鄒絨弟，駱婷婷，蘇　敏，趙飛亞，周　萍

（大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南大理　671000）

紫地榆中鞣花酸和沒(méi)食子酸含量測(cè)定

鄒絨弟，駱婷婷，蘇敏，趙飛亞，周萍*

（大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南大理671000）

目的：建立紫地榆中鞣花酸和沒(méi)食子酸的含量測(cè)定方法。方法：采用高效液相色譜法，Thermo C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為甲醇-0.1%磷酸水溶液梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)為260 nm，流速1.0 mL/min，柱溫為30℃。結(jié)果：鞣花酸在6.38～31.88 μg/mL范圍內(nèi)r=0.999 1及沒(méi)食子酸在11～55 μg/mL范圍內(nèi)r=0.999 1線性關(guān)系良好，平均回收率為99.2%（RSD為1.9%）和97.6%（RSD為1.5%）。結(jié)論：本法操作簡(jiǎn)便、快速、重現(xiàn)性好，能夠有效的測(cè)定紫地榆中鞣花酸和沒(méi)食子酸的含量。

紫地榆；鞣花酸；沒(méi)食子酸；高效液相色譜法

［DOI］10. 3969 / j. issn. 2096-2266. 2016. 06. 012

紫地榆（赤地榆）Geranium strictipes R.Kunth.為牻牛兒苗科老鸛草屬（Geranium L.）植物，藥用部位為其根，具有清熱利濕，活血止血等功能，主要用于治療厭食、腸炎、痢疾、消化不良、鼻衄、外用跌打損傷等〔1〕，民間又叫隔山消，主要分布于云南中甸、永寧、永勝、大理等地區(qū)，其藥源豐富，長(zhǎng)期以來(lái)被云南的白族、彝族等少數(shù)民族廣泛使用〔2〕。紫地榆在抗菌作用方面的報(bào)道顯示其活性與其主要成分鞣質(zhì)類有關(guān)〔3-4〕，鞣質(zhì)的水解產(chǎn)物包括沒(méi)食子酸和鞣花酸〔5〕，鞣花酸和沒(méi)食子酸具有抗腫瘤、抗氧化及抗菌等作用〔6-7〕。駱婷婷等〔8〕對(duì)紫地榆中總鞣質(zhì)含量進(jìn)行了測(cè)定，肖培云等〔9〕對(duì)隔山消中沒(méi)食子酸進(jìn)行了含量測(cè)定。為后續(xù)紫地榆藥材質(zhì)量控制及開(kāi)發(fā)利用提供參考，本實(shí)驗(yàn)采用HPLC法，同時(shí)測(cè)定紫地榆藥材中的兩種主要活性成分鞣花酸、沒(méi)食子酸的含量。

1　儀器與試藥

1.1儀器Agilent 1200高效液相色譜儀，Thermo C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；梅特勒電子天平（AE240瑞士），F(xiàn)A2004N電子分析天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；SSY-4電熱恒溫水浴鍋（北京泰克儀器有限公司）；HH-S2s恒溫水浴鍋（金壇市環(huán)保儀器廠）。

1.2試劑及藥品紫地榆藥材于不同年份、不同時(shí)期購(gòu)自大理藥材市場(chǎng)，由大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院楊月娥老師鑒定為牻牛兒苗科老鸛草屬植物（G.strictipes）的根，藥材自然干燥后粉碎，過(guò)80目篩備用。沒(méi)食子酸對(duì)照品（成都曼思特生物科技有限公司，批號(hào)：MUST-13040103），鞣花酸對(duì)照品（成都曼思特生物科技有限公司，批號(hào)：MUST-1211090），甲醇為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2　方法與結(jié)果

2.1色譜條件Thermo C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為甲醇-0.1%磷酸溶液梯度洗脫，洗脫程序見(jiàn)表1。流速為1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)260 nm，柱溫為30℃，進(jìn)樣量10 μL。色譜圖見(jiàn)圖1。

表1洗脫程序

圖1　混合對(duì)照品（A）與紫地榆樣品（B）的HPLC色譜圖

2.2樣品制備

2.2.1對(duì)照品溶液的制備精密稱取沒(méi)食子酸和鞣花酸對(duì)照品適量，甲醇溶解制成濃度為0.220 0 mg/mL，0.127 5 mg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.2.2供試品溶液的制備取粉碎后的2012年（1）紫地榆樣品，約0.25 g，精密稱定，加入10 mL的70%乙醇，加熱回流2 h，提取1次，過(guò)濾，定容到100 mL，搖勻，用微孔濾膜（0.45 μm）濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.3線性關(guān)系的考察精密移取“2.2.1”項(xiàng)下沒(méi)食子酸和鞣花酸對(duì)照品儲(chǔ)備液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL置于10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，混合均勻，配成系列濃度的混合對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，對(duì)照品質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程，沒(méi)食子酸為Y=13 882X-1.1，r=0.999 1；鞣花酸為Y=79 373X-136.8，r=0.999 1。結(jié)果表明鞣花酸和沒(méi)食子酸分別在6.38～31.88 μg/mL和11～55 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4儀器精密度試驗(yàn)取混合對(duì)照品溶液（沒(méi)食子酸33μg/mL，鞣花酸19.12μg/mL），按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，進(jìn)樣10 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)得沒(méi)食子酸和鞣花酸峰面積的RSD值均為1.0%，表明儀器精密度良好。

2.5穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一供試品溶液，置于室溫下，分別于1、2、4、6、8、24 h，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，結(jié)果沒(méi)食子酸和鞣花酸峰面積的RSD分別為1.4%，0.6%，說(shuō)明供試液室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6重復(fù)性試驗(yàn)取2012年（1）紫地榆樣品5份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算含量，結(jié)果沒(méi)食子酸和鞣花酸峰面積的RSD分別為2.5%，1.8%，說(shuō)明該方法的重復(fù)性良好。

2.7加樣回收率試驗(yàn)取已知含量（沒(méi)食子酸1.40 mg/g，鞣花酸6.50 mg/g）的2012年（1）紫地榆樣品5份，每份約0.13 g，分別加入沒(méi)食子酸和鞣花酸對(duì)照品適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。見(jiàn)表2。

2.8樣品的測(cè)定取不同批次紫地榆樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算沒(méi)食子酸和鞣花酸含量。見(jiàn)表3。

表2　沒(méi)食子酸和鞣花酸的加樣回收率結(jié)果（n=5）

表3　樣品測(cè)定結(jié)果（n=3）

3　討論

3.1檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇有文獻(xiàn)報(bào)道沒(méi)食子酸在274、272 nm處，鞣花酸在280、254 nm處有最大吸收〔10-12〕，為進(jìn)一步確定波長(zhǎng)，將兩種物質(zhì)分別在200～400 nm進(jìn)行掃描，測(cè)得沒(méi)食子酸最大吸收波長(zhǎng)為278 nm，鞣花酸最大吸收波長(zhǎng)為254 nm，由于最大吸收波長(zhǎng)有著差距，混合對(duì)照品后采用HPLC法進(jìn)樣觀察檢測(cè)器（DAD）記錄的圖譜，在260 nm處兩個(gè)物質(zhì)都相對(duì)有較大的吸收，故選擇260 nm為同時(shí)測(cè)定兩種成分的波長(zhǎng)。

3.2色譜條件的選擇在參考文獻(xiàn)〔11-13〕的基礎(chǔ)上，分別考察了不同流動(dòng)相（甲醇-水系統(tǒng)、乙腈-水系統(tǒng)），不同柱溫25、30℃，不同色譜柱（C8、C18）下沒(méi)食子酸和鞣花酸的分離情況，結(jié)果使用Thermo C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫30℃，甲醇-0.1%磷酸溶液梯度洗脫時(shí)，沒(méi)食子酸和鞣花酸能很好的分離，同時(shí)紫地榆中其他成分不干擾主成分的測(cè)定。

3.3含量差異紫地榆含量測(cè)定結(jié)果表明，提取方法相同的情況下，不同樣品中鞣花酸含量均明顯高于沒(méi)食子酸含量，兩者的含量在不同批次中也有差異，鑒于紫地榆常年生于海拔2 600～3 800 m的草叢或灌叢中〔2〕，其所含鞣花酸和沒(méi)食子酸的含量可能與云南中甸、大理等地區(qū)的海拔、氣候、生長(zhǎng)條件、采樣時(shí)間等因素有關(guān)。而這些條件有待進(jìn)一步的考察研究。

〔1〕《全國(guó)中草藥匯編》編寫(xiě)組.全國(guó)中草藥匯編：下冊(cè)〔M〕.北京：人民衛(wèi)生出版社，1983：624．

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〔Abstract〕Objective：To establish a method of determining the content of ellagic acid and gallic acid in Geranium strictipes. Methods：HPLC method was used with Thermo C18chromatography column（250 mm×4.6 mm，5 μm）.Mobile phase was methanol-0.1%phosphoric acid water solution gradient elution，the detection wavelength was 260 nm，the flow rate was 1.0 mL/min，and the column temperature was 30 degree.Results：Ellagic acid in 6.38-31.88 μg/mL range r=0.999 1 and gallic acid in 11-55 μg/mL range r=0.999 1 showed a good linear relationship.The average recovery rate was 99.2%（RSD=1.9%）and 97.6%（RSD=1.5%）.

Conclusion：This method is simple，rapid，accurate and good in reproducibility，which can effectively determine the content of ellagic acid and gallic acid in Geranium strictipes.

〔Key words〕Geranium strictipes；ellagic acid；gallic acid；HPLC

（責(zé)任編輯李楊）

Determination of the Content of Ellagic Acid and Gallic Acid in Geranium strictipes

Zou Rongdi，Luo Tingting，Su Min，Zhao Feiya，Zhou Ping*
（College of Pharmacy and Chemistry，Dali University，Dali，Yunnan 671000，China）

R284

A

2096-2266（2016）06-0047-03

省級(jí)創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃建設(shè)基金資助項(xiàng)目（S-CXCY-2014-4）

2015-11-12

2015-12-17

鄒絨弟，藥學(xué)專業(yè)2012級(jí)本科生.

周萍，教授.