于可響，馬秀麗，袁小遠(yuǎn)，劉存霞，胡 峰，凌紅麗，李玉峰，黃 兵

（1山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所/山東省家禽疫病診斷與免疫重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南 250023；2青島蔚藍(lán)生物股份有限公司，山東青島 266061）

鴨坦布蘇病毒雞胚弱化毒株的選育

于可響1，馬秀麗1，袁小遠(yuǎn)1，劉存霞1，胡 峰1，凌紅麗2，李玉峰1，黃 兵1

（1山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所/山東省家禽疫病診斷與免疫重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南 250023；2青島蔚藍(lán)生物股份有限公司，山東青島 266061）

【目的】將鴨坦布蘇病毒BZ_2010株在SPF雞胚上進(jìn)行連續(xù)傳代致弱，旨在選育安全性高、免疫原性好的活疫苗候選毒株?！痉椒ā恳許PF雞胚為增殖宿主，將BZ_2010株連續(xù)傳代，直至第120代，以1日齡雛鴨和30周齡的產(chǎn)蛋種鴨為試驗(yàn)對(duì)象，對(duì)第120代次毒株（命名為VC2）的安全性進(jìn)行評(píng)價(jià)；以1d雛鴨為試驗(yàn)對(duì)象，對(duì)VC2株的返強(qiáng)情況進(jìn)行評(píng)價(jià)；以18周齡的種鴨為試驗(yàn)對(duì)象，對(duì)VC2株免疫后的中和抗體進(jìn)行監(jiān)測(cè)；以25周齡的種鴨為試驗(yàn)對(duì)象，對(duì)VC2株免疫后的保護(hù)效果進(jìn)行評(píng)價(jià)；利用RT-PCR方法分別擴(kuò)增BZ_2010株和VC2株的E基因和NS4A基因，進(jìn)行測(cè)序分析。【結(jié)果】傳代病毒對(duì)雞胚的平均死亡時(shí)間逐漸縮短，而病毒毒價(jià)有逐漸提高的趨勢(shì)，ELD50由第20代的10-5.3/0.1mL提高到第120代的10-5.8/0.1mL，而且第80代之前提高較快，后期基本穩(wěn)定。將VC2株通過(guò)頸部皮下接種1d雛鴨和肌肉接種30周齡產(chǎn)蛋種鴨，接種后試驗(yàn)鴨無(wú)異常臨床表現(xiàn)，肝臟也無(wú)明顯病理變化，這說(shuō)明VC2株具有良好的安全性。將VC2在1d雛鴨進(jìn)行連續(xù)5次傳代，未發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)鴨有任何異常癥狀，將第5代組織懸液接種1d雛鴨，采集肝臟進(jìn)行病理切片觀察，發(fā)現(xiàn)無(wú)明顯病理變化，這說(shuō)明VC2株具有良好的穩(wěn)定性?；驕y(cè)序分析結(jié)果顯示，VC2株 E蛋白的第86、157、189、301和312位氨基酸發(fā)生改變，而NS4A蛋白只有一個(gè)氨基酸發(fā)生突變，即第54位氨基酸由F變?yōu)長(zhǎng)。VC2免疫種鴨后抗體水平上升很快，第4周即可達(dá)到高峰，并且維持較長(zhǎng)時(shí)間；VC2免疫后于第2周和第50周利用強(qiáng)毒株進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，結(jié)果VC2免疫組在攻毒后未出現(xiàn)異常癥狀，糞便正常，產(chǎn)蛋率保持正常，這說(shuō)明VC2株免疫可對(duì)強(qiáng)毒株的攻擊產(chǎn)生完全保護(hù)。【結(jié)論】通過(guò)雞胚連續(xù)傳代成功獲得了一株安全性高、免疫原性好的鴨坦布蘇病毒雞胚弱化毒株。VC2免疫種鴨后抗體水平上升很快，可維持較長(zhǎng)時(shí)間。攻毒試驗(yàn)結(jié)果表明，VC2株免疫可對(duì)強(qiáng)毒株的攻擊產(chǎn)生完全保護(hù)。

鴨坦布蘇病毒；雞胚；弱化；活疫苗

0　引言

【研究意義】鴨坦布蘇病毒病（duck Tembusu virus infection），又稱鴨黃病毒病，是2010年在中國(guó)首先暴發(fā)的一種新型傳染病。臨床上以種鴨、蛋鴨產(chǎn)蛋量驟減，育成鴨、商品肉鴨出現(xiàn)神經(jīng)癥狀為主要特征，該病來(lái)勢(shì)迅猛，傳播廣泛，給中國(guó)的種鴨養(yǎng)殖業(yè)造成的巨大經(jīng)濟(jì)損失［1-10］。目前，該病已經(jīng)成為一種常見(jiàn)病、多發(fā)病。本研究通過(guò)將鴨坦布蘇病毒在SPF雞胚上連續(xù)傳代，篩選出一株符合活疫苗標(biāo)準(zhǔn)的弱毒株，為鴨坦布蘇病毒活疫苗的研發(fā)奠定基礎(chǔ)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】該病的病原為鴨坦布蘇病毒，屬于黃病毒科黃病毒屬。病毒基因組為不分節(jié)段的具有感染性的正鏈單股RNA，由10 990個(gè)核苷酸組成，只有一個(gè)長(zhǎng)的開(kāi)放閱讀框，其中5′端有帽狀結(jié)構(gòu)，3′端無(wú)polyA尾［11-16］。編碼 3個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白基因：衣殼蛋白（C）、膜蛋白（PrM）、囊膜蛋白（E）和7個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白，其中E蛋白與病毒致病力、組織親嗜性、宿主嗜性、免疫保護(hù)等密切相關(guān)［17-18］?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】疫苗免疫是用于家禽疫病防控的主要措施，活疫苗的使用省時(shí)省力，適于在鴨群中批量免疫，但目前還沒(méi)有商品化的鴨坦布蘇病毒活疫苗，也沒(méi)有鴨坦布蘇病毒自然弱毒株的相關(guān)報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】將鴨坦布蘇病毒BZ_2010株在SPF雞胚上進(jìn)行傳代致弱，將120代次VC2毒株進(jìn)行了安全性、遺傳穩(wěn)定性和免疫效力評(píng)價(jià)，旨在選育一株安全性高、免疫原性好的活疫苗毒株。

1　材料與方法

試驗(yàn)于2011年1月至2015年5月在山東省家禽疫病診斷與免疫重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所進(jìn)行。

1.1病毒、雞胚、雛鴨、種鴨

鴨坦布蘇病毒BZ_2010株于2010年分自山東地區(qū) A種鴨場(chǎng)（在 10d SFP鴨胚上的 ELD50為10-6.2/0.1mL）；鴨坦布蘇病毒SX-12株于2012年分自山東地區(qū)B種鴨場(chǎng)（在10 d SFP鴨胚上的ELD50為10-5.9/0.1mL）；SPF雞胚由山東省昊泰動(dòng)物繁育有限公司提供；鴨坦布蘇病毒抗體陰性的櫻桃谷雛鴨和種鴨由山東省德州市某種鴨場(chǎng)提供。

1.2病毒傳代與滴定

將鴨坦布蘇病毒 BZ_2010株用生理鹽水以 1:1 000倍稀釋，通過(guò)尿囊腔途徑接種9d SPF雞胚，棄掉接種24h內(nèi)死亡的雞胚，觀察并記錄雞胚死亡時(shí)間。收集接種24h后死亡雞胚的尿囊液，按照前面的接種方法繼續(xù)進(jìn)行傳代，直至第120代（命名為VC2）。分別取第20、40、60、80、100和120代病毒在9 d SPF雞胚上測(cè)定雞胚半數(shù)致死量（ELD50）。方法如下：將病毒分別作10倍系列稀釋，即10-2、10-3…10-7、10-8共7個(gè)不同稀釋度，分別經(jīng)尿囊腔接種9 d雞胚，每個(gè)稀釋度接種5枚，0.1mL/枚，同時(shí)設(shè)生理鹽水對(duì)照組，觀察記錄接種后24—168 h內(nèi)雞胚死亡情況，并按Reed-Muench法計(jì)算ELD50。

1.3E蛋白與NS4A蛋白變異分析

參照BZ_2010株基因組序列（GenBank登錄號(hào)：KC990540）設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，分別用于擴(kuò)增VC2的E基因和NS4A基因，引物由上海立菲生物技術(shù)有限公司合成。按照RNAiso Reagent（TAKARA，JAPAN）試劑說(shuō)明提取VC2病毒RNA，按照常規(guī)RT-PCR方法擴(kuò)增E基因和NS4A基因并測(cè)序。將VC2的 E蛋白與NS4A蛋白序列同BZ_2010株進(jìn)行比對(duì)分析。

1.4安全性試驗(yàn)

將鴨坦布蘇病毒BZ_2010株和VC2株分別通過(guò)頸部皮下接種1 d雛鴨，接種劑量為104.0ELD50/只，每組試驗(yàn)鴨接種20只。10只對(duì)照鴨用同樣體積的生理鹽水進(jìn)行頸部皮下接種。接種后觀察試驗(yàn)鴨的精神狀態(tài)與死亡情況。采集接種后發(fā)病或死亡試驗(yàn)鴨的肝臟制備病理切片；若無(wú)發(fā)病或死亡的情況，則于接種后第7天剖殺試驗(yàn)鴨取肝臟制備病理切片。

將鴨坦布蘇病毒BZ_2010株和VC2株分別通過(guò)腿肌注射30周齡的產(chǎn)蛋種鴨，接種劑量為106.0ELD50/只，每組試驗(yàn)鴨接種30只。10只對(duì)照鴨用同樣體積的生理鹽水進(jìn)行腿肌接種。接種后觀察試驗(yàn)鴨的精神狀態(tài)與產(chǎn)蛋情況。

1.5病毒毒力返強(qiáng)試驗(yàn)

將VC2以105.0ELD50/只的劑量通過(guò)腿肌注射的方式接種1 d雛鴨10只，5 d后剖殺取肝、脾、腦制成20%懸液，凍融3次后，取上清液再接種1 d雛鴨10只，連續(xù)傳代5次，觀察雛鴨的精神狀態(tài)。將第5代的組織懸液通過(guò)頸部皮下接種1 d雛鴨10只，接種劑量為104.0ELD50/只，觀察雛鴨的精神狀態(tài)。采集第5代組織接種后發(fā)病或死亡實(shí)驗(yàn)鴨的肝臟制備病理切片；若無(wú)發(fā)病或死亡的情況，則于接種后第7天剖殺試驗(yàn)鴨取肝臟制備病理切片。

1.6免疫后抗體中和效價(jià)的測(cè)定

將VC2以103.5ELD50/只的劑量通過(guò)胸肌注射的方式免疫18周齡種鴨200只，每隔4周隨機(jī)采集20份鴨血清通過(guò)雞胚中和試驗(yàn)測(cè)定其中和抗體，直至免疫后56周，取中和抗體的平均值繪制抗體消長(zhǎng)曲線。

1.7免疫后攻毒保護(hù)試驗(yàn)

將VC2以103.5ELD50/只的劑量通過(guò)胸肌注射的方式免疫25周齡種鴨2 000只，分別于免疫后第2周和第50周利用鴨坦布蘇病毒SX-12株對(duì)試驗(yàn)鴨進(jìn)行攻毒，每組攻毒免疫鴨100只，陰性對(duì)照鴨100只，攻毒劑量為105ELD50/只。觀察并記錄試驗(yàn)鴨發(fā)病情況及產(chǎn)蛋情況。

2　結(jié)果

2.1病毒傳代

將鴨坦布蘇病毒BZ_2010在SPF雞胚上進(jìn)行連續(xù)傳代，結(jié)果發(fā)現(xiàn)雞胚的平均死亡時(shí)間有縮短的趨勢(shì)，而病毒毒價(jià)有逐漸提高的趨勢(shì)，ELD50由第 20代的10-5.3/0.1mL提高到第 120代的 10-5.8/0.1mL，而且第80代之前提高較快，后期基本穩(wěn)定（圖1）。

圖1　不同代次病毒的雞胚半數(shù)致死量Fig.1 ELD50of duck Tembusu virus VC2 strain at different passage times

2.2E蛋白與NS4A蛋白的變異分析

通過(guò)測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，VC2的E基因和NS4A基因與親本毒BZ_2010相比，分別有11個(gè)和3個(gè)堿基的差異，同源性分別為99.3%和99.2%。E基因的變異導(dǎo)致第86、157、189、301和312位氨基酸發(fā)生變化，而NS4A基因的變異導(dǎo)致第54位氨基酸由F變?yōu)長(zhǎng)（表1）。

2.3安全性試驗(yàn)

將BZ_2010和VC2分別通過(guò)頸部皮下接種1 d雛鴨20只，接種14 d內(nèi)BZ_2010接種組有7只死亡，大部分試驗(yàn)鴨死亡前有神經(jīng)癥狀，而VC2接種組無(wú)死亡，且不表現(xiàn)神經(jīng)癥狀。肝臟的病理切片顯示，BZ_2010組試驗(yàn)鴨的肝臟有明顯的脂肪變性，而VC2組與對(duì)照組相比無(wú)明顯變化（圖2）。

圖2　BZ_2010和VC2接種雛鴨后肝臟的病理變化Fig.2 Liver pathological changes of ducklings injected with BZ_2010 or VC2 （400×）

將BZ_2010和VC2分別通過(guò)腿肌注射30周齡的產(chǎn)蛋種鴨，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BZ_2010接種組從接種后第4天開(kāi)始出現(xiàn)綠色糞便，產(chǎn)蛋同時(shí)下降，至第9天產(chǎn)蛋量由接種前的26枚降到5枚。VC2接種組的產(chǎn)蛋量保持穩(wěn)定，糞便也無(wú)變化。

2.4病毒毒力返強(qiáng)試驗(yàn)

將VC2在1 d雛鴨進(jìn)行連續(xù)5次傳代，未發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)鴨有任何異常癥狀。第5代組織懸液頸部皮下接種1 d雛鴨，也未發(fā)現(xiàn)任何異常癥狀。第5代組織接種后第7天剖殺實(shí)驗(yàn)鴨取肝臟制備病理切片，結(jié)果顯示，VC2組與對(duì)照組相比，肝臟無(wú)明顯病理變化（圖3）。

圖3　第5代組織接種雛鴨后肝臟的病理變化Fig.3 Liver pathological changes of ducklings injected by fifth tissue （400×）

2.5免疫后抗體中和效價(jià)的測(cè)定

VC2免疫18周齡種鴨后定期采集血清，利用雞胚中和試驗(yàn)測(cè)定其中和抗體，繪制抗體消長(zhǎng)曲線（圖4）。結(jié)果顯示，VC2免疫后前4周中和抗體上升很快，到第4周時(shí)基本達(dá)到高峰，高峰期維持20周，然后緩慢下降，到56周時(shí)中和抗體效價(jià)仍能達(dá)到1∶22。

表1　第120代次病毒株的核苷酸與氨基酸突變情況Table 1 Change of nucleotide and amino acid of Tembusu virus at passage 120

圖4　VC2免疫種鴨抗體消長(zhǎng)曲線Fig.4 Neutralization antibodies change curve of adult duck after VC2 immunization

2.6免疫后攻毒保護(hù)試驗(yàn)

VC2免疫25周齡種鴨，分別于免疫后第2周和第40周對(duì)試驗(yàn)鴨進(jìn)行攻毒，結(jié)果顯示：免疫后第2周攻毒的對(duì)照組從攻毒后第4天開(kāi)始出現(xiàn)綠色糞便，產(chǎn)蛋率從第3天開(kāi)始下降，到第15天降至20%，VC2免疫組在攻毒后未出現(xiàn)異常癥狀，糞便正常，產(chǎn)蛋率保持正常的上升趨勢(shì)（圖5）。免疫后第50周攻毒的對(duì)照組從攻毒后第5天開(kāi)始出現(xiàn)綠色糞便，產(chǎn)蛋率從第5天開(kāi)始出現(xiàn)明顯下降，到第15天降至33%，VC2免疫組在攻毒后未出現(xiàn)異常癥狀，糞便正常，產(chǎn)蛋率保持穩(wěn)定（圖6）。

圖5　VC2免疫后第2周攻毒種鴨產(chǎn)蛋率的變化Fig.5 Laying rate change of ducks with SX-12 challenging at weeks 2 post-vaccination

圖6　VC2免疫后第50周攻毒種鴨產(chǎn)蛋率的變化Fig.6 Laying rate change of ducks with SX-12 challenging at weeks 50 post-vaccination

3　討論

鴨坦布蘇病毒病自從2010年在中國(guó)暴發(fā)以來(lái)，一直困擾著種鴨業(yè)的發(fā)展，生產(chǎn)中急需高效疫苗來(lái)預(yù)防該病。本研究將鴨坦布蘇病毒山東分離株BZ_2010在SPF雞胚進(jìn)行連續(xù)傳代，直至第120代，獲得的第120代次毒株VC2的ELD50由親本毒的10-5.3/0.1mL提高到10-5.8/0.1mL，說(shuō)明病毒在傳代過(guò)程中毒價(jià)在逐步上升。為了確定VC2株是否已經(jīng)致弱，筆者分別通過(guò)頸部皮下接種1d雛鴨和肌肉接種30周齡產(chǎn)蛋種鴨，結(jié)果顯示，VC2接種后試驗(yàn)鴨無(wú)異常癥狀和死亡，糞便和產(chǎn)蛋率也保持正常。這些都說(shuō)明VC2毒株已完全喪失了對(duì)鴨的致病力。進(jìn)而又將該致弱株在1 d雛鴨體內(nèi)進(jìn)行了毒力返強(qiáng)試驗(yàn)，連續(xù)傳5代未出現(xiàn)任何返強(qiáng)跡象，這些數(shù)據(jù)表明，VC2候選疫苗株具有良好的安全性。

鴨坦布蘇病毒的E蛋白與病毒致病力、宿主嗜性等密切相關(guān)，而有報(bào)道非結(jié)構(gòu)蛋白NS4A影響日本乙型腦炎對(duì)小鼠的致病力［19-25］。因此，選擇了E和NS4A這兩個(gè)蛋白進(jìn)行測(cè)序分析，試圖在基因水平上找到VC2喪失對(duì)鴨的致病力原因。通過(guò)與親本毒BZ_2010比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，E蛋白的第86、157、189、301和312位氨基酸發(fā)生變化，其中第157、189位氨基酸位于結(jié)構(gòu)域I區(qū)，這一區(qū)域內(nèi)發(fā)生的很多突變都與黃病毒毒力相關(guān)而NS4A蛋白只有一個(gè)氨基酸的突變，即第54位氨基酸由F變?yōu)長(zhǎng)。這些突變或者突變組合（包括其他蛋白）可能是導(dǎo)致VC2致病力減弱的關(guān)鍵因素［26-30］。

為了評(píng)價(jià)弱毒株VC2的免疫效果，筆者進(jìn)行中和抗體追蹤和攻毒保護(hù)試驗(yàn)。結(jié)果顯示，VC2免疫種鴨后抗體水平上升很快，并且維持時(shí)間較長(zhǎng)，衰減緩慢；VC2免疫后第2周和第50周都可產(chǎn)生完全保護(hù)，這說(shuō)明VC2的免疫期很長(zhǎng)，基本可以持續(xù)整個(gè)產(chǎn)蛋期。

4　結(jié)論

通過(guò)將鴨坦布蘇病毒在 SPF雞胚上進(jìn)行連續(xù)傳代，獲得了安全性高、免疫原性好的弱毒株VC2，為鴨坦布蘇病活疫苗的研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯 林鑒非）

Selection of a Live Chicken Embryo Attenuated Duck Tembusu Virus Vaccine

YU Ke-xiang1，MA Xiu-li1，YUAN Xiao-yuan1，LIU Cun-xia1，HU Feng1，LING Hong-li2，LI Yu-feng1，HUANG Bing1
（1Key Laboratory of Poultry Disease Diagnose and Immune of Shandong Province/Institute of Poultry，Shandong Academy of Agricultural Sciences，Jinan 250023；2Qingdao Vland Biotech Inc.，Qingdao 266061，Shandong）

【Objective】 Tembusu virus BZ-2010 strain was continuously passaged in specific-pathogen-free embryonic （SPF）eggs in order to select a live attenuated vaccine candidate of good safety and immunogenicity properties. 【Method】 Tembusu virus BZ-2010 strain was cultured for 120 passages in SPF eggs. The safety of the 120th passage viral strain was evaluated with 1-day-old SPF ducklings and 30-week-old egg-laying ducks. The property of virulent return of VC2 viral strain was evaluated with 1-day-old SPFducklings. The neutralizing antibodies were detected after the 18-week-old breeding ducks were immunized with VC2 strain. The protective effects were evaluated after the 25-week-old breeding ducks were immunized with VC2 strain. E gene and NS4A gene of BZ_2010 and VC2 strains were amplified by RT-PCR and sequenced. 【Result】 The average death time of SPF eggs was shortened by passage virus and viral titer was increased with the escalation of passage times in SPF chicken embryonic eggs. ELD50of the 20th virus was 10-5.3/0.1mL and ELD50of the 120th virus was 10-5.8/0.1mL.The viral titer reached the plateau at passage 80 and remained unchanged further passages. The experimental ducks showed no clinical symptoms after 1-day-old ducklings and 30-week-old breeding ducks were immunized with VC2 strain by subcutaneous injection and by intramuscular injection，respectively. The results showed that VC2 strain had a good safety. No symptoms appeared in 1-day-old ducklings in which VC2 strain were cultured for 5 passages. 1-day-old ducklings were infected with the 5th tissue suspension and no symptoms were observed in liver pathological section by microscope. The results showed that VC2 strain had a good stability. Sequence analysis revealed that the E protein of Tembusu VC2 evolved amino acid changes in positions 86，157，189，301，and 302，respectively. The NS4A protein of Tembusu VC2 only had one amino acid change in position 54 in that phenylalanine was replaced by Leucine. The level of antibodies rose very quickly，reached the plateau at the 4th week and remained a long time. Ducks were challenged by TMUV virulent strain at 2 and 50 weeks after immunization with VC2 strain in the experimental group. There was no symptom，normal stool，and regular egg production in the vaccinated group after challenge of virulent strain. The results showed that VC2 strain could provide complete protection for the challenge of TMUV virulent strain.【Conclusions】 An attenuated strain of TMUV with good immunogenicity and high safety was acquired through serial passages of SPF chicken embryos. The level of antibodies rose very quickly and remained a long time after immunization of the VC2 attenuated strain. The toxicity attack experiments showed that VC2 could provide complete protection for the challenge of TMUV virulent strain.

duck Tembusu virus； chicken embryo； attenuation； live vaccine

2015-12-21；接受日期：2016-05-04

山東省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（ZR2013CM037）、山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系家禽創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)計(jì)劃（SDAIT-13-011-01）、山東省海外高層次人才（泰山學(xué)者）引進(jìn)計(jì)劃

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