. Virology Journal，2011，8（1）: 228.

［17］ LI N，CHEN Z，LIU Y，LIU Y，ZHOU X P，WU J X. Development ofmonoclonal antibodies and serological assays specific for Barley yellow dwarf virus GAV strain. Virology Journal，2015，12: 136.

［18］ LIU H，SONG X J，NI Y Q，LU L N，ZHOU X P，WU J X. Highly sensitive and specific monoclonal antibody-based serological methods for Rice ragged stunt virus detection in rice plants and rice brown planthopper vectors. Journal of Integrative Agriculture，2014，13（9）: 1943-1951.

［19］ LING K S，ZHU H Y，JIANG Z Y，GONSALVES D. Effective application of DAS-ELISA for detection of grapevine leafroll associated closterovirus-3 using a polyclonal antiserum developed from recombinant coat protein. European Journal of Plant Pathology，2000，106: 301-309.

［20］ CHEN H，OU Q B，TANG Y，GAO X H，WU L L，XUE C，YU C M，CUI J T，DIAO Y X. Development and evaluation of a DAS-ELISA for rapid detection of Tembusu virus using monoclonal antibodies against the envelope protein. PLOS ONE，2014，9（5）: e96366.

［21］ DESBIEZ C，JOANNON B，WIPF-SCHEIBEL C，CHANDEYSSON C，LECOQ H. Emergence of new strains of Watermelon mosaic virus in South-eastern France: Evidence for limited spread but rapid local population shift. Virus Research，2009，141: 201-208.

［22］ 張建新，吳云鋒，王睿，羅朝鵬. 西瓜花葉病毒中國分離株全基因組核苷酸序列測定. 病毒學(xué)報(bào)，2007，23（2）: 153-156. ZHANG J X，WU Y F，WANG R，LUO Z P. Complete nucleotide sequence of Watermelon mosaic virus China isolate. Chinese Journal of Virology，2007，23（2）: 153-156. （in Chinese）

［23］ 任春梅，程兆榜，繆倩，魏利輝，周益軍，范永堅(jiān). 江蘇省葫蘆科作物西瓜花葉病毒的分子鑒定和序列分析. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2013，44（9）: 1464-1470. REN C M，CHENG Z B，MIAO Q，WEI L H，ZHOU Y J，F(xiàn)AN Y J. Molecular identification and sequence analysis for watermelon mosaic virus in Jiangsu. Journal of Southern Agriculture，2013，44（9）: 1464-1470. （in Chinese）

（責(zé)任編輯 岳梅）

Preparation and Application of Monoclonal Antibodies Against Watermelon mosaic virus （WMV）

CHEN Zhe，SONG Ge，ZHOU Xue-ping，WU Jian-xiang
（Institute of Biotechnology，Zhejiang University/State Key Laboratory of Rice Biology，Hangzhou 310058）

【Objective】The aim of this study is to prepare monoclonal antibodies （MAbs） against Watermelon mosaic virus （WMV） and develop effective serological assays for rapid and reliable virus detection，and to provide technology and materiel fordiagnosis and detection，forecast and early warning and establishment of a scientific prevention and control system of the WMV disease.【Method】Using the purified WMV particles as an immunogen，hybridoma lines secreting MAbs specific for WMV were obtained via cell fusion，cell culture，antibody detection and cell cloning. The hybridomas were injected intraperitoneally into BALB/c mice to produce MAb-containing ascitic fluids. Based on the prepared MAbs，five detection assays，ACP-ELISA，DAS-ELISA，dot-ELISA，Tissue blot-ELISA and IC-RT-PCR were developed for accurately，sensitively and specifically detecting WMV in field plant samples. Besides，a dot-ELISA for specifically detecting WMV in individual viruliferous aphid was established.【Result】Three hybridoma lines （2C8，15A8 and 16C12） steadily secreting MAbs specific for WMV and their MAb-containing ascitic fluids were produced. The titers of ascitic fluids of MAbs were up to 10-6by indirect-ELISA. All these MAbs belong to IgG1 isotype，κ light chain. Western blot analyses indicated that all these three MAbs could specifically react with the coat protein of WMV. The ACP-ELISA，DAS-ELISA，dot-ELISA and IC-RT-PCR could detect WMV in infected plant crude extracts diluted up to 1∶163 840，1∶327 680，1∶5 120 and 1∶1 310 720 （w/v，g/mL），respectively. And the specificity analyses demonstrated that the developed ACP-ELISA，DAS-ELISA，dot-ELISA，Tissue blot-ELISA and IC-RT-PCR had strongly positive immune reactions with WMV-infected plant tissues，but had negative reactions with healthy，ZYMV-，CMV-，CGMMV-infected cucurbitaceous plant tissues or PVY-infected tobacco plant tissues. Besides，the developed dot-ELISA for detecting vector sample had a strongly positive immune reaction with individual viruliferous aphid，and negative reactions with non-viruliferous aphids. A total of 275 cucurbitaceous plant samples showing virus-like symptoms from Zhejiang，Jiangsu，Shandong and Hainan provinces in China were screened for the presence of WMV using the developed assays，and the detection results showed that 187 of the 275 plant samples were infected by WMV and the incidence rate was up to 68%，demonstrating that WMV is prevalent in field cucurbitaceous plants in China. And the detection results of serological assays were in agreement with those of RT-PCR. The sequences of PCR-amplified products were sequenced and compared with the WMV CP sequences. The results indicated that the nucleotide sequences of the PCR-amplified products were WMV CP gene segment，demonstrating that the positive samples tested by serological assays were really infected with WMV.【Conclusion】Three specific and sensitive MAbs against WMV and the five developed assays based on prepared MAbs in this study could accurately，sensitively and reliably detect WMV in field plant or vector samples，which would provide technology and materiel for rapid detection and diagnoses of field large-scale samples，forecast and early warning，scientific prevention and control of WMV disease in China.

Watermelon mosaic virus （WMV）； monoclonal antibody； ACP-ELISA； DAS-ELISA； dot-ELISA； Tissue blot-ELISA； IC-RT-PCR

2016-03-31；接受日期：2016-05-16

國家自然科學(xué)基金（31272015）、國家公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)（201203076-05）

聯(lián)系方式：陳浙，E-mail：chenzhelily@163.com。宋革，E-mail：songge3368@163.com。陳浙和宋革為同等貢獻(xiàn)作者。通信作者周雪平，E-mail：zzhou@zju.edu.cn。通信作者吳建祥，E-mail：wujx@zju.edu.cn