戴　暉　蒙鳳貞（廣東省佛山市第一人民醫(yī)院（中山大學(xué)附屬佛山醫(yī)院）藥學(xué)部　佛山　528000）

高效液相色譜法測(cè)定何首烏中二苯乙烯苷及大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷的含量

戴暉蒙鳳貞（廣東省佛山市第一人民醫(yī)院（中山大學(xué)附屬佛山醫(yī)院）藥學(xué)部佛山528000）

目的：探討高效液相色譜法（HPLC法）對(duì)何首烏中有效成分二苯乙烯苷及大黃素-8-0-β-D-葡萄糖苷含量進(jìn)行測(cè)定。方法：采用Phenomenex C18（250mm×4.6mm，5μm）色譜柱，流動(dòng)相選擇乙腈∶水=25∶75，流速為1.0mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為322nm，柱溫為25℃。結(jié)果：二苯乙烯苷的線性回歸方程為：Y=3.247×105X+1.951×104（r=0.9999），在4.021～40.12μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；大黃素-8-0-β-D-葡萄糖苷線性回歸方程為：Y=1.501×105X+0.352×104（r=0.9998），在0.012～25.00μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。二苯乙烯苷的平均加樣回收率為99.79%，RSD=1.23%，大黃素-8-0-β-D-葡萄糖苷平均加樣回收率為99.51%，RSD=1.52%。結(jié)論：高效液相色譜法測(cè)定何首烏中的兩種有效成分，操作簡(jiǎn)單快速，穩(wěn)定性好，精密度高，重現(xiàn)性好，為何首烏中有效成分的含量測(cè)定提供了有效的方法。

高效液相色譜法 何首烏 二苯乙烯苷 大黃素-8-0-β-D-葡萄糖苷

何首烏始載于《開寶本草》，是寥科植物何首烏（Polygonum multiflorum Thumb）的干燥塊根［1］，有我國(guó)傳統(tǒng)“四大仙草”之一的美稱。何首烏具有解毒、截瘧、消癰、潤(rùn)腸通便的功效，臨床上用于治療瘡癰、久瘧體虛、腸燥便秘等［2］。對(duì)于何首烏的成分研究多集中在其有效成分二苯乙烯苷類、蒽醌類、黃酮類以及磷脂類等的研究中［3］，目前對(duì)于核苷類成分的分析方法主要有熒光法、離子交換色譜法、高效液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)等［4］。本次研究采用了高效液相色譜法對(duì)何首烏中二苯乙烯苷和蒽醌類成分大黃素-8-0-β-D-葡萄糖苷進(jìn)行含量測(cè)定，為何首烏藥材質(zhì)量的綜合評(píng)價(jià)提供可靠的檢測(cè)手段。

1　實(shí)驗(yàn)材料

1.1實(shí)驗(yàn)儀器：美國(guó)Waters公司生產(chǎn)的Waters717高效液相色譜儀，配有溶劑洗脫裝置、自動(dòng)進(jìn)樣器，Waters717色譜檢測(cè)系統(tǒng)；GR-201型電子分析天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；B3201D-T型超聲波清洗器；7230型電熱鼓風(fēng)干燥箱；SGDY5-III型電熱恒溫水浴箱，W2011T-I型高速冷凍離心機(jī)。

1.2實(shí)驗(yàn)試藥：何首烏藥材為我市中藥材中心銷售，經(jīng)專家鑒定為真品；二苯乙烯苷對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110845-201206）；大黃素-8-0-β-D-葡萄糖苷（中國(guó)藥品生物制品檢定所，生產(chǎn)批號(hào)：20120425）；乙腈為色譜純（北京化工科技有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：20130223），水為三蒸水，其他試劑均為分析純。

2　方法與結(jié)果

2.1色譜條件的選擇：采用Phenomenex C18（250mm×4.6mm，5μm）色譜柱，流動(dòng)相選擇乙腈∶水=25∶75，流速為1.0mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為322nm，柱溫為25℃，進(jìn)樣量為20μL，見圖1。

2.2對(duì)照品溶液的制備：分別取二苯乙烯苷、大黃素-8-0-β-D-葡萄糖苷對(duì)照品，精密稱定后置于同一25mL容量瓶中，用75%乙醇溶液定溶至刻度后搖勻，精密吸取3.5mL采用75%乙醇溶液定溶至10mL容量瓶中，搖勻后即得二苯乙烯苷、大黃素-8-0-β-D-葡萄糖苷混合對(duì)照品溶液。

2.3供試品溶液的制備：精密稱取中藥材何首烏1.0g粉碎后，加入75%乙醇溶液100mL溶解后放置于回流瓶?jī)?nèi)，水浴鍋中加熱煮沸后回流提取45min后，冷卻并稱定質(zhì)量，用75%乙醇溶液將損失的質(zhì)量補(bǔ)足后搖勻，過0.22μm的微孔濾膜，得到供試品溶液。

2.4線性關(guān)系考察：精密吸取“2.2”項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液0、0.1、0.5、2.0、5.0、10.0mL置于10mL容量瓶中，采用75%乙醇溶液定溶至刻度后，分別精密吸取20μL，按照“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以對(duì)照品的峰面積值作為縱坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的濃度值作為橫坐標(biāo)繪制線性回歸方程。二苯乙烯苷的線性回歸方程為：Y=3.247×105X+1.951×104（r=0.9999），在4.021～40.12μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；大黃素-8-0-β-D-葡萄糖苷線性回歸方程為：Y=1.501×105X+0.352×104（r=0.9998），在0.012～25.00μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5精密度考察：精密吸取同一混合對(duì)照品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下的色譜條件分別重復(fù)進(jìn)樣5次，計(jì)算成分的色譜峰面積的RSD值分別為1.22%、1.04%，均符合精密度實(shí)驗(yàn)的要求，表明實(shí)驗(yàn)儀器的精密度良好。

2.6重復(fù)性考察：取“2.3”項(xiàng)下的供試品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下的色譜條件重復(fù)測(cè)定5次，計(jì)算二苯乙烯苷和大黃素-8-0-β-D-葡萄糖苷含量的RSD值分別為2.3%、1.8%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.7穩(wěn)定性考察：取同一批次的樣品藥材按照“2.3”項(xiàng)下供試品溶液的制備方式配置溶液，分別在第1、2、4、6、10、12、16、24h按照“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣，其二苯乙烯苷、大黃素-8-0-β-D-葡萄糖苷含量的RSD值分別為1.3%、1.0%，表明供試品溶液在24h內(nèi)具有較好的穩(wěn)定性。

2.8加樣回收率試驗(yàn)：取已知含量的何首烏樣品共5份，精密稱定后按照“2.3”項(xiàng)下的供試品溶液配制方法制備溶液，分別精密加入已知含量的二苯乙烯苷、大黃素-8-0-β-D-葡萄糖苷對(duì)照品溶液，根據(jù)“2.1”項(xiàng)下的色譜條件及線性回歸方程樣品測(cè)定方法計(jì)算，結(jié)果見表1、表2。

表1　二苯乙烯苷加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=5）

3　小結(jié)

3.1供試品溶液制備條件的選擇：本次實(shí)驗(yàn)中比較了超聲提取和回流提取的效果［5］，結(jié)果表明回流提取時(shí)提取率高于超聲提取方式，提取時(shí)間短，適用于對(duì)熱敏感的有效成分的提取，因此在實(shí)驗(yàn)中采用了回流提取的方式進(jìn)行供試品溶液的制備。

表2　大黃素-8-0-β-D-葡萄糖苷加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=5）

3.2檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇：通過對(duì)二苯乙烯苷紫外吸收波長(zhǎng)的檢測(cè)，結(jié)果表明在322nm處兩種成分具有相對(duì)最大吸收波長(zhǎng)，且無其他成分的干擾峰出現(xiàn)，因此選擇322nm作為成分的檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.3流動(dòng)相和色譜柱溫的選擇：流動(dòng)相采用了乙腈：水、甲醇：水，結(jié)果表明乙腈：水=25∶75時(shí)分離效果好。柱溫考察了溫度為20℃、25℃、30℃條件下兩種成分的分離效果，表明在25℃時(shí)兩種成分分離效果好，因此實(shí)驗(yàn)時(shí)選擇了溫度為25℃的色譜條件。

［1］李文仕.反相高效液相色譜法測(cè)定何首烏顆粒中二苯乙烯苷的含量［J］.右江民族醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2014，3（1）：362-364.

［2］彭貴龍，周光明，楊遠(yuǎn)高，等.高效液相色譜同時(shí)測(cè)定何首烏中大磺酸、大黃素和大黃酚的含量［J］.四川大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，51（2）：350-352.

［3］高攀峰，馮鵬飛.高效液相色譜法測(cè)定調(diào)血降脂丸中何首烏苷含量［J］.實(shí)用中醫(yī)內(nèi)科雜志，2014，28（12）：119-121.

［4］林武俊，陳小玉，劉可福，等.HPLC法測(cè)定康欣膠囊中二苯乙烯苷的含量［J］.海峽藥學(xué)，2011，23（8）：80-82.

［5］羅益遠(yuǎn).超高效液相色譜-四級(jí)桿/線性例子質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定不同產(chǎn)地何首烏中10種核苷類成分［J］.分析測(cè)試學(xué)報(bào)，2015，35 （5）：519-524.

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1672-8351（2016）09-0011-02