鄒亞娟,代博娜

(上海交通大學(xué) 分析測試中心，上海　200240)

?

研究報告(069～073)

基于NMR技術(shù)的溶菌酶在瓊脂糖凝膠中的動力學(xué)研究

鄒亞娟,代博娜

(上海交通大學(xué) 分析測試中心，上海200240)

運(yùn)用脈沖梯度場測量自擴(kuò)散系數(shù)及自旋自旋弛豫時間測量核磁共振技術(shù)對雞蛋清溶菌酶(HEWL)在瓊脂糖凝膠中的動力學(xué)進(jìn)行了研究.試驗結(jié)果表明，HEWL在瓊脂糖凝膠中的自擴(kuò)散系數(shù)及自旋自旋弛豫時間較其在純乙酸鈉溶液中變小，說明瓊脂糖凝膠的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)使HEWL分子整體運(yùn)動及局部運(yùn)動都受到阻礙. 并且隨著瓊脂糖濃度的增大，凝膠網(wǎng)孔尺寸不斷減小，HEWL分子運(yùn)動受限程度加劇，從而蛋白質(zhì)分子可以較長時間內(nèi)停留在高濃度區(qū)，分子間更容易互相碰撞，發(fā)生反應(yīng)，晶核生長得以促進(jìn). 同時瓊脂糖凝膠較小流體力學(xué)網(wǎng)孔尺寸抑制聚晶或沉淀的出現(xiàn)，晶體質(zhì)量獲得提高.

瓊脂糖凝膠；核磁共振；溶菌酶；蛋白質(zhì)結(jié)晶

溶菌酶又稱胞壁質(zhì)酶，是由129個氨基酸組成的一種無毒且具有一定溶菌作用的堿性球蛋白，可溶于水和酸性溶液，耐熱, 在pH 4～7的范圍內(nèi), 100 ℃處理1 min仍有近100%的活力，在食品、醫(yī)學(xué)、生物工程等多種領(lǐng)域中用途非常廣泛，目前實際應(yīng)用和已商品化的是雞蛋清溶菌酶(HEWL)[1-4]. 在結(jié)晶蛋白中，溶菌酶是一種模型蛋白，1946年，四方晶系蛋清溶菌酶單晶首次由Alderton獲得，隨后其結(jié)晶條件被繼續(xù)深入研究. 到20世紀(jì)80年代初時，人們已經(jīng)對溶菌酶結(jié)晶與溫度、pH值、NaCl濃度等反應(yīng)條件之間的關(guān)系有了一個初步的較完整的研究結(jié)果. 然而，溶菌酶結(jié)晶目前仍屬于科學(xué)者非常感興趣的領(lǐng)域，被越來越廣泛地研究.

瓊脂糖凝膠因為可以促進(jìn)晶核形成、抑制堆積效應(yīng)已經(jīng)被應(yīng)用于蛋白結(jié)晶研究[5]. 研究者發(fā)現(xiàn)，瓊脂多糖的濃度對蛋白晶體的形成有巨大的影響，但是，目前對其作用機(jī)理研究得還是不夠透徹.

核磁共振(NMR)波譜的許多參數(shù)，如化學(xué)位移、縱向(T1)、橫向(T2)弛豫時間和自擴(kuò)散系數(shù)(D)等，與原子核所處的化學(xué)環(huán)境及其運(yùn)動狀態(tài)密切相關(guān). 通過測量這些參數(shù)，可以獲得體系中的各種信息. 對蛋白質(zhì)分子的NMR弛豫行為進(jìn)行研究，是了解蛋白質(zhì)運(yùn)動特性的有效手段之一[6]. 蛋白質(zhì)分子在溶液中的整體轉(zhuǎn)動和內(nèi)運(yùn)動，使得局部磁場的空間取向隨時間不斷發(fā)生改變，作用于原子核從而產(chǎn)生自旋弛豫現(xiàn)象. 由于局部磁場隨時間的隨機(jī)漲落對分子內(nèi)運(yùn)動非常敏感，所以可以利用弛豫參數(shù)這一內(nèi)在探針來探測蛋白質(zhì)的動力學(xué)性質(zhì)，因而NMR核自旋弛豫實驗成為蛋白質(zhì)動力學(xué)研究最直接、也最廣泛使用的方法.

分子自擴(kuò)散系數(shù)的大小與分子的結(jié)構(gòu)和所處的介質(zhì)有關(guān)，測定自擴(kuò)散系數(shù)可以表征分子運(yùn)動狀態(tài)，以及與分子運(yùn)動狀態(tài)有關(guān)的一些物理和化學(xué)變化，如分子的聚集狀態(tài)、分子間的相互作用、溶液的粘度、溫度等. 因此通過測量分子的自擴(kuò)散系數(shù)，可以研究分子間的相互作用，聚集狀態(tài)等問題[7]. 測量分子自擴(kuò)散系數(shù)的方法有重量法、膜滲透法、熒光法和動態(tài)光散射法等. 這些研究方法都提供了有關(guān)高分子形態(tài)和結(jié)構(gòu)的相關(guān)信息以及遷移現(xiàn)象，而脈沖梯度(PFG)NMR測量自擴(kuò)散系數(shù)技術(shù)對樣品的溶劑無選擇性、對樣品無損害，并且隨著NMR儀器硬件的逐漸發(fā)展、脈沖梯度場強(qiáng)度逐漸提高以及脈沖序列的不斷更新，PFG NMR可以檢測的高分子分子量范圍逐漸擴(kuò)大，其實際應(yīng)用價值不斷提高.

本文應(yīng)用NMR方法，對溶菌酶在瓊脂糖凝膠中的動力學(xué)進(jìn)行了評價，以探討瓊脂糖凝膠對溶菌酶結(jié)晶的影響.

1　試驗部分

1.1儀器與試劑

Bruker Avance II 400WB超導(dǎo)核磁共振波譜儀及Bruker DIFF-60自擴(kuò)散探頭.

瓊脂多糖(Sea plaque，Mw=2.422 × 105，Lonza公司，catalogue No. F5170A)；雞蛋清溶菌酶(HEWL，Mw=14k Da，DaSeikagaku公司，catalogue No. 100940)；

重水(Aldrich公司，氘代度99.9%，catalogue No. 151882)；

乙酸鈉(AR，Aladdin公司，catalogue No. 127-09-3).

1.2NMR樣品制備

將瓊脂糖粉末分散在重水里，室溫下攪拌2 h，然后在85 ℃下加熱1 h直至樣品完全溶解，制備質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.2%～6.0%的瓊脂多糖溶液，將雞蛋溶菌酶粉末溶解在0.3 mol/L的乙酸鈉溶液(pH 4.5)里，雞蛋溶菌酶的質(zhì)量濃度為150 mg/mL. 將瓊脂多糖溶液、雞蛋溶菌酶溶液及純凈水按體積比1∶1∶1，在55 ℃充分混合，迅速轉(zhuǎn)移到預(yù)熱過的直徑為10 mm的核磁管內(nèi)，然后將核磁管放在4 ℃冰箱里保持1 h，最終所制備的樣品中瓊脂糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.0%～2.0%，雞蛋溶菌酶的質(zhì)量濃度為50 mg/mL，乙酸鈉的濃度為0.1 mol/L.

1.3NMR測試

溶液NMR試驗采用BrukerAvance II 400WB核磁共振波譜儀，其1H的共振頻率為400.13 MHz，梯度場處于z方向上. 試驗所用脈沖序列為STE和 CPMG-spin-echo (SE)，如圖1所示.

擴(kuò)散試驗梯度場強(qiáng)度從700 gauss/cm逐步(分8次)等間隔遞增到1 300 gauss/cm，擴(kuò)散時間設(shè)置為5 ms. 橫向弛豫時間T2測量時τ設(shè)為2 ms，n的list為：1、3、5、7、9、11、13、15，擴(kuò)散時間設(shè)為5 ms.1H的90度脈沖的寬度為16 μs，弛豫延遲時間為5 s，采樣次數(shù)為32，采樣點數(shù)為8 192. 試驗采用的溫控系統(tǒng)為BVT 3200，樣品實際溫度由放置在核磁管中的光纖溫度計(Takaoka Electric Manufacturing Co.)測定，如圖2所示，溫控誤差為±0.1 K. 試驗溫度為25 ℃，在樣品放入磁體中恒溫30 min后開始采樣. 自擴(kuò)散系數(shù)由以式(1)計算[8-9]：

I(g) =I(0) exp[-γ2g2Dδ2(Δ -δ/3)]

(1)

其中,I(g)和I(0)分別為t= 2τ2+τ1梯度脈沖存在及梯度脈沖為零時1H的信號強(qiáng)度，γ為1H的磁旋比，脈沖梯度場寬度δ為1 ms.1H化學(xué)位移以HDO質(zhì)子信號(25 ℃，相對于DSS為δ4.70)為標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定.

2　結(jié)果與討論

2.1HEWL在乙酸鈉溶液及瓊脂糖凝膠中的自擴(kuò)散系數(shù)

HEWL在0.1 mol/L乙酸鈉溶液及質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.4%～2.0%的瓊脂糖凝膠中，自擴(kuò)散系數(shù)從PFG-STE1H NMR試驗求得. 圖3(a)、(b)分別為HEWL在0.1 mol/L乙酸鈉溶液及質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.6%瓊脂糖凝膠中的PFG-STE1H核磁共振試驗堆積譜圖. 由圖3可見，分子擴(kuò)散運(yùn)動引起NMR信號強(qiáng)度的衰減，與梯度脈沖的脈寬δ、強(qiáng)度g及分子的自擴(kuò)散系數(shù)D有關(guān). 我們將脈沖梯度場的強(qiáng)度從700 gauss/cm開始等間隔遞增，記錄一系列相應(yīng)的1D1H NMR譜，然后對化學(xué)位移8.0～12.0 ppm的HEWL的譜峰進(jìn)行積分. 樣品中所含小分子的信號由于其自身的快速自擴(kuò)散運(yùn)動而衰減為零.

圖4為所選積分區(qū)域的試驗數(shù)據(jù)以γ2g2δ2(Δ -δ/3)對積分強(qiáng)度的自然對數(shù)值作圖. 由圖4可以看出，隨著瓊脂糖濃度的增加，曲線的斜率變小. 盡管HEWL的分子量分布存在一定的范圍，但所用樣品在所有時刻的試驗數(shù)據(jù)都是呈線性分布的. 因此，我們根據(jù)式(1)，按單指數(shù)進(jìn)行擬合，得到HEWL的平均自擴(kuò)散系數(shù)值D. 在純乙酸鈉溶液中，HEWL自擴(kuò)散運(yùn)動最快；而在瓊脂糖凝膠中，隨著瓊脂糖濃度的增加，DHEWL逐漸減小.

質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%～2%瓊脂糖溶液的凝膠轉(zhuǎn)變溫度在40 ℃附近[10]. 在樣品溫度驟降到凝膠轉(zhuǎn)變溫度以下時，瓊脂糖多糖分子會經(jīng)歷從無序的無歸線團(tuán)到有序的雙螺旋的構(gòu)象轉(zhuǎn)換，而后于分子鏈之間產(chǎn)生氫鍵作用和分子纏結(jié)，形成交聯(lián)點，最終形成聚合物網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)(如圖5所示). 瓊脂糖濃度越大，形成的凝膠網(wǎng)孔尺寸越小. 很多試驗證明，蛋白質(zhì)結(jié)晶的首要條件是達(dá)到過飽和，因而結(jié)晶母液需保持較高的蛋白質(zhì)濃度. 濃度較高時，由于蛋白分子本身擴(kuò)散速率較低，因而分子間更易相互碰撞，發(fā)生反應(yīng). 但濃度過高，蛋白分子析出結(jié)晶的速度大大加快，遠(yuǎn)遠(yuǎn)快于其形成晶核的速度，最終只能得到一些無定形固體微粒而得不到晶體. 在純乙酸鈉溶液中，HEWL分子均勻地分布在溶液的整個空間內(nèi)(如圖5所示). 而在瓊脂糖凝膠中，HEWL分子穿梭分布于三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中，使得蛋白質(zhì)分子的局部濃度提高，分子自擴(kuò)散運(yùn)動較其在水相中受限. 并且隨著瓊脂糖濃度的增加，瓊脂糖凝膠網(wǎng)孔尺寸減小，其自擴(kuò)散運(yùn)動受限程度加劇，從圖6(a)可以看到，相對于在水相中，HEWL在不同濃度瓊脂糖凝膠中的自擴(kuò)散系數(shù)降低到原來的40%～80%，這使得蛋白質(zhì)分子可以在較長時間內(nèi)停留在高濃度區(qū)，從而蛋白質(zhì)分子間更容易互相碰撞，發(fā)生反應(yīng)，促進(jìn)晶核生長，生成高質(zhì)量晶體.

過飽和的蛋白質(zhì)溶液可以經(jīng)過熱力學(xué)誘導(dǎo)而分離成兩個介穩(wěn)的濃度相差較大的液相. 在蛋白質(zhì)濃度較高的液相區(qū)，生長速率相對過快，可能會導(dǎo)致產(chǎn)生不同形式的沉淀物或聚晶. 據(jù)研究發(fā)現(xiàn)，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.1% 瓊脂糖凝膠的流體力學(xué)網(wǎng)孔尺寸在25 nm左右[10]. 在蛋白質(zhì)成長為聚晶后，因為它較單體流體力學(xué)半徑會變大，將更難穿梭于流體力學(xué)網(wǎng)孔尺寸為25 nm左右的瓊脂糖凝膠的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)里，與其它分子間碰撞的幾率大大降低，也就從某種程度上降低了蛋白質(zhì)生成聚晶的速率. 除此之外，在瓊脂糖凝膠中，空穴現(xiàn)象大大被削弱，十分有利于晶核的成長.

2.2HEWL在乙酸鈉溶液及瓊脂糖凝膠中的自旋自旋弛豫時間

蛋白質(zhì)分子在溶液或凝膠中的運(yùn)動分為整體和內(nèi)運(yùn)動. 前面探討的HEWL分子的自擴(kuò)散運(yùn)動屬于整體運(yùn)動. 分子內(nèi)運(yùn)動又進(jìn)一步分為ps～ns時間尺度的快運(yùn)動和μs～ms時間尺度的慢構(gòu)象交換運(yùn)動. 前者包括了分子內(nèi)化學(xué)鍵的振動、擺動以及側(cè)鏈的轉(zhuǎn)動等，后者則與配體結(jié)合、酶催化、蛋白質(zhì)折疊、變構(gòu)等重要生化事件發(fā)生在同一時間尺度內(nèi). 我們通過經(jīng)自旋回波及梯度脈沖修飾后的CPMG脈沖序列成功過濾掉樣品中小分子的信號，測量了水相及瓊脂糖凝膠中HEWL1H的自旋自旋弛豫時間T2，結(jié)果如圖6(b)所示. 由圖6可以看出，隨著瓊脂糖凝膠的出現(xiàn)及瓊脂糖濃度的增加，T2不斷減小，說明HEWL分子構(gòu)象交換運(yùn)動變緩，局部運(yùn)動能力下降，這更有利于晶核生成，晶體成長.

3　結(jié)論

脈沖梯度場測量自擴(kuò)散系數(shù)及自旋自旋弛豫時間測量核磁共振試驗結(jié)果表明：

(1)HEWL在不同濃度的瓊脂糖凝膠中，5 ms的擴(kuò)散時間內(nèi)，自擴(kuò)散系數(shù)以單組份存在；

(2)HEWL在瓊脂糖凝膠中的自擴(kuò)散系數(shù)及自旋自旋弛豫時間較其在純乙酸鈉溶液中變小，說明HEWL分子整體運(yùn)動和局部運(yùn)動受到瓊脂糖凝膠的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的阻礙；

(3)隨著瓊脂糖濃度的增大，凝膠網(wǎng)孔尺寸減小，HEWL分子運(yùn)動受限程度加劇，使得蛋白質(zhì)分子的局部濃度提高，HEWL分子可以在較長時間內(nèi)停留在高濃度區(qū)，從而蛋白質(zhì)分子間更容易互相碰撞，發(fā)生反應(yīng)，促進(jìn)晶核生長. 同時瓊脂糖凝膠較小的流體力學(xué)網(wǎng)孔尺寸抑制聚晶或沉淀的出現(xiàn)，從而生成高質(zhì)量晶體.

[1]林親錄，馬美湖，金陽海，等. 雞蛋卵清中溶菌酶的提取與純化[J]. 食品科學(xué)，2002，2：43-46.

[2]陶鳳云，張新妙，馬潤宇. 溶菌酶結(jié)晶的研究進(jìn)展[J]. 北京聯(lián)合大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2006，20(3)：37-40.

[3]古麗米娜，姚建曦.溶菌酶晶體及其交聯(lián)技術(shù)的研究進(jìn)展[J].生物學(xué)通報，2012，47(7)：8-11.

[4]馬美湖，葛長榮，王進(jìn)，等.冷卻肉生產(chǎn)保鮮技術(shù)的研究—溶菌酶、Nisin、GNa液復(fù)合性保險試驗[J]. 食品科學(xué)，2003，4：74-82.

[5]Ryota Murai, Hiroshi Y，Yoshikawa，etal. Enhancement of femtosecond laser-induces nucleation of protein in a gel solution[J]. Applied Physics Letter, 2010, 96：043702.

[6]文祎，林東海.基于NMR自旋弛豫技術(shù)的蛋白質(zhì)動力學(xué)研究[J]. 波譜學(xué)雜志，2012，29(2)：288-306.

[7]Price WS. NMR studies of translational motion (1st ed)[M]. New York : Cambridge University Press, 2009.

[8]Stejskal E, Tanner J. Spin diffusion measurements: spin echoes in the presence of a time-dependent field gradient[J]. Journal of Chemical Physics, 1965, 42, 288-292.

[9]Johnson Jr C. Diffusion ordered nuclear magnetic resonance spectroscopy: principles and applications[J]. Progress in Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy, 1999, 34, 203-256.

[10]Bona Dai, Shingo Matsukawa. Elucidation of gelation mechanism and molecular interactions of agarose in solution by1H-NMR[J]. Carbohydrate Research, 2013, 365:38-45.

NMR Studies on Molecular Mobility of Protein of Hen Egg White Lysome in Agarose Gels

ZOU Ya-juan, DAI Bo-na

(InstrumentalAnalysisCenter，ShanghaiJiaoTongUniversity，Shanghai200240，China)

Changes in the molecular mobility of hen egg white lysome(HEWL)in aqueous solution and in agarose gel were measured by pulsed-field-gradient stimulated echo (PFG-STE)1H NMR and spin-spin relaxation time(T2)1H NMR methods in order to elucidate the effect of agarose gel on the crystallization of protein. Both the diffusion coefficient of HEWL(DHEWL) andT2of HEWL showed a steep decrease with the increase of agarose concentration. These results suggested that both the local molecular motion and translational molecular motion were impeded by the three-dimensional polymeric network of agarose gel, with the result of a higher local concentration of HEWL in agarose gel. The low diffusion of HEWL molecules in agarose gel probably retained the higher local concentration for a longer time, which enhanced the nucleation. In addition, in the supersaturated solution,HEWL clusters diffused more slowly than monomers due to the large hydrodynamic interaction with the agarose matrix and their small hydrodynamic radius, which promoted the crystallization of the HEWL protein.

agarose gel; NMR; HEWL; protein crystallization

2016-03-31;

2016-05-09.

上海交通大學(xué)科技創(chuàng)新專項-青年教師科研起步基金(AF4040006)

鄒亞娟(1983-)，女，工程師，碩士，研究方向：分析化學(xué)

代博娜(1981-)，女，工程師，博士，研究方向：核磁共振在化學(xué)、生物學(xué)中的應(yīng)用，Tel：021-34206175/34206173-116，E-mail：daibona@sjtu.edu.cn.

O657.32

A

1006-3757(2016)02-0069-05

10.16495/j.1006-3757.2016.02.002