章　杰，林　義，林　雅

(浙江省溫嶺市第一人民醫(yī)院病理科　317500)

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YAP在人甲狀腺乳頭狀癌中的表達及對細胞生長的影響

章杰，林義，林雅

(浙江省溫嶺市第一人民醫(yī)院病理科317500)

目的探討Yes相關(guān)蛋白(YAP)在人甲狀腺乳頭狀癌中的表達及對甲狀腺乳頭狀癌細胞生長的影響。方法收集57例該院普通外科行手術(shù)切除的甲狀腺乳頭狀癌及對應(yīng)癌旁組織標本，所有患者均經(jīng)病理診斷確認，免疫組織化學(xué)染色檢測甲狀腺乳頭狀癌及癌旁組織中的YAP表達，統(tǒng)計分析YAP蛋白與腫瘤臨床病理資料間的相關(guān)性。siRNA沉默甲狀腺乳頭狀癌B-CPAP細胞中YAP基因表達，采用四甲基偶氮唑藍(MTT)及流式細胞技術(shù)檢測沉默YAP后B-CPAP細胞增殖及凋亡水平變化。結(jié)果YAP蛋白在甲狀腺乳頭狀癌組織中表達水平顯著高于對應(yīng)癌旁組織(P<0.05)；且YAP蛋白表達與TNM分期和腫瘤體積呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，沉默YAP基因可顯著降低B-CPAP細胞的增殖能力，并促使細胞發(fā)生凋亡(P<0.05)。結(jié)論YAP在甲狀腺乳頭狀癌組織中高表達并與腫瘤不良臨床病理特征有關(guān)，下調(diào)YAP基因可顯著抑制甲狀腺乳頭狀癌細胞生長。

Yes相關(guān)蛋白；癌,乳頭狀;甲狀腺腫瘤；基因表達；細胞增殖

甲狀腺癌是內(nèi)分泌系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，其中甲狀腺乳頭狀癌是其主要病理類型[1]，甲狀腺癌早期癥狀隱匿、診斷困難、易發(fā)生轉(zhuǎn)移，極大地危害廣大人民群眾的身體健康[2]。近年來大規(guī)模的流行病學(xué)研究顯示[3]，約半數(shù)以上的患者在確診一年內(nèi)死亡，而僅有5%的患者生存期超過5年。因此，對于甲狀腺癌發(fā)生發(fā)展的分子生物學(xué)研究，對改善我國未來甲狀腺癌的診治水平具有重要意義。

Yes相關(guān)蛋白(Yes-associated protein，YAP)定位于人類染色體11q13.1上[4]，作為一個轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，在細胞內(nèi)能夠調(diào)節(jié)包括SMAD(mothers against decapentaplegic protein)家族成員[5]和轉(zhuǎn)錄增強區(qū)域(transcriptional enhancer domain，TEAD)轉(zhuǎn)錄因子家族成員[6]等多個轉(zhuǎn)錄因子的活性。近年研究發(fā)現(xiàn)，YAP對細胞增殖具有異常的促進作用，因而將YAP定義為一種重要的促癌基因，其生物學(xué)效應(yīng)亦在許多人類惡性腫瘤中得到驗證[7]。目前，YAP在甲狀腺乳頭狀癌中的表達及對癌癥細胞生長的調(diào)節(jié)作用尚不完全清楚。本研究通過免疫組織化學(xué)、基因轉(zhuǎn)染及增殖凋亡檢測等方法研究了YAP在甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達情況及沉默YAP對甲狀腺乳頭狀瘤B-CPAP細胞增殖、凋亡的影響，旨在明確YAP基因在甲狀腺乳頭狀癌診斷及治療分子中的潛在臨床及生物學(xué)意義。

1　資料與方法

1.1一般資料收集57例于2011年5月至2014年2月間在本院普通外科行手術(shù)切除的甲狀腺癌患者，所有患者均經(jīng)病理證實為甲狀腺乳頭狀癌的組織及對應(yīng)癌旁組織標本。入組患者年齡40～71歲，平均(54.5±15.5)歲，其中男37例，女20例。標本于離體30 min內(nèi)取材并于中性福爾馬林溶液中保存。

1.2主要試劑兔SP免疫組織化學(xué)試劑盒購自北京中杉金橋生物科技有限公司。Trizol試劑及脂質(zhì)體2000(LipofectamineTM 2000)購自美國Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及real time PCR試劑盒購自大連寶生生物工程有限公司；四甲基偶氮唑藍(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)、Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒購自美國Roche公司；YAP引物，正向5′-CCT GCG TAG CCA GTT ACC AA-3′；反向5′-CCA TCT CAT CCA CAC TGT TC-3′，β-actin引物，正向5′-CTC CAT CCT GGC CTC GCT GT-3′；反向5′-GCT GTC ACC TTC ACC GTT CC-3′，由上海生工生物科技有限公司合成；YAP特異性siRNA(sc-38637)及兔抗人YAP多克隆抗體(sc-17140)均購自美國Santa Cruz公司。

1.3免疫組織化學(xué)石蠟組織切片經(jīng)脫蠟、水化后，按SP免疫組織化學(xué)試劑盒說明書要求進行免疫組織化學(xué)染色。兔抗人YAP一抗工作濃度為1∶100，二抗采用生物素標記的山羊抗兔IgG多克隆抗體，DAB顯色、蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水、透明、中性樹膠封片。高倍鏡(×400)下隨機選取10個組織視野，按文獻所述方法[8]進行閱片、評分，取10個視野的平均得分作為切片的最終評分。

1.4細胞培養(yǎng)甲狀腺乳頭狀癌細胞B-CPAP由本實驗室保存。采用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基在適宜條件下進行培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞進行實驗。

1.5細胞轉(zhuǎn)染B-CPAP細胞接種于6孔板中，參照LipofectamineTM 2000轉(zhuǎn)染試劑說明書分別向B-CPAP細胞中轉(zhuǎn)染入陰性對照siRNA(陰性對照組)和YAP特異性siRNA(YAP siRNA組)，轉(zhuǎn)染結(jié)束后采用qRT-PCR法檢測YAP mRNA表達以確證轉(zhuǎn)染效果。

1.6qRT-PCR按RNA提取試劑說明書方法提取細胞中的總RNA，按逆轉(zhuǎn)錄及PCR擴增試劑盒說明書進行反應(yīng)。以β-actin基因為內(nèi)參，采用2-△△ct法計算YAP mRNA相對表達量。

1.7MTT檢測分別收集轉(zhuǎn)染0、24、48、72 h后的B-CPAP細胞，接種于96孔板內(nèi)進行MTT檢測，于酶標儀上490 nm測定各孔的吸光度(A)值。

1.8流式細胞技術(shù)檢測取轉(zhuǎn)染72 h后的B-CPAP細胞，按Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒說明，通過流式細胞儀進行細胞凋亡檢測。

2　結(jié)　　果

2.1甲狀腺乳頭狀癌及對應(yīng)癌旁組織中YAP 蛋白的表達情況通過免疫組織化學(xué)方法檢測57例甲狀腺乳頭狀癌及對應(yīng)癌旁組織中YAP的表達情況。甲狀腺乳頭狀癌組織中YAP陽性表達率為75.44%(43/57)，而癌旁組織中YAP陽性表達率僅為33.33%(19/57)，兩者間表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=20.367，P<0.01)。見圖1。

圖1　YAP蛋白在甲狀腺乳頭狀癌及對應(yīng)癌旁組織中的表達(免疫組織化學(xué)×400)

2.2YAP表達與甲狀腺乳頭狀癌臨床病理特征間的相關(guān)性分析癌組織中YAP蛋白的表達與甲狀腺乳頭狀癌腫瘤體積及TNM分期呈正相關(guān)(P<0.05)，提示腫瘤中YAP蛋白陽性表達的患者可能預(yù)后不良。見表1。

表1　　YAP 表達與甲狀腺乳頭狀癌患者臨床病理 特征的關(guān)系[n]

χ2、P為各項目中不同分組YAP陽性率比較所得。

2.3siRNA下調(diào)甲狀腺乳頭狀癌B-CPAP細胞中YAP的表達在B-CPAP細胞中瞬時轉(zhuǎn)染入YAP特異性siRNA及陰性對照siRNA，qRT-PCR法檢測得，與陰性對照組比較，YAP siRNA組B-CPAP細胞中YAP mRNA的表達水平顯著下調(diào)(P<0.05)，見圖2。

*：P<0.05，與陰性對照組比較。

圖2siRNA下調(diào)B-CPAP細胞中YAP的表達水平

2.4下調(diào)YAP的表達能抑制B-CPAP細胞的增殖并促進其凋亡于轉(zhuǎn)染0、24、48、72 h后，采用MTT檢測細胞增殖能力的變化；結(jié)果顯示，與陰性對照組比較，YAP siRNA組B-CPAP細胞增殖能力降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖3A。為進一步驗證沉默YAP對細胞增殖的影響，作者使用siRNA轉(zhuǎn)染B-CPAP細胞72 h后，采用流式細胞技術(shù)檢測細胞凋亡變化；與陰性對照組比較，YAP siRNA組可明顯增加B-CPAP細胞的細胞比例(P<0.05)見圖3B、C。

A：增殖曲線圖；B ：陰性對照siRNA、YAP siRNA細胞凋亡圖；C：凋亡分析圖。

圖3沉默YAP對B-CPAP細胞增殖、凋亡的影響

3　討　　論

甲狀腺癌是最常見的內(nèi)分泌系統(tǒng)惡性腫瘤之一。目前，甲狀腺癌治療的主要方法是根治性手術(shù)及術(shù)后規(guī)范放、化療[9]，但甲狀腺癌早期癥狀不明顯，診斷困難，且易發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移，因此多數(shù)患者就診時已失去根治性手術(shù)機會，對放化療敏感程度的個體差異性也是導(dǎo)致術(shù)后早期復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的主要原因。近年來，利妥昔單抗[10]及貝伐單抗[11]等分子靶向治療藥物在甲狀腺癌的治療中顯現(xiàn)出一定優(yōu)勢，有關(guān)甲狀腺癌的分子生物學(xué)診斷和生物靶向治療的研究能給甲狀腺癌的早期診治提供參考依據(jù)，具有重要的意義。

近年來，許多學(xué)者都進行了YAP與腫瘤的相關(guān)性研究。在乳腺癌[12]中，YAP在mRNA及蛋白水平均呈現(xiàn)異常高表達，并與患者不良預(yù)后顯著相關(guān)。除此之外，YAP基因和經(jīng)典癌基因KRAS一同促進細胞發(fā)生上皮細胞間質(zhì)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)改變，從而增加腫瘤的惡性生物學(xué)表型[13]。Tu等[14]研究發(fā)現(xiàn)，肝癌組織中YAP基因表達與腫瘤惡性臨床表型及術(shù)后較短的生存期呈正相關(guān)，利用siRNA在沉默肝癌細胞中YAP的表達可顯著抑制肝癌細胞的增殖能力并促進其凋亡。

本研究證實，YAP在甲狀腺乳頭狀癌中呈明顯高表達趨勢，且與甲狀腺乳頭狀癌的腫瘤體積增大及高TNM分期顯著相關(guān)，提示YAP可能在甲狀腺乳頭狀癌生長、轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。為進一步探究YAP是否能對甲狀腺乳頭狀癌細胞生長產(chǎn)生調(diào)節(jié)效應(yīng)，作者通過特異性siRNA沉默了B-CPAP細胞中YAP基因的表達，通過MTT及流式細胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，下調(diào)YAP基因的表達水平不僅能阻礙B-CPAP細胞的增殖能力而且可以促進細胞凋亡的發(fā)生，這一效應(yīng)可能與沉默YAP后，其所調(diào)控的下游包括survivin、結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF)和cyclin D1在內(nèi)[15]的多種促生長轉(zhuǎn)錄因子形成減少有關(guān)。

綜上所述，YAP在甲狀腺乳頭狀癌中呈現(xiàn)異常的高表達趨勢，而且其異常高表達與甲狀腺乳頭狀癌不良臨床及病理特征相關(guān)。YAP有可能是甲狀腺乳頭狀癌發(fā)生發(fā)展過程中的重要調(diào)節(jié)因子。

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Expression of YAP in human papillary thyroid cancer and its influence on cell growth

ZhangJie,LinYi,LinYa

(DepartmentofPathology,FirstPeople′sHospitalofWenlingcity,Wenling,Zhejiang317500,China)

ObjectiveTo investigate the expression of Yes-associated protein(YAP) in human papillary thyroid cancer and its influence on cell growth.MethodsThe samples in 57 cases of papillary thyroid cancer treated by operation resection in the general surgery department of this hospital and the matched tumor-adjacent tissues were collected.All the cases were definitely diagnosed by the pathology examination.The expression of YAP protein in the cancer tissue and corresponding tumor-adjacent tissue were determined by the immunohistochemistry(IHC)staining.The relationship between the YAP protein and the clinicopathological data was statistically analyzed.siRNA was used to silence the expression of YAP in B-CPAP cells,MTT and flow cytometry were used to measure the proliferation and apoptosis changes.ResultsThe expression level of YAP was markedly higher in papillary thyroid cancer tissues than in tumor adjacent tissues (P<0.05);moreover the expression of YAP protein was positively correlated with the tumor size and TNM stage (P<0.05).Silencing YAP gene could significantly inhibit the cell proliferation ability and promote cell apoptosis(P<0.05).ConclusionYAP is highly expressed in papillary thyroid cancer tissues and is related with its adverse clinicopathological characteristics,down-regulating YAP gene can significantly inhibit the cell growth.

Yes-associated protein;carcinoma,papillary;thyroid neoplasms;gene expression;cell proliferation

章杰(1982-)，主治醫(yī)師，本科，主要從事胃腸腫瘤病理診斷工作。

論著·臨床研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.12.022

R736.1

A

1671-8348(2016)12-1653-03

2015-11-30

2015-12-27)