田兆豐，劉偉成，厚凌宇，謝 華，羅 晨，柴 敏

（1北京市農(nóng)林科學院植物保護環(huán)境保護研究所，北京 100097；2北京市農(nóng)林科學院蔬菜研究中心，北京 100097；3北京農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心，北京 100097）

不同番茄品種對番茄黃化曲葉病毒的抗病性分析

田兆豐1，劉偉成1，厚凌宇1，謝 華3，羅 晨1，柴 敏2

（1北京市農(nóng)林科學院植物保護環(huán)境保護研究所，北京 100097；2北京市農(nóng)林科學院蔬菜研究中心，北京 100097；3北京農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心，北京 100097）

【目的】番茄黃化曲葉病毒病 （Tomato yellow leaf curl virus，TYLCV） 是一種影響全世界番茄生產(chǎn)的病害，培育抗病品種是最有效、經(jīng)濟和持久的防控手段。目前生產(chǎn)上應用的抗病品種繁多，但存在對 TYLVC不同抗性基因的抗性水平研究甚少、了解不夠全面的問題。為了解帶有不同抗性基因的番茄品種對番茄黃化曲葉病毒病的抗性，對北京市農(nóng)林科學院蔬菜中心培育的番茄品種抗病性進行檢測，并利用半定量RT-PCR方法分析抗病基因和抗病蛋白的表達水平?！痉椒ā窟x取攜帶有Ty3a/Ty3a的番茄材料秋光285（Ty3a 純合）、棚137×246 （Ty3a 雜合），攜帶Ty1+Ty3a純合的秋光120、攜帶Ty1+Ty3a雜合的秋光81和感病對照M82為試驗材料，觀察番茄植株自然條件下發(fā)病情況。通過調(diào)查發(fā)病率和病情指數(shù)，考查這些番茄品種的抗病性，并利用RT-PCR方法分析抗病基因Ty1和Ty3a以及病程相關(guān)蛋白葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶基因的表達水平?！窘Y(jié)果】攜帶抗性基因的雜合體、純合體抗病性差異不明顯，含有兩個抗性基因和含有單一抗病基因品種的抗病性稍有差異，但差異不顯著。半定量RT-PCR結(jié)果顯示不同番茄品種在感染TYLCV后，體內(nèi)抗性基因表達量隨著發(fā)病時間的增加，Ty-3a和Ty-1的表達量逐漸增強。Ty-3a在4個番茄品種中表達水平由弱到強依次為秋光285（Ty-3a純合）、棚137×246（Ty-3a雜合）、秋光120（Ty-1+Ty-3a純合）和秋光81（Ty-1+Ty-3a雜合），Ty-1在秋光81中的表達顯著高于在秋光120中的表達。同時，植株體內(nèi)葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶基因表達量均比對照顯著增加，并隨著發(fā)病時間的增加逐漸增強。在發(fā)病20 d和30 d后，攜帶Ty-1+Ty-3a雜合的秋光81的葡聚糖酶基因表達顯著強于其他幾個品種?！窘Y(jié)論】幾個番茄材料對TYLCV的抗性由弱到強依次為秋光285（Ty3a 純合）、棚137×246（Ty3a雜合）、秋光120 （Ty1+Ty3a純合）和秋光81（Ty1+Ty3a雜合）。不同番茄抗病品種感染TYLCV后，體內(nèi)抗性基因表達量隨發(fā)病時間增加而增強，葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶基因表達量均比感病對照顯著增加，表明番茄抗病品種在感染TYLCV后的抗病性除了與抗性基因的表達有關(guān)外，同時也與抗病相關(guān)蛋白表達增強有關(guān)。

番茄黃化曲葉病毒；抗病基因；病程相關(guān)蛋白；半定量RT-PCR

0　引言

【研究意義】番茄黃化曲葉病毒病是由番茄黃化曲葉病毒（Tomato yellow leaf curl virus，TYLCV）引起的一種毀滅性病害，并通過煙粉虱（Bemisia tabaci）傳播［1］。近年來，隨著全球氣候變化和煙粉虱危害加重，番茄黃化曲葉病毒病在世界各地迅速擴散和蔓延。目前，這一病害已經(jīng)成為影響全世界番茄生產(chǎn)的主要限制因素之一［2-4］。番茄黃化曲葉病毒病具有發(fā)病率高、危害大、傳播效率高等特點［5］，采用化學農(nóng)藥、物理及生物防治在一定程度上可以減輕該病的危害，但不能從根本上解決問題，而培育番茄抗病品種才是最有效、經(jīng)濟和持久的防控手段［6-7］?！厩叭搜芯窟M展】在抗病育種研究方面，國外已經(jīng)有一些研究報道［8-9］。當前已經(jīng)報道的番茄黃化曲葉病毒的抗性基因有Ty-1、Ty-2、Ty-3、Ty-3a、Ty-4和Ty-5等。在國內(nèi)商業(yè)品種中Ty-1、Ty-2、Ty-3和Ty-3a已經(jīng)被開發(fā)利用。Ty-4和Ty-5抗性基因尚未在已有商業(yè)品種中檢測到［10-14］。Ty-1來自野生智利番茄材料 LA1969，該基因是第一個被定位的番茄黃化曲葉病抗病基因，位于番茄第6號染色體近著絲粒區(qū)域，Ty-3也位于番茄第6號染色體的長臂端，該基因來源于智利番茄LA2779和LA1932。Ty- 3在2個材料中的導入?yún)^(qū)段大小不同，為了便于區(qū)分，將LA1932中的抗病基因稱為Ty-3a。 Ty-2是源于多毛番茄B6013的一個完全顯性遺傳的抗性基因。通過選育，Ty-2被轉(zhuǎn)育到栽培番茄H24中，方便了對該基因的利用和研究。Ty-4來源于材料LA1932，被定為在番茄第3號染色體長臂端，Ty-5是秘魯番茄材料TY172抗黃化曲葉病的主效基因，可以解釋46.60%的表型變異，該基因位于番茄第4號染色體［15］。據(jù)報道，目前國內(nèi)田間表現(xiàn)抗病毒的番茄品種中83.26%的番茄品種攜帶有Ty-1，69.04%的番茄品種攜帶有Ty-3a，同時攜帶有Ty-1和Ty-3a的番茄品種高達62.34%，因此，番茄抗TYLCV育種中利用的主要抗病基因是Ty-1和Ty-3a［15］?！颈狙芯壳腥朦c】在TYLCV初發(fā)階段，抗病品種多引自國外或國外種業(yè)公司直接推廣自己的品種［16］；后來經(jīng)過國內(nèi)番茄育種工作者的努力，一些TYLCV抗源已成功地轉(zhuǎn)育成具有自主知識產(chǎn)權(quán)的、品種類型豐富的國產(chǎn)抗 TYLCV品種，并在生產(chǎn)中大面積推廣應用。但是，不同抗性基因的抗性背景不同，如何將不同來源的抗病基因聚合到同一品種，能否育成對TYLCV抗性更強的品種，在生產(chǎn)中的表現(xiàn)是否更加優(yōu)秀穩(wěn)定等亟需進一步明確?！緮M解決的關(guān)鍵問題】對北京市農(nóng)林科學院蔬菜中心培育的含有目前生產(chǎn)中廣泛使用的Ty-3a和Ty-1的番茄品種的抗病性進行分析，并對抗病基因和抗病蛋白的表達水平進行檢測，以期為種質(zhì)資源的合理利用和降低番茄黃化曲葉病毒的危害提供參考。

1　材料與方法

1.1材料

攜帶有Ty-3a的番茄材料秋光285（Ty-3a純合）、棚137×246（Ty-3a雜合），攜帶Ty-1+Ty-3a的秋光120（Ty-1+Ty-3a純合）、秋光81（Ty-1+Ty-3a雜合）和感病對照 M82均由北京市農(nóng)林科學院蔬菜中心番茄育種課題組柴敏研究員提供。

1.2番茄試材的培育及病毒病的傳播

所有番茄植株于2015年4月采取穴盤育苗的方式播種于設有防蟲網(wǎng)隔離的溫室中，自然生長，待幼苗生長至3—4葉期于5月5日移栽至北京市農(nóng)林科學院植物保護環(huán)境保護研究所日光溫室，每個品種移栽60 —80株。番茄移栽后按常規(guī)方法施肥和管理，定期觀察溫室內(nèi)煙粉虱的發(fā)生情況，同時觀察TYLCV在番茄上的發(fā)生情況，PCR方法定期檢測TYLCV，同時定時觀察和檢測TYLCV在番茄上的發(fā)生情況［17］。試驗在自然蟲口密度的條件下進行，取樣觀察期間不使用任何化學農(nóng)藥。

1.3病情調(diào)查與分析

發(fā)病癥狀按嚴重程度劃分為0、0.5、1、3、5、7、9共7個等級，分級標準、調(diào)查方法數(shù)據(jù)統(tǒng)計參見田兆豐等［17］。數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用 SAS 9.0 軟件，用Duncan氏新復極差法進行差異顯著性分析。

1.4番茄植株抗病基因及病程相關(guān)蛋白基因表達水平的檢測

從感病對照M82植株開始發(fā)病后的10、20、30 d，選取番茄幼苗生長點下第3片葉，采用半定量RT-PCR分別測定抗病基因Ty-1和Ty-3a以及病程相關(guān)蛋白葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶基因的相對表達量?？?RNA的提取采用RNeasy Mini kit（天根生化科技有限公司，北京，中國）并參照廠家的說明書進行操作。采用試劑盒avian myeloblastosis virus reverse transcriptase RNA PCRTM（TaKaRa）進行反轉(zhuǎn)錄，以不同處理的cDNA為模板進行PCR擴增，引物序列如表1 所示；PCR反應條件為95℃預變性4 min；95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個循環(huán)；72℃延伸10 min。取5 μL PCR產(chǎn)物在含有核酸熒光染料Gold View的1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察結(jié)果。Actin為內(nèi)參基因，所有結(jié)果重復3次。

表1　PCR 擴增引物Table 1 Primer sequences for PCR

2　結(jié)果

2.1不同番茄品種病情調(diào)查情況

從感病對照M82有個別植株開始發(fā)病后第10天調(diào)查結(jié)果顯示如表2，感病品種M82在第10天的發(fā)病率達到53%，病情指數(shù)為13.8，而其他幾個抗病品種沒有觀察到明顯的病狀或癥狀；在對照發(fā)病后第20天調(diào)查中，各番茄品種都有發(fā)病癥狀，其中對照發(fā)病率達到 100%，而且病情指數(shù)也相應較高，而抗病材料發(fā)病率較低且病情指數(shù)也很低。在對照發(fā)病后第30天調(diào)查中，對照的病情指數(shù)進一步升高，且其他幾個抗病品種的發(fā)病率也有所增加，但病情指數(shù)相對很低。綜合發(fā)病率和病情指數(shù)，幾個抗病品種發(fā)病程度從高到低依次為秋光285（Ty-3a純合）、棚137×246（Ty-3a雜合）、秋光 120 （Ty-1+Ty-3a純合）和秋光 81 （Ty-1+Ty-3a雜合）。統(tǒng)計分析結(jié)果表明，含有抗性基因的品種與不含抗性基因的對照品種的抗病性差異極顯著。但幾個抗病品種中，攜帶單一抗性基因的純合體和雜合體以及攜帶兩個抗性基因的純合體和雜合體之間的抗病性沒有差異顯著性。

表2　不同時期番茄品種病情調(diào)查結(jié)果Table 2 The disease degrees of tomato varieties at different times

2.2番茄植株抗病基因的表達分析

不同番茄品種在感染TYLCV后，體內(nèi)抗性基因表達量隨著發(fā)病時間的增加，兩個基因的表達量逐漸增強。同時，在每個調(diào)查時期，Ty-3a（約320 bp）在4個番茄品種中都有相同的表達趨勢，分別為秋光285 （Ty-3a純合）、棚 137×246（Ty-3a雜合）、秋光120（Ty-1+Ty-3a純合）和秋光81（Ty-1+Ty-3a雜合）依次增強，且Ty-1（約400 bp）在秋光81中的表達顯著高于在秋光120中的表達，表明兩個抗性基因在雜合體中的表達都比純合體高，而在同一品種中，含有兩個抗性基因與單抗性基因的番茄材料比較，Ty-3a的表達沒有顯著差異（圖1）。

圖1　不同番茄品種抗性基因Ty-3a（A）和Ty-1（B）的表達Fig.1 Expression of resistance genes Ty-3a （A） and Ty-1 （B） in different tomato varieties

2.3番茄植株病程相關(guān)蛋白基因的表達分析

不同番茄品種在感染TYLCV后，體內(nèi)葡聚糖酶（約800 bp）和幾丁質(zhì)酶（約750 bp）基因表達量均比對照顯著增加。隨著發(fā)病時間的增加，兩個基因的表達量逐漸增強。在發(fā)病后第10天，除了對照，各品種間葡聚糖酶基因表達沒有顯著差異，但是在發(fā)病20 d和 30 d后，攜帶Ty-1+Ty-3a雜合的秋光81的葡聚糖酶基因表達顯著強于其他幾個品種。幾丁質(zhì)酶基因有輕微逐漸增加的趨勢，但不顯著。由此可見，攜帶Ty-1+Ty-3a雜合的秋光81番茄品種在整個發(fā)病過程中，抗病蛋白葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶基因的表達都高于其他幾個品種，并且隨著發(fā)病時間的延長表達量顯著增強（圖2）。

圖2　不同番茄品種中葡聚糖酶（A）和幾丁質(zhì)酶（B）基因的表達Fig.2 Expression of glucanase （A） and chitinase （B） genes in different tomato varieties

3　討論

雖然目前報道的番茄黃化曲葉病毒的抗性基因有Ty-1、Ty-2、Ty-3、Ty-3a、Ty-4 和 Ty-5 等，且不同抗性基因在番茄TYLCV病害防御中的作用也有少量報道，但不同抗性基因?qū)YLCV病原的抗性水平不同，相關(guān)抗性基因在TYLCV病原侵染下的表達水平及差異鮮有報道。北京市農(nóng)林科學院蔬菜中心擁有較好的適合國內(nèi)生產(chǎn)的優(yōu)勢品種，利用從國外引進的抗源材料，育成適宜于中國北方地區(qū)栽培的穩(wěn)定的抗病番茄品種。本文對攜帶單一抗性基因Ty-3a純合與雜合和攜帶多個抗性基因Ty-1/Ty-3a純合和雜合的幾個番茄抗病品種進行了TYLCV病原侵染抗病性調(diào)查和抗性基因表達水平的分析，初步從分子水平上闡述了抗性基因與抗病性的關(guān)系，該研究結(jié)果對于番茄抗TYLCV品種的選育具有重要的參考價值。

病程相關(guān)蛋白（pathogenesis-related proteins，PRPs）是指植物在受到病原物侵染或非生物因子誘導協(xié)迫條件下產(chǎn)生的一類與植物抗性密切相關(guān)的水溶性蛋白［21］。其中，β-1，3-葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶作為抗病蛋白在植物抗真菌病害的防衛(wèi)反應中發(fā)揮重要作用，被廣泛應用于植物抗病基因工程育種實踐，同時測定β-1，3-葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶的表達情況也成為研究植物誘導抗病性效果的重要手段［22-24］。本研究結(jié)果表明不同番茄抗病品種在感染TYLCV后，體內(nèi)葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶基因表達量均比感病對照顯著增加。隨著發(fā)病時間的增加，兩個基因的表達量逐漸增強，且攜帶Ty-1+Ty-3a雜合的秋光81的葡聚糖酶基因表達量明顯高于其他幾個品種，表明抗病番茄品種對TYLCV抗病性與其病程相關(guān)蛋白表達存在一定的相關(guān)性。綜上所述，番茄抗病品種在感染TYLCV后的抗病性除了與抗性基因的表達有關(guān)外，同時也與抗病相關(guān)蛋白表達增強有關(guān)。

4　結(jié)論

調(diào)查結(jié)果表明幾個番茄材料對TYLCV的抗性由弱到強依次為秋光285（Ty-3a純合）、棚137×246 （Ty-3a雜合）、秋光120（Ty-1+Ty-3a純合）和秋光81（Ty-1+Ty-3a雜合），但4個抗病材料之間的抗性沒有顯著差異。同時半定量RT-PCR結(jié)果顯示，秋光81對TYLCV抗病性較強與其抗性基因和抗病蛋白表達增強有關(guān)。

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（責任編輯 岳梅）

Analysis of Resistance of Different Tomato Varieties to Tomato yellow leaf curl virus in Tomato

TIAN Zhao-feng1，LIU Wei-cheng1，HOU Ling-yu1，XIE Hua3， LUO Chen1，CHAI Min2
（1Institute of Plant & Environment Protection，Beijing Academy of Agriculture & Forestry Sciences，Beijing 100097；2Vegetable Research Center，Beijing Academy of Agriculture & Forestry Sciences，Beijing 100097；3Beijing Agro-Biotechnology Research Center，Beijing 100097）

【Objective】Tomato yellow leaf curl virus （TYLCV） disease is a serious threat to tomato production worldwide，breeding resistant varieties is the most economical，effective and friendly way to control this disease. Most of the tomato varietiesresistant to TYLCV used in production of China were introduced from abroad. Many new tomato varieties resistant to TYLCV have been obtained by breeding，but the resistance is unknown. In this paper，the resistance levels of the new tomato varieties resistant to TYLCV bred by Vegetable Research Center，Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences were assessed and the expression of resistance genes Ty-1/Ty-3a and the pathogenesis-related proteins glucanase/chitinase were analyzed. The purpose is to provide a reference for rational utilization of germplasm resources and reduce the harm of TYLCV.【Method】Four tomato varieties Qiuguang 285，Peng 137×246，Qiuguang 120 and Qiuguang 81 were used as the experimental materials. TYLCV disease incidence was observed in the field. The disease resistance of these tomato varieties was examined by investigating the disease incidence and index. The resistance levels of the new tomato varieties resistant to TYLCV were assessed and the expression of resistance genes and the pathogenesis-related proteins were analyzed by RT-PCR. 【Result】 The resistance of the hybrid was no obvious differences with that of the pure and the resistance of the two genes was a little higher than that of single resistance genes，but yet no significant differences. Semi-quantitative RT-PCR results showed that the expression of genes Ty-3a and Ty-1 increased with the increase of the incidence of TYLCCV in different tomato varieties. The expression level of Ty-3a in four tomato varieties from weak to strong is Qiuguang 285，Peng 137×246，Qiuguang 120 and Qiuguang 81. The expression of Ty-1 in Qiuguang 81 was obviously higher than that of in Qiuguang 120. The gene expression of glucanase and chitinase in vivo was significantly higher than that in the control. The expression of the two genes increased with the increase of the time. In the 20 and 30 days after appearing of disease，the expression of glucanase gene in Qiuguang 81 with the Ty-1+Ty-3a was significantly higher than that in other varieties.【Conclusion】The resistance of four tomato varieties to TYLCV from weak to strong is Qiuguang 285，Peng 137×246，Qiuguang 120 and Qiuguang 81. After the infection of TYLCV，the expression levels of resistance genes increased with the time of disease in different tomato varieties. The expression levels of glucanase and chitinase genes in vivo were significantly higher than those in the control. The results suggested that the high resistance of variety to TYLCV is related to the high expression of resistance gene and pathogenesis-related proteins.

Tomato yellow leaf curl virus； resistance gene； pathogenesis-related proteins； semi-quantitative RT-PCR

2016-02-15；接受日期：2016-05-28

國家科技支撐計劃（2012BAD19B00）、國家公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項（2013003019）、現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系北京市葉類蔬菜創(chuàng)新團隊（BAIC07-2016）

聯(lián)系方式：田兆豐，E-mail：zhaofengtian2000@yahoo.com。通信作者羅晨，E-mail：luochen1010@126.com。通信作者柴敏，E-mail：chaimin@nercv.org