于黎明，陳　姝，何　松△

(重慶醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院:1.消化內科;2.血液科　400010)

?

·技術與方法·

具有雙向分化潛能的鼠胎肝干細胞的分離、培養(yǎng)及鑒定*

于黎明1，陳姝2，何松1△

(重慶醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院:1.消化內科;2.血液科400010)

目的優(yōu)化體外分離、培養(yǎng)和篩選胎鼠肝臟干細胞(LSC)的方法，并鑒定其雙向分化的潛能。方法通過密度梯度離心和細胞差異性貼壁法分離小鼠胎肝干細胞(FLSC)，以細胞平板克隆技術和四甲基偶氮唑藍(MTT)法測定FLSC的增殖，通過添加二甲基亞砜(DMSO)和HGF等誘導干細胞分化。結果分離后的FLSC 24 h內貼壁，卵圓形，排列緊密，1～2周內活化， CD133、CD49f、EPCAM的陽性率分別為(97.95±1.21)%、 (92.71±3.49)%、和(50.73±3.45)%，表達甲胎蛋白(AFP)、細胞角蛋白19(CK19)；誘導分化后糖原染色(PAS)法染色可見紅色糖原顆粒，表達清蛋白(ALB)、肝細胞核因子4α(HNF-4α)。結論聯合密度梯度離心和差異性貼壁法成功分離FLSC，分離后的FLSC干性強，增殖能力強，具有向肝細胞和膽管上皮細胞雙向分化的能力。

胚胎肝干細胞;離心法,梯密度;細胞,培養(yǎng)的;細胞分化

ofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400010,China)

肝臟干細胞(liver stem cell,LSC)是具有自我增殖和多向分化潛能的細胞，在適當條件下可以向肝細胞、膽管上皮細胞、胰腺細胞[1]、神經細胞等細胞進行分化。目前LSC的來源主要有成體肝臟和胎肝。由于成體肝臟中干細胞數量極少，占肝臟中總細胞數約為0.5%～1.5%[2-3]，通過DDC(3,5-diethoxycarbonyl-1,4-dihydro-collidine)處理構建肝損傷模型[4]可提高LSC含量;有報道[5]指出孕8.5～14.5 d胎肝中LSC的含量可達2%～5%，且細胞的活性高，便于實驗的開展。本實驗旨在采用簡化的密度梯度離心法聯合細胞差異性貼壁法[6]篩選并培養(yǎng)胎肝干細胞(fetal liver stem cells,FLSC)，并驗證其具有向肝細胞和膽管上皮細胞雙向分化的潛能。

1　材料與方法

1.1實驗動物SPF級C57BL/6孕鼠,孕期13.5 d，體質量40～50 g,由重慶醫(yī)科大學實驗中心提供，實驗過程對動物的處置符合動物倫理學標準。

1.2主要試劑與儀器胰島素(insulin)、白血病分化抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF)、Ⅳ型膠原酶購自美國Sigma公司；Percoll分離液購自美國Pharmacia公司；表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)、肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor,HGF)購自美國Peprotech公司；清蛋白(ALB)、細胞角蛋白19(CK19)、肝細胞核因子4α(HNF-4а)兔抗鼠多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司； PCR逆轉錄試劑盒、TRIzol購自Takara公司。流式細胞儀購自美國BD公司；凝膠成像儀購自Bio-Rad公司。

1.3FLSC的分離麻醉(4%水合氯醛，10 mL/kg)孕期13.5 d的C57BL/6小鼠，無菌取出胎肝，剪碎至約1 mm×1 mm×1 mm大小，加入0.1%Ⅳ膠原酶及DNaseⅠ，37 ℃水浴消化30 min,吹打混勻后將細胞懸液依次經75、150 μm過濾器過濾。收集濾液，1 500 r/min離心5 min,棄上清，重懸沉淀至2～3 mL。配制70%、50%、30%的percoll密度梯度離心液，重懸的細胞沉淀鋪于梯度離心液上方。常溫下,400×g離心25 min,吸取30%～50%間的細胞條帶;常溫下300×g離心10 min,收集沉淀，加入含有10%胎牛血清(FBS)、2 mmol/L L-谷氨酰胺、20 μg/L EGF、10 μg/L LIF、10 mg/L胰島素、1×10-7mol/L地塞米松、1%青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM/F-12培養(yǎng)基重懸。臺盼藍染色計算細胞的總數和存活率。

1.4小鼠FLSC的純化與培養(yǎng)以1×106個/皿密度接種至鼠尾膠原包被(濃度[6]為1×6-10μg/cm2)的60 mm培養(yǎng)皿中。置于37 ℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)，24 h后換液。待細胞融合約80%～90%時加入Tryple Express,37 ℃消化2.5 min,此時體積較大的肝細胞、星形細胞和成纖維細胞會消化下來，而體積較小的FLSC則大部分貼壁。運用此種方法純化細胞2～3次，可以得到純度較高的FLSC。

1.5FLSC的鑒定

1.5.1流式細胞術消化細胞，收集1×106細胞懸液，離心后含1%牛血清清蛋白(BSA)的磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸細胞至100 μL，封閉30 min,加入CD133、EPCAM、CD49f抗體及同型對照，4 ℃避光孵育30 min,離心，PBS重懸至100 μL，流式細胞儀檢測。

1.5.2細胞免疫熒光接種FLSC至10 μg/cm2鼠尾膠原預先包被的鋪有爬片的24孔板中，37 ℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)3～5 d，待細胞融合約30%～50%，取出爬片，預冷PBS沖洗5 min×3次,加入4%多聚甲醛固定30 min,PBS沖洗5 min×3次,6%大鼠血清室溫固定30 min，加入抗體CD133、EPCAM、CD49f,4 ℃避光孵育1 h，PBS沖洗5 min×3次，二脒基苯基吲哚(DAPI)染核5 min，避光條件下PBS沖洗5 min×3次，抗熒光淬滅劑封片，熒光顯微鏡下觀察。

1.6FLSC的增殖

1.6.1FLSC克隆形成消化FLSC，以1 000個/孔密度接種至膠原包被的6孔板中，添加含有20 μg/L EGF、10 μg/L LIF的DMEM/F-12培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)3～4周，觀察細胞克隆形成的時間、體積及克隆中細胞的數目。

1.6.2四甲基偶氮唑藍(MTT)法檢測干細胞增殖收集對數生長期的FLSC，調整細胞濃度至每毫升4×104個， 每孔100 μL接種于96孔板(4 000個/孔)，每組設6個復孔， 置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中。分別于接種后1、2、3、4、5 d加入20 μL濃度為5 mg/mL的MTT溶液，37 ℃、5% CO2孵箱中繼續(xù)陪養(yǎng)4 h。吸取孔內培養(yǎng)基，加入150 μL DMSO，搖床上避光低速振蕩10 min，使結晶物充分溶解。酶標儀測量各孔490 nm處的吸光度值[A490]。

這天，大福在網吧里玩了一宿游戲，亮天時覺得眼睛又酸又漲，有些不聽使喚。他本打算趴在電腦桌上閉一會兒眼睛。沒想到就睡著了。那個鹿脖子網管把他敲醒的時候，睜開眼睛已是下午三點。他從網吧里走出來，伸伸懶腰，胃腸里強烈抽搐讓他想起已經一天一宿沒有吃東西了。他抽抽鼻子，聞聞街對面烤鴨店里飄出來的香味兒，舔舔嘴唇，想象著烤鴨的美味香甜。

1.7檢測FLSC分化潛能

1.7.1合成糖原功能檢測 除去LIF同時添加1% DMSO、10 μg/L HGF合成分化培養(yǎng)基，接種FLSC，連續(xù)培養(yǎng)2周，觀察細胞形態(tài)變化，按照試劑盒說明書進行糖原染色(PAS)[6-7]，正置顯微鏡下觀察細胞質中的糖原顆粒。

1.7.2細胞免疫熒光分別接種FLSC至普通培養(yǎng)基和分化培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)2～3周，預冷PBS沖洗5 min×3次,加入4%多聚甲醛固定30 min,PBS沖洗5 min×3次,常溫下0.1%Triton-100 透化細胞10 min;6%山羊血清室溫固定30 min,分別加入抗體ALB(1∶50)、HNF-4α(1∶50)，置于濕盒中,4 ℃孵育過夜，PBS沖洗5 min×3次，加入四甲基異硫氰酸羅丹明(TRITC)標記的羊抗兔二抗(1∶50)、異硫氰酸熒光素(FITC)標記的羊抗兔二抗(1∶50)，避光37 ℃孵育1 h，PBS沖洗5 min×3次；DAPI染核5 min，避光條件下PBS沖洗5 min×3次，抗熒光淬滅劑封片正置熒光顯微鏡下觀察。

1.7.3RT-PCR檢測收集普通和分化條件下培養(yǎng)2周的FLSC，加入TRIzol，提取總RNA,按照試劑盒說明書反轉錄為cDNA。用Prime5.0軟件設計目的基因AFP、ALB、HNF-4α及內參GAPDH的PCR引物序列，委托上海英俊公司進行引物的合成。引物序列見表1。反應條件:95 ℃10 min；95 ℃30 s，54～58 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,35個循環(huán)；最后72 ℃10 min；3%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像儀顯影。

1.8檢測FLSC膽管上皮細胞分化潛能培養(yǎng)基中除去LIF，同時接種FLSC至細胞外基質上，觀察細胞形態(tài)學差異性，同時應用細胞免疫熒光技術及RT-PCR檢測膽管細胞標記物CK19的表達。

2　結　　果

2.2FLSC鑒定

2.2.1細胞免疫熒光檢測干細胞表面標記物的表達結果顯示卵圓形、多邊形FLSC中EPCAM、CD133陽性表達(圖2A)；而集落樣排列的FLSC中，CD49f高表達，EPCAM表達相對較弱(圖2B)。

2.2.2流式細胞術檢測FLSC中CD133、CD49f、EPCAM陽性率分別為(97.95±1.21)%、(92.71±3.49)%、(50.73±3.45)%(n=3)。

2.3FLSC增殖

2.3.1FLSC平板克隆實驗結果實驗發(fā)現接種細胞密度較低時細胞增殖能力受到抑制，提高接種密度后細胞增殖能力明顯增強。FLSC接種后連續(xù)培養(yǎng)2周開始出現小的細胞克隆，繼續(xù)培養(yǎng)至4周可見細胞克隆體積增大，克隆中細胞數目明顯增加。

表1　　引物序列和退火條件

A：FLSC原代培養(yǎng)2周；B：FLSC原代培養(yǎng)3周；C：第二代培養(yǎng)2周。

圖1FLSC原代培養(yǎng)相差顯微圖(×100)

圖2　　細胞免疫熒光鑒定FLSC中EPCAM、CD133、CD49f的表達(×100)

2.3.2細胞增殖曲線結果顯示FLSC接種后1～2 d內增殖緩慢，3 d后，A490值增加明顯，FLSC表現出強大的增殖能力(圖3)。

圖3　　FLSC增殖曲線

2.4FLSC具有雙向分化潛能

2.4.1PAS結果FLSC在分化培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)2～3周，部分細胞體積增大，脫離細胞集落且出現雙細胞核，PAS結果顯示，細胞質中可見紅色的糖原顆粒(圖4A)。FLSC接種至細胞外基質中，可見細胞集落伸出樹枝狀結構(圖4B)。

2.4.2細胞免疫熒光檢測FLSC 中CK19、ALB、HNF-4α的表達結果顯示FLSC表達ALB，低表達或不表達HNF-4α，在分化培養(yǎng)條件下細胞出現雙核結構，且成熟肝細胞標記物ALB和HNF-4α表達明顯增加；在細胞外基質中培養(yǎng)，細胞出現導管狀結構，同時高表達膽管細胞標記物CK19(圖4C)。

A、B：PAS;C:免疫熒光圖(×200)；D：RT-PCR凝膠分離圖。

圖4FLSC具有雙向分化潛能

2.4.3RT-PCR檢測FLSC分化前后AFP、ALB、CK19、HNF-4α結果與細胞免疫熒光較為一致，分化條件下連續(xù)培養(yǎng)2～3周，AFP、CK19表達降低，ALB、HNF-4α表達增強。

3　討　　論

LSC是一種具有自我增殖和多向分化潛能的細胞，有研究指出LSC起源于肝臟組織，而不是來源于肝臟外的造血干細胞或骨髓干細胞[8]，同時LSC與肝細胞癌、肝臟的損傷后修復有重要關系。普遍認為在正常情況下，LSC處于靜息狀態(tài)，當肝臟急性損傷后肝內的LSC會爆發(fā)性增殖，但肝臟慢性損傷時，LSC則不會增殖[8]。由于成體肝臟中FLSc的含量稀少，且細胞多處于靜息狀態(tài)，雖然有研究采用DDC飲食構建急性肝損傷模型[4]，促進LSC的增殖，但是成體肝臟中含有實質細胞和非實質細胞[9]，細胞種類較多，普通方法難以分離，目前多采用細胞流式分選法聯合或不聯合免疫磁珠分選法[2]，雖然明顯提高了LSC的含量與純度，但是由于LSC沒有特異性的標記物，分選時通常需要聯合多種表面標記物，如EPCAM[9-10]、CD133[2]、CD49f等陽性分選，CD31、CD45、CD11b等陰性分選，造價較高，同時細胞流式分選術和免疫磁珠分選術對實驗條件、技術、設備等要求較高，限制了成體肝臟LSC的分離及應用。有報道[5]指出胎肝中LSC含量較豐富，遠高于成體肝臟中LSC的含量，同時胎肝中干細胞的活性更高，便于干細胞的分離、培養(yǎng)和后續(xù)試驗的開展。Liu等[5]在實驗中發(fā)現通過構建30%、50%、70%不同密度的percoll液經非連續(xù)密度梯度離心后，大鼠FLSC主要集中在30%～50%的percoll液層面中，而早期在(choline-deficient ethionine，CDE)飼喂構建小鼠肝臟損傷模型中發(fā)現，肝臟卵圓細胞則主要集中于20% percoll液層面[11]。但是針對小鼠FLSC的研究則不多。

本研究中采用非連續(xù)密度梯度離心分離孕期13.5 d的小鼠胎肝，發(fā)現FLSC主要集中于30%～50%的percoll液層面中，與早前大鼠中的結果相一致[5]，通過聯合后期細胞差異性消化法，成功分離出FLSC。經流式細胞術聯合細胞免疫熒光技術檢測，驗證了篩選的FLSC高表達CD133、CD49f、EPCAM等目前常用的干細胞表面標記物；同時通過細胞克隆增殖實驗發(fā)現細胞接種后1～2周內開始活化，之后表現出強大的增殖能力；在HGF及DMSO促肝細胞分化條件下，連續(xù)培養(yǎng)2～3周后，PAS實驗、細胞免疫熒光、RT-PCR等實驗結果表明細胞向肝細胞方向進行分化，這與之前的研究相一致[4-5]。將細胞接種于細胞外基質上，連續(xù)培養(yǎng)后發(fā)現細胞周邊出現膽管上皮細胞特異性的樹枝狀結構和高表達CK19的導管狀細胞結構，早前的研究認為CK19主要表達于膽管區(qū)域，同時也表達于許多LSC[3]，可以作為膽管上皮細胞和LSC共同的標記物。

本實驗成功分離出純度較高的FLSC，方法較為簡單，便于后續(xù)實驗的開展。肝臟LSC對肝細胞癌及急性肝損傷后的治療有重要的意義，有文獻[12]報道肝臟LSC與腫瘤LSC有一定的關系，在適當條件下可以轉化為腫瘤LSC，進而引發(fā)肝癌，但二者之間發(fā)生轉化的具體機制仍未明了，同時肝臟LSC向肝細胞、膽管上皮細胞、軟骨細胞、胰島細胞等進行分化的具體機制還不清楚，研究這些問題將對未來肝細胞癌的治療產生重要的意義。

[1]Cardinale V,Wang Y,Carpino G,et al.Multipotent stem/progenitor cells in human biliary tree give rise to hepatocytes,cholangiocytes,and pancreatic islets[J].Hepatology,2011,54(6):2159-2172.

[2]Rountree CB,Ding W,Dang H,et al.Isolation of CD133+liver stem cells for clonal expansion[J].J Vis Exp,2011,10(56):3183.

[3]Turner R,Lozoya O,Wang Y,et al.Human hepatic stem cell and maturational liver lineage biology[J].Hepatology,2011,53(3):1035-1045.

[4]Galicia VA,He L,Dang H,et al.Expansion of hepatic tumor progenitor cells in Pten-null mice requires liver injury and is reversed by loss of AKT2[J].Gastroenterology,2010,139(6):2170-2182.

[5]Liu WH,Li R,Dou KF.Convenient and efficient enrichment of the CD133+liver cells from rat fetal liver cells as a source of live stem/progenitor cells[J].Stem Cell Reviews,2011,7(1):94-102.

[6]Luo N,Cai Y,Zhang J,et al.The C-terminal region of the hepatitis B virus X protein is required for its stimulation of HBV replication in primary mouse hepatocytes[J].Virus Res,2012,165(2):170-178.

[7]Bi Y,Huang J,He Y,et al.Wnt antagonist SFRP3 inhibits the differentiation of mouse hepatic progenitor cells[J].J Cell Biochem,2009,108(1):295-303.

[8]Rountree CB,Mishra L,Willenbring H.Stem cells in liver diseases and cancer:recent advances on the path to new therapies[J].Hepatology,2012,55(1):298-306.

[9]Yoon SM,Gerasimidou D,Kuwahara R,et al.Epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) marks hepatocytes newly derived from stem/progenitor cells in humans[J].Hepatology,2011,53(3):964-973.

[10]Yamashita T,Ji J,Budhu A,et al.EpCAM-positive hepatocellular carcinoma cells are tumor-initiating cells with stem/progenitor cell features[J].Gastroenterology,2009,136(3):1012-1024.

[11]Tirnitz-Parker JE,Tonkin JN,Knight B,et al.Isolation,culture and immortalisation of hepatic oval cells from adult mice fed a choline-deficient,ethionine-supplemented diet[J].Int J Biochem Cell Biol,2007,39(12):2226-2239.

[12]Wang C,Yang W,Yan HX,et al.Hepatitis B virus X (HBx) induces tumorigenicity of hepatic progenitor cells in 3,5-diethoxycarbonyl-1,4-dihydrocollidine-treated HBx transgenic mice[J].Hepatology,2012,55(1):108-120.

Isolation,culture and identification of bi-directional differentiation potential liver stem cells in fetal mice*

YuLiming1,ChenShu2,HeSong1△

(1.DepartmentofGastroenterology;2.DepartmentofHematology,SecondAffiliatedHospital

ObjectiveTo optimize the method of isolating,culturing and screening fetal mouse liver stem cells in vitro,and to identify the potential of bi-directional differentiation.MethodsThe fetal liver stem cells of mouse were isolated by the density gradient centrifugation and cell difference adherence method,the proliferation of stem cells was determined by cell plate cloning technique and MTT method;stem cells were induced for differentiation by adding DMSO and HGF.ResultsThe isolated stem cells showed adherence within 24 h,which were orbicular-ovate,closely packed,activated within 1～2 weeks;the positive rates of CD133,CD49f and EPCAM were (97.95±1.21)%,(92.71±3.49)% and (50.73±3.45)% respectively;AFP and CK19 proteins were expressed;red glycogen granules were seen by PAS after induced differentiation;ALB and HNF-4α were expressed.ConclusionFetal hepatic stem cells are successfully isolated by the density gradient centrifugation combined with difference adherence method,and the isolated cells have strong stemness and proliferation ability,as well as the ability of bi-directional differentiation towards hepatocytes and bile duct epithelial cells.

fetal liver stem cells;centrifugation,density gradient;cells,cultured;cell differentiation

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.12.026

重慶市衛(wèi)生局醫(yī)學科研計劃重點項目(2013-1-019)。作者簡介:于黎明(1986-)，住院醫(yī)師，在讀碩士,主要從事消化內科研究。△

，E-mail： hedoctor65@sina.com。

R329

A

1671-8348(2016)12-1666-04

2015-12-08

2016-01-12)