單安山，呂希婷，馬清泉，邵長軒（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物營養(yǎng)研究所，哈爾濱　150030）

豬凝血酶C端衍生肽抑菌活性和膜作用機制研究

單安山，呂希婷，馬清泉，邵長軒
（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物營養(yǎng)研究所，哈爾濱150030）

豬凝血酶C末端富含正電荷和疏水性氨基酸殘基，通過結(jié)構(gòu)參數(shù)分析獲得截短肽RD27，測定相應(yīng)指標(biāo)。探討豬凝血酶C末端肽段抑菌活性及作用機制。結(jié)果表明，RD27對革蘭氏陰性和陽性菌最小抑菌濃度為4～ 8 μmol·L-1，對血細胞最小溶血濃度為45.9 μmol·L-1，顯示較強的抑菌活性和較低的溶血活性，治療指數(shù)為10，大于蜂毒素。RD27在模擬膜環(huán)境中呈現(xiàn)α-螺旋結(jié)構(gòu)，優(yōu)先與模擬細菌脂質(zhì)體作用，使E.coli UB1005膜產(chǎn)生去極化作用，并存在時間和劑量依賴效應(yīng)。揭示其膜作用機制，拓寬抗菌肽設(shè)計方法，探究凝血與免疫系統(tǒng)聯(lián)系。

抗菌肽；豬凝血酶；抑菌活性；作用機制

單安山,呂希婷,馬清泉,等.豬凝血酶C端衍生肽抑菌活性和膜作用機制研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2016,47(4):1-9.

Shan Anshan,Lv Xiting,Ma Qingquan,et al.Study on antimicrobial activity andmembrane-mediatedmechanism of porcine thrombin C-terminal peptide derivative[J].Journal of Northeast Agricultural University,2016,47(4):1-9.(in Chinese with English abstract)

網(wǎng)絡(luò)出版時間2016-4-22 10:01:22[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20160422.1001.026.html

抗生素可預(yù)防和治療感染性疾病，但抗生素非特異性極易引起內(nèi)源性感染或二重感染；使細菌產(chǎn)生耐藥性，致“超級細菌”出現(xiàn)[1]；畜產(chǎn)品殘留給人類健康和環(huán)境保護帶來風(fēng)險。歐盟等國家和地區(qū)已全面禁止動物性產(chǎn)品中使用抗生素。

抗菌肽普遍存在于生命機體防御系統(tǒng)并廣泛參與非特異性免疫，是大多數(shù)生物體感染初始階段主要防護機制[2-3]。作用于細菌、真菌、病毒、寄生蟲，甚至腫瘤細胞[4-7]。以抗菌肽作為重要替代物，開展新藥物研發(fā)，替代抗生素防止多重耐藥菌出現(xiàn)[8-10]，成為研究熱點。

絲氨酸蛋白酶是一類以絲氨酸為活性中心的蛋白水解酶，在生物有機體中發(fā)揮重要生理作用，尤其在消化系統(tǒng)、免疫反應(yīng)、血液凝固、補體系統(tǒng)中[11-13]。絲氨酸蛋白酶通過激活或抑制蛋白酶原起調(diào)節(jié)因子作用，在胚胎發(fā)育、細胞分化、組織重建、血管形成和抵御病原侵入等過程中均具有重要作用[14-15]。Hu等研究表明，絲氨酸蛋白酶重要功能位點位于C端結(jié)構(gòu)域，如穩(wěn)定催化中間產(chǎn)物的氧離子孔（Gly 193&Ser 195），底物特異性口袋（Ser 189、Gly 216&Gly 226），主鏈底物結(jié)合位點（Ser 214，Trp 215&Gly216）[16]。Satoh等研究表明，絲氨酸蛋白酶可在無脊椎動物免疫防御系統(tǒng)中發(fā)揮作用[17]。人類絲氨酸蛋白酶C端序列能編碼宿主防御功能，這些肽顯示抑菌作用及免疫調(diào)節(jié)功能。Nordahl等研究發(fā)現(xiàn)補體系統(tǒng)激活過程中的C3a及其衍生物C3a-desArg具有抗菌活性，有效殺滅革蘭氏陰性菌，如大腸桿菌（Escherichia coli）、綠膿桿菌（Pseudomonas aeruginosa）和革蘭氏陽性菌，如糞腸球菌（Enterococcus faecalis），阻止化膿性鏈球菌（Streptococcus pyogenes）在小鼠體內(nèi)感染[18]。凝血系統(tǒng)是絲氨酸蛋白酶中一大類，凝血反應(yīng)過程是由機體創(chuàng)傷或感染活化的一個基本宿主防御反應(yīng)[19-20]。Bode研究表明，凝血酶作為凝血系統(tǒng)關(guān)鍵酶，在促進凝血和血小板凝集中發(fā)揮重要作用，具有抗凝和抗纖維蛋白原溶解功能[19]。此外，凝血酶在宿主防御方面具有關(guān)鍵作用，能引起各種細胞反應(yīng)，包括提高CAM因子表達、刺激內(nèi)皮細胞生長因子釋放及成纖維細胞生長[20]。Papareddy等研究發(fā)現(xiàn)人凝血酶C端截取的序列片段可發(fā)揮抗菌肽功能，這些C端衍生肽能以溶解膜方式有效殺滅細菌，表現(xiàn)免疫調(diào)節(jié)及中和內(nèi)毒素功能[21]。哺乳動物間凝血酶序列具有高度保守性，蛋白質(zhì)C端序列具有兩親性、陽離子性并顯示螺旋結(jié)構(gòu)[22]。

目前國內(nèi)外有關(guān)豬凝血酶在抑菌和宿主防御系統(tǒng)方面研究未見報道?；诮z氨酸蛋白酶研究及豬凝血酶C端序列生物信息學(xué)分析，本研究探究豬凝血酶C端多肽段抑菌活性，揭示豬凝血酶C端衍生肽抑菌活性及膜作用機制。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株

革蘭氏陽性菌：金黃色葡萄球菌（Staphylococ?cus aureus ATCC 29213）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis CMCC 63501）。

革蘭氏陰性菌：大腸桿菌（Escherich coli ATCC 25922，Escherich coli UB1005）、雞白痢沙門氏菌（Salmonella pullorum C7913）。

1.1.2試劑

Mueller Hilton瓊脂（MHA）、Mueller Hilton肉湯（MHB）培養(yǎng)基均購自AoBoX（中國）；葡萄糖購自Zhiyuan（中國）；十二烷基硫酸鈉（SDS）購自Amresco（美國）；牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin，BSA）、三氟乙醇（TFE）、Triton X-100、3，3'-dipropylthiadicarbocyanine iodide（diSC3-5）、HEPES、磷脂酰膽堿（Egg yolk L-α-phosphatidyl?choline，PC）、磷脂酰甘油（Egg yolk L-α-phospha?tidyl-DL-glycerol，PG）、磷脂酰乙醇胺（Egg yolk L-α-phosphatidylethanolamine，PE）、膽固醇（Cho?lesterol）、乙酸（分析級，99%）均購自Sigma-Al?drich（中國）。

1.2方法

1.2.1肽的設(shè)計

豬凝血酶原前體蛋白由623個氨基酸殘基組成（見圖1），從N端第44號氨基酸開始是豬凝血酶原序列，負電荷氨基酸殘基用灰色標(biāo)記，正電荷氨基酸用紅色和紫色標(biāo)記，從序列中可發(fā)現(xiàn)，正電荷氨基酸殘基在C端較為集中，由圖2可知，其C端呈現(xiàn)螺旋結(jié)構(gòu)，具有較好結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。本試驗利用抗菌肽設(shè)計方法中的序列截取法，從第44號氨基酸開始截取一系列長度在20～30個氨基酸殘基的肽段，通過抗菌肽理化參數(shù)在線工具（http://heli?quest.ipmc.cnrs.fr/cgi-bin/ComputParamsV2.py）逐一篩選，發(fā)現(xiàn)偏于C端的肽段疏水性和兩親性數(shù)值較為適中，多具有正電性，與抗菌肽一般特征[23]符合，與Papareddy等研究一致[21]。哺乳動物凝血酶序列具有很高保守性，人凝血酶序列第565號半胱氨酸殘基和第595號半胱氨酸殘基形成二硫鍵[22]，豬凝血酶C端該部分序列氨基酸排布與人凝血酶相同，故豬凝血酶也在這個位置形成二硫鍵，考慮到二硫鍵在肽合成方面的較高成本，本研究舍掉二硫鍵區(qū)域，考慮螺旋結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，在第597號氨基酸位置截斷，得到肽RD27（RDG KYGFYTHVFRLKKWMQKVIDRFGG），研究其抑菌活性及作用機制。

1.2.2二級結(jié)構(gòu)

將肽加入配制的10mmol·L-1PBS（pH 7.2）、50%TFE和30mmol·L-1SDS溶液中，使其終濃度為150 μmol·L-1，將配制的抗菌肽溶液于圓二色（CD）光譜儀上的比色池中，比色池長度為10mm，光徑為1mm，室溫條件下測定，掃描波長范圍為190～250 nm，掃描速度為100 nm·min-1。根據(jù)公式（1）計算抗菌肽的平均殘基橢圓率。

其中，θM-平均殘基橢圓率（deg·cm2·dmol-1），θobs-實測橢圓率（mdeg），c-抗菌肽濃度（mmol· L-1），l-光徑（cm），n-抗菌肽氨基酸數(shù)。

圖1　豬凝血酶原前體序列模板Fig.1　Sequence template of porcine prepro-prothrombin

圖2　豬凝血酶原前體立體結(jié)構(gòu)Fig.2　Stereochemical structure of porcine prepro-prothrombin

1.2.3最小抑菌濃度

抑菌活性試驗采用美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化研究所（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）推薦的微量滴定稀釋法測定，根據(jù)抗菌肽分子特征，參考Ma等改進方法[24]。待測菌接種于MHB中，220 r·min-1、37℃過夜培養(yǎng)，轉(zhuǎn)接至新MHB中直至細菌處于對數(shù)生長期。MHB校正細菌濃度至OD600=0.5，將細菌數(shù)調(diào)整為約105cfu·mL-1。將肽溶解于50 μL 0.2%BSA（包含0.01%乙酸），加入96孔板中，使肽濃度變化為128～0.25 μmol·L-1依次倍比遞減，每孔終體積100 μL（50 μL接種菌液+50 μL肽稀釋液）。混勻，加蓋后置于37℃培養(yǎng)16～18 h。未加菌孔作為陰性對照，加菌液和MHB孔作為陽性對照。3～5次獨立試驗。測試孔若無肉眼可見生長菌，其對應(yīng)最低肽濃度即為抗菌肽最小抑菌濃度。

1.2.4溶血活性

通過溶血活性檢測肽對哺乳動物血紅細胞溶解能力，測定參照文獻[25]，肝素鈉抗凝管收集健康人血液，1 000 g條件下離心5min，棄除上清，收集血紅細胞，PBS沖洗3遍，重懸后，得到血紅細胞懸液。將肽溶解于PBS中，肽濃度為128～0.25 μmol·L-1，以只加PBS為陰性對照，以含0.2%Tri?ton X-100為陽性對照。37°C孵育1 h，然后1 000 g，4°C條件下離心5min，吸取上清。酶標(biāo)儀測定OD570條件下吸光值。3～5次獨立試驗。將引起5%溶血活性對應(yīng)的最低肽濃度定義為最小溶血濃度（Minimal hemolytic concentration，MHC）。

1.2.5與脂質(zhì)體作用

1.2.5.1脂質(zhì)體制備

選擇PE/PG（7 ?3，W/W）組分模擬細菌膜組成，通過PC/cholesterol（10 ? 1，W/W）組分模擬真核細胞、主要是人血紅細胞膜組分，通過制備脂質(zhì)體檢測真核或原核細胞膜與抗菌肽作用關(guān)系，探討抗菌肽作用機制[26]。根據(jù)模擬膜組成比例（W/ W）=7 ?3，PC/cholesterol（W/W）=10 ?1稱取相應(yīng)磷脂，溶于氯仿，混合后，將溶解于氯仿中磷脂用氮氣、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀或真空干燥過夜，將除盡氯仿的磷脂使用Tris-HCl或者PBS緩沖液溶解，將溶液放于振蕩器上振蕩，超聲波細胞粉碎機破碎，始終將溶液置于冰浴，功率200 W，間歇式超聲20～30min，直至溶液不分層、均一、透明、清澈為止。

1.2.5.2色氨酸藍移

將制備的脂質(zhì)體與抗菌肽混合，使脂肽物質(zhì)的量比為50 ? 1，室溫下作用3～5min，將其放到石英比色杯中，用F-4500熒光分光光度計（Hitachi，Japan），在激發(fā)波長（Exitation）為280 nm，從300 到400 nm對發(fā)射波長（Emission）掃描，記錄最大發(fā)射波長（Emissionmaxima）。

1.2.5.3色氨酸淬滅

為進一步檢測抗菌肽與膜結(jié)合程度，加入淬滅劑丙烯酰胺對熒光淬滅。將4mol·L-1丙烯酰胺逐漸滴定，反應(yīng)池中丙烯酰胺濃度由0.01逐漸增加到0.4mol·L-1。為降低丙烯酰胺吸收，將激發(fā)波長由原來的280變?yōu)?95 nm，仍從300～400 nm對發(fā)射波長掃描。淬滅劑丙烯酰胺對抗菌肽熒光譜影響可通過Stern-Volmer方程評價，即

其中，F(xiàn)0和F分別代表無或有丙烯酰胺存在時熒光強度值，Q代表丙烯酰胺濃度，而Ksv代表Stern-Volmer淬滅常數(shù)。

1.2.6細胞質(zhì)膜去極化

參照文獻[27]方法，利用細胞膜電勢能敏感型熒光染料diSC3-5，測定抗菌肽對細胞膜電勢能影響。將大腸桿菌E.coli UB 1005培養(yǎng)至指數(shù)生長期，5 000 g離心5min，收集細菌沉淀，5mmol·L-1HEPES緩沖液（pH 7.2，含20mmol·L-1葡萄糖和5mmol·L-1EDTA）沖洗3遍，重懸至OD600= 0.05。向配制好的細菌懸浮液中加入終濃度為0.4 μmol·L-1的diSC3-5，室溫避光振蕩孵育1 h。再加入終濃度為0.1mol·L-1的KCl，室溫振蕩避光孵育30min；取2mL細菌懸浮液于石英比色皿中，加入不同濃度抗菌肽，在激發(fā)波長622 nm，發(fā)射波長670 nm條件下測定熒光強度。

2　結(jié)果與分析

2.1肽的設(shè)計與合成

RD27是在豬凝血酶C端截取得到的肽，從N端開始編號，其對應(yīng)編號為597～623，由圖3可知，親水性氨基酸偏于集中在螺旋輪一側(cè)形成親水性區(qū)域，疏水性氨基酸偏于集中在螺旋輪另一側(cè)形成疏水性區(qū)域（圖3箭頭所指區(qū)域），親水性氨基酸和疏水性氨基酸在螺旋輪中呈對側(cè)分布，體現(xiàn)肽RD27兩親性。

圖3　肽RD27螺旋輪Fig.3　Helical wheel projection of the peptide RD27

表1　肽的物理化學(xué)參數(shù)Table 1　Physicochemical parameters of the peptides

圖4　肽的CD光譜Fig.4　CD spectra of the peptide

由表1可知，通過基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOFmS）檢測得到肽分子質(zhì)量與肽理論分子質(zhì)量一致，表明肽合成成功。肽平均疏水性和平均疏水力矩利用CCS方法檢測。由圖3可知，RD27疏水性和兩親性數(shù)值均較為適中。

2.2肽的二級結(jié)構(gòu)

RD27在含有10mmol·L-1PBS緩沖液（模擬水環(huán)境）、50%TFE（模擬微生物膜的疏水環(huán)境）和30mmol·L-1SDS（模擬帶負電荷的原核生物膜）環(huán)境中的圓二色譜（OD）見圖4，RD27在水環(huán)境中呈現(xiàn)無規(guī)卷曲二級結(jié)構(gòu)；在模擬膜環(huán)境中，192 nm波長附近出現(xiàn)一個正譜帶，208和222 nm波長附近有兩個負特征肩峰譜帶出現(xiàn)，表明RD27在此環(huán)境中形成典型的ɑ-螺旋結(jié)構(gòu)[28-29]。與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果一致（見圖5）。

2.3抑菌活性和溶血活性

RD27對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌抑菌活性見表2，從表中可知，RD27對待測菌均表現(xiàn)較強抑菌活性，最小抑菌濃度為4～8 μmol·L-1，與對照肽蜂毒素（Melittin）相比，RD27活性整體略差，但對金黃色葡萄球菌顯示活性更強。

對于RD27溶血活性，由表2可知，引起人血紅細胞發(fā)生5%溶血的肽最小濃度為45.9 μmol·L-1，相對于對照肽蜂毒素（Melittin）最小溶血濃度0.25 μmol·L-1，降低對人血紅細胞毒性作用。

治療指數(shù)是指肽的最小溶血濃度與最小抑菌濃度幾何平均數(shù)比值。治療指數(shù)越大說明細胞選擇性越強。

由表2可知，RD27治療指數(shù)是對照肽蜂毒素的100倍，表明RD27具有較好細胞選擇性。

圖5　RD27二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.5　Predicted secondary structure of RD27

表2　肽的抑菌活性和溶血活性Table 2　Antimicrobial and hemolytic activities of the peptides

2.4色氨酸藍移及淬滅

為檢測含色氨酸殘基的RD27對模擬微生物膜作用，本試驗檢測在親水和模擬細胞膜磷脂疏水環(huán)境中的色氨酸譜（見表3）。

由表3可知，Tris緩沖液中，檢測肽最大發(fā)射波長約為350 nm，當(dāng)將這些肽放置于含有PE/PG磷脂環(huán)境后，最大發(fā)射譜發(fā)生不同程度變化，Melittin和RD27分別產(chǎn)生18和13 nm藍移；當(dāng)將這些肽放于含有PC/cholesterol環(huán)境中后，藍移較小，分別為8和3 nm。

表3　肽在緩沖液、模擬細胞膜磷脂PE/PG或PC/cholesterol中的藍移和淬滅常數(shù)Table 3　Blue shifts and Ksv values of the peptides in buffer，PE/PG or PC/cholesterol vesicles

利用丙烯酰胺淬滅試驗，檢測不同肽深入磷脂環(huán)境中或與磷脂結(jié)合程度。用KSV值描述抗菌肽中色氨酸殘基淬滅程度，KSV值越小，代表色氨酸殘基被保護程度越高。當(dāng)將丙烯酰胺加入含有PE/ PG磷脂中時，RD27的KSV值相對于緩沖液中值降低，且低于Melittin對應(yīng)KSV值，說明RD27能識別微生物膜并與微生物膜發(fā)生結(jié)合。而處于PC/cho?lesterol環(huán)境中RD27的KSV值高于PE/PG磷脂中值，說明RD27細胞選擇性較好。Melittin的KSV值反映其溶血活性較高。

2.5細胞質(zhì)膜去極化

為評價肽對細菌細胞膜去極化程度和對細胞質(zhì)膜破壞程度，常用膜電位敏感染料diSC3-5標(biāo)示。RD27對細菌膜去極化作用結(jié)果見圖6。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RD27能使E.coli UB1005細胞膜產(chǎn)生去極化作用，存在時間和劑量依賴效應(yīng)。

圖6　肽對E.coli UB1005細胞膜去極化作用Fig.6　Cytoplasmicmembrane depolarization of the peptide against E.coli UB1005

3　討論

抗生素濫用導(dǎo)致耐藥菌株出現(xiàn)、藥物殘留、環(huán)境污染等問題。因此，尋找抗生素替代物成為研究熱點?？咕木哂衅颇ぬ厥鈾C制，不易產(chǎn)生耐藥性[30-31]，其鑒定、分離和研發(fā)受關(guān)注。目前從生物體內(nèi)分離[32-33]，肽庫構(gòu)建[34]，功能域雜合[35-36]，截取/替換[37]等方法均可得到抗菌肽。

當(dāng)組織損傷或外源病原體感染時，機體可通過凝血系統(tǒng)級聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)生血液凝塊，防止機體過量流血并阻止病原體入侵。凝血過程伴隨炎癥反應(yīng)。凝血酶作為凝血系統(tǒng)關(guān)鍵酶，在促進凝血和血小板凝集中發(fā)揮重要作用，具有抗凝和抗纖維蛋白原溶解功能。此外，凝血酶在宿主防御方面具有關(guān)鍵性作用[19]。本研究以凝血酶為研究對象，對豬凝血酶序列中氨基酸位置和屬性進行理論分析并借助抗菌肽理化參數(shù)在線工具（http://heliquest. ipmc.cnrs.fr/cgi-bin/ComputParamsV2.py），利用序列截取法，逐一篩選，在豬凝血酶原N端第597號位置處截斷得到含有27個氨基酸殘基的肽RD27（RDG KYGFYTHVFRLKKWMQKVIDRFGG），探究其抑菌活性及作用機制。

α-螺旋抗菌肽在不同環(huán)境中構(gòu)象變化對其生物學(xué)活性具有重要作用[38]。通過檢測RD27在PBS緩沖液和膜模擬環(huán)境中的CD光譜得到RD27在不同環(huán)境中二級結(jié)構(gòu)變化（見圖4），結(jié)果表明，RD27在膜模擬環(huán)境中呈現(xiàn)典型α-螺旋結(jié)構(gòu)，與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果一致（見圖5）。兩親性是抗菌肽發(fā)揮抗菌作用關(guān)鍵因素，α-螺旋兩親性結(jié)構(gòu)是指疏水性氨基酸和親水性氨基酸呈扇形對稱分布于螺旋輪映射圖相對兩側(cè)。有利于抗菌肽與細菌膜發(fā)生作用。但也有研究表明高兩親性并不一定提高抗菌肽抑菌活性，反而影響抗菌肽安全性。Zhu等研究證明過高的兩親性和螺旋度反而會降低抗菌肽細胞特異性選擇，提高其對正常細胞毒性，適當(dāng)破壞兩親性不會使抑菌活性降低，且會提高其細胞選擇性[39]。從螺旋輪映射圖（見圖3）可知，RD27疏水性區(qū)域和親水性區(qū)域并非標(biāo)準(zhǔn)扇形對稱分布，即非完美兩親性結(jié)構(gòu)。RD27較強的抑菌活性和對模擬不同細胞類型脂質(zhì)體作用的較大差異性與該結(jié)論一致。抑菌活性試驗結(jié)果顯示，RD27對待測菌株均表現(xiàn)較強活性，但活性低于對照肽Melit?tin。Yin等研究證明，正電荷增加對于抗菌肽與負電性的微生物膜表面相互作用非常重要，但正電荷數(shù)與抑菌活性間并非簡單線性關(guān)系，電荷數(shù)在+6～+7范圍內(nèi)最佳，更高的正電性會降低活性[40]。本研究中，電荷數(shù)為+6的RD27活性并未高于電荷數(shù)為+5的對照肽Melittin，說明抑菌活性是電荷數(shù)、疏水性及兩親性綜合作用結(jié)果。Chen等研究表明，在相對較低疏水性范圍內(nèi)，抗菌肽抑菌活性隨疏水性增加而提高，因為疏水性增加將促進肽插入到膜磷脂層中[41]。本試驗中檢測到RD27與Melittin抑菌活性隨其疏水性變化趨勢與該結(jié)論一致。溶血活性通常評價抗菌肽對真核細胞毒性，本研究以人體血紅細胞代表哺乳動物的宿主細胞，檢測肽對其損傷作用和生存率影響，評估抗菌肽對正常細胞破壞程度。疏水性是影響抗菌肽溶血活性重要指標(biāo)，Chen等研究表明高疏水性會引起較強溶血活性，較高的疏水性促使肽穿透血紅細胞膜形成疏水性孔洞[41]。本試驗中RD27引起5%溶血的最小肽濃度為45.9 μmol·L-1，高于對照肽Melittin的最小溶血濃度（0.25 μmol·L-1），通過比較兩條肽疏水性可知，可能由于RD27具有較低疏水性，不易破壞血紅細胞的細胞膜。與Chen等研究結(jié)果一致。

為探討RD27與細菌微生物和真核生物細胞膜間相互作用及其是否具有差異性，通過細胞膜組成特點，利用不同磷脂組分分別制成脂質(zhì)體模擬不同細胞膜。RD27氨基酸序列中含有可作為內(nèi)在探針的色氨酸，可間接推測肽所處環(huán)境變化，闡明抗菌肽與細胞膜作用能力和程度，揭示肽作用機理[27,42]。本研究中，RD27在模擬細菌等微生物膜脂質(zhì)體PE/PG中產(chǎn)生的藍移大于模擬真核細胞膜脂質(zhì)體PC/cholesterol，表明RD27更易與微生物膜發(fā)生作用，利用丙烯酰胺淬滅與模擬細胞膜相結(jié)合肽的色氨酸熒光，評估不同磷脂膜與肽緊密程度和深度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RD27與脂質(zhì)體PE/PG結(jié)合程度高于其與脂質(zhì)體PC/cholesterol結(jié)合程度，說明RD27能識別并結(jié)合微生物膜，細胞選擇性較好。細菌質(zhì)膜是細菌維持生命活動的重要保護屏障，受到干擾或破壞時，細菌生長受抑制，甚至死亡。細菌細胞膜電勢能被破壞，是細菌活性下降或死亡重要特征。細胞質(zhì)膜去極化試驗中，RD27能使大腸桿菌（E.coli UB1005）細胞質(zhì)膜發(fā)生去極化，破壞其電勢平衡。結(jié)果表明RD27通過破壞細菌細胞膜發(fā)揮抑菌作用。

4　結(jié)論

本研究以豬凝血酶為研究對象，通過生物信息學(xué)方法分析，在其C端截取得到具有高抑菌活性、低細胞毒性的抗菌肽RD27，驗證其破壞細胞膜的抑菌作用機制，為替代飼用抗生素新型抗菌藥物研制奠定基礎(chǔ)。

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Study on antimicrobial activity andmembrane-mediatedmechanism of porcine thrombin C-terminal peptide derivative

SHAN Anshan,LV Xiting,MA Qingquan,SHAO Changxuan(Institute of Animal Nutrition,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

The C-terminal sequences of porcine thrombin contain a series of amino acid residues with the characteristics of net positive charge and hydrophobicity.The study aimed to investigate the antimicrobial potential and reveal the actionmechanism.The truncated peptide RD27 was obtained through the analysis of the structure parameters of porcine thrombin C-terminus.And,the relevant indices were investigated.The results showed that theminimum inhibitory concentration(MIC)of RD27 to Gram-negative and Gram-positive bacteria was 4-8 μmol·L-1,theminimal hemolytic concentration(MHC)of RD27 was 45.9 μmol·L-1, which demonstrated strong antimicrobial activity and low hemolytic activity.The therapeutic index of RD27 was 10,much higher than that ofmelittin.α-helical conformation was observed in amembrane-mimicking environment.RD27 interacted preferentially with the liposomemimicking bacteria.RD27 was able to depolarize the cellmembrane ofE.coliUB1005 in a dose-dependent and time-dependentmanner.These findings revealed themembrane-mediatedmechanism of RD27.The study expended the approaches of designing AMPs and provided a link between the coagulation and immune system.

antimicrobial peptides;porcine thrombin;antimicrobial activity;actionmechanism

S828；O629.72

A

1005-9369（2016）04-0001-09

2016-03-01

國家自然科學(xué)基金項目（31272453，31472104）；中國博士后科學(xué)基金項目（2012M510082，2013T60342）；中國高等教育博士點基金項目（20132325120003）；東北農(nóng)業(yè)大學(xué)“青年才俊”項目（14QC16）；國家科學(xué)技術(shù)支持項目（2013BAD10B03）；農(nóng)業(yè)技術(shù)產(chǎn)業(yè)體系項目（CARS-36）

單安山（1958-），男，教授，博士，博士生導(dǎo)師，研究方向為動物營養(yǎng)與飼料科學(xué)。E-mail:asshan@neau.edu.cn