盧春雪，楊紹杰，陶薈竹，黃樹(shù)明，楊書(shū)彬

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

·中藥工業(yè)·

HPLC法同時(shí)測(cè)定左歸飲提取物中馬錢(qián)苷和5-羥甲基糠醛的含量

盧春雪，楊紹杰，陶薈竹，黃樹(shù)明*，楊書(shū)彬*

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

目的：測(cè)定左歸飲中馬錢(qián)苷和5-羥甲基糠醛2種化學(xué)成分的含量。方法：采用高相液相色譜法，以C18柱為色譜柱，流動(dòng)相為乙腈-水，梯度洗脫；流速為1.0 mL·min-1；柱溫為30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為250 nm。結(jié)果：左歸飲中的馬錢(qián)苷和5-羥甲基糠醛分別在0.51～4.08 μg(r=0.999 8)、0.26～2.04 μg(r=0.999 8)與峰面積呈良好線性關(guān)系，平均加樣回收率分別為101.24%(RSD=1.40%)和99.72%(RSD=1.10%)。結(jié)論：該法準(zhǔn)確可靠、重復(fù)性好，可作為同時(shí)測(cè)定左歸飲中馬錢(qián)苷和5-羥甲基糠醛含量的測(cè)定方法。

左歸飲；高效液相色譜法；馬錢(qián)苷；5-羥甲基糠醛；含量測(cè)定

左歸飲出自《景岳全書(shū)·新方八陣》卷五十一方，是由熟地、山茱萸、枸杞、山藥、炙甘草、茯苓6味中藥組成的復(fù)方，具有滋腎、養(yǎng)肝、益脾的功能。方中重用熟地，甘溫滋腎以填真陰；輔以山茱萸、枸杞子養(yǎng)肝血，合主藥以加強(qiáng)滋腎陰而養(yǎng)肝血之效；佐以茯苓、炙甘草益氣健脾；山藥益陰健脾滋腎，是用于補(bǔ)益腎陰、治療真陰不足之癥的經(jīng)典名方[1]?，F(xiàn)代研究證實(shí)，該方在治療腎陰虛型更年期綜合征[2]及抗炎、抗衰老[3]等方面有顯著療效，但對(duì)于左歸飲有效成分及質(zhì)量控制研究報(bào)道較少。研究表明，左歸飲君藥熟地中的多糖和5-羥甲基糠醛(5-H)等是其藥理作用的主要物質(zhì)基礎(chǔ)[4]，《中華人民共和國(guó)藥典》2015版規(guī)定，采用高效液相色譜法測(cè)定山茱萸中的指標(biāo)性化學(xué)成分馬錢(qián)苷的含量[5]，以其作為山茱萸質(zhì)量控制指標(biāo)。近代研究發(fā)現(xiàn)，山茱萸中的馬錢(qián)苷能夠抗炎，增強(qiáng)免疫，同時(shí)可使衰老大鼠紅細(xì)胞(RBC)中超氧化物歧化酶(SOD)活力及丙二醛(MDA)含量得到恢復(fù)[6]，起到抗氧化損傷作用。由于中藥復(fù)方的有效成分復(fù)雜，單一指標(biāo)對(duì)質(zhì)量控制不夠合理。因此，本研究采用HPLC法建立了同時(shí)測(cè)定左歸飲中馬錢(qián)苷和5-H兩種指標(biāo)性成分含量的方法，為左歸飲的質(zhì)量控制與評(píng)價(jià)提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters 2695 Separation Module HPLC；Waters 2996 PAD紫外檢測(cè)器；Millennium32色譜工作站、ME155DU電子分析天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；KQ-250E型超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥

馬錢(qián)苷對(duì)照品(中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所，批號(hào)：MUST-14090413，純度99.58%)；5-羥甲基糠醛(南京森貝伽生物科技有限公司，批號(hào)：67-47-0，純度98%)；乙腈(色譜純)；甲醇(天津市天力化學(xué)試劑有限公司，分析純)；水為哇哈哈純凈水。

熟地、山茱萸、枸杞、山藥、炙甘草、茯苓6味藥材均購(gòu)自安國(guó)市弘發(fā)中藥材飲片有限公司，經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)楊書(shū)彬副教授鑒定為正品。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Diamonsil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；EasyGurd C18(10 mm×4.0 mm)Kit保護(hù)柱；流動(dòng)相：乙腈-水線性梯度，見(jiàn)表1；流速：1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)為250 nm；進(jìn)樣體積：10 μL；柱溫：30 ℃。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫表

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品混合溶液的制備 精密秤取馬錢(qián)苷和5-H對(duì)照品適量，采用甲醇配制成每1 mL含馬錢(qián)苷0.408 mg、5-H 0.204 mg的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 據(jù)《景岳全書(shū)》中左歸飲原方的記載，藥材按熟地∶山茱萸∶枸杞∶山藥∶茯苓∶炙甘草=9∶5∶6∶6∶4∶3的比例，加10倍量蒸餾水先文火燒至水沸騰，后用武火煎煮40 min。紗布過(guò)濾，藥渣加8倍量蒸餾水先文火后武火沸騰20 min，合并濾液，濃縮后冷凍干燥得凍干粉(出粉率為39.72%)備用。精密秤取左歸飲凍干粉0.5 g，置10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，超聲提取40 min，放冷至室溫，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，5000 r·min-1離心，取上清液，以0.45 μm的微孔濾膜過(guò)濾，即得。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液的制備 參照左歸飲處方工藝過(guò)程制備缺山茱萸或熟地的陰性樣品，按2.2.2項(xiàng)下的供試品制備方法處理，制成缺山茱萸或熟地的陰性樣品溶液。

2.3 專屬性試驗(yàn)

將對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照品溶液按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，記錄色譜圖。在與馬錢(qián)苷和5-羥甲基糠醛對(duì)照品相應(yīng)的保留時(shí)間處沒(méi)有色譜峰，說(shuō)明陰性對(duì)照溶液無(wú)干擾，見(jiàn)圖1。

2.4 線性關(guān)系考察

將2.2.1項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液按梯度稀釋成不同濃度，馬錢(qián)苷質(zhì)量濃度分別為：0.051、0.102、0.204、0.306、0.408 mg·mL-1；5-羥甲基糠醛質(zhì)量濃度分別為：0.026、0.051、0.102、0.153、0.204 mg·mL-1，各對(duì)照品經(jīng)0.45 μm的微孔濾膜過(guò)濾后，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜峰面積，以濃度(X)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)其進(jìn)行線性回歸，得回歸方程。結(jié)果見(jiàn)表2。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 精密度試驗(yàn) 按2.2項(xiàng)下方法分別制備混合對(duì)照品溶液和供試品溶液，在2.1項(xiàng)下色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次。供試品溶液中馬錢(qián)苷和5-H峰面積的RSD分別為0.39%和0.28%，混合對(duì)照品溶液中馬錢(qián)苷和5-H峰面積的RSD分別為0.48%和0.24%，表明儀器精密度良好。

2.5.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品，照2.2.2項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液，進(jìn)行含量測(cè)定。馬錢(qián)苷和5-H的平均含量分別為0.246%和0.212%，RSD分別為0.73%和0.49%，表明測(cè)定方法的重復(fù)性良好。

2.5.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別于配制后0、2、4、8、12、16、24 h進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果馬錢(qián)苷和5-H峰面積的RSD分別為0.53%和0.77%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

注：A.混合對(duì)照品；B.左歸飲供試品；C.缺山茱萸陰性對(duì)照；D.缺熟地陰性對(duì)照；1.5-羥甲基糠醛；2.馬錢(qián)苷。圖1 混合對(duì)照品與左歸飲供試品溶液主成分的HPLC圖

2.5.4 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取6份已知含量的同一批次供試品(含馬錢(qián)苷0.246%、5-H 0.212%)約0.5 g，置具塞錐形瓶中，分別精密加入用甲醇配制的混合對(duì)照品溶液(每1 mL含馬錢(qián)苷0.408 mg、5-H 0.204 mg)15 mL，甲醇定容至25 mL，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 線性關(guān)系試驗(yàn)結(jié)果

表3 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.6 樣品含量測(cè)定

參照左歸飲處方工藝過(guò)程制備3批次樣品適量，分別按2.2.2項(xiàng)方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 樣品測(cè)定結(jié)果

3 討論與小結(jié)

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

為保證各指標(biāo)成分的測(cè)定有較高靈敏度，根據(jù)檢測(cè)器上得到的紫外吸收光譜圖輔助成分定性和選擇各被測(cè)組分的檢測(cè)波長(zhǎng)，馬錢(qián)苷和5-H在250 nm處都有較大吸收，故選擇檢測(cè)波長(zhǎng)分別為250 nm。

3.2 流動(dòng)相的選擇

試驗(yàn)考察了甲醇-水、乙腈-水溶液為流動(dòng)相的兩種洗脫系統(tǒng)，與甲醇相比，相同柱溫下乙腈擴(kuò)散系數(shù)小，峰寬較小，分離度R更高，所以以乙腈-水為流動(dòng)相時(shí)，色譜圖基線穩(wěn)定、峰形較好，并且在本研究所采用的梯度下分離效果最好。

3.3 提取條件的選擇

試驗(yàn)中比較了回流提取法和超聲提取法，結(jié)果表明，提取效率相同時(shí)，超聲提取所用時(shí)間較少，且提取操作簡(jiǎn)單，因此選擇超聲提??；提取溶劑考察不同濃度甲醇提取效果，結(jié)果100%甲醇提取雜質(zhì)峰較少，被測(cè)成分峰面積較大，因此選擇100%甲醇提取；比較了超聲提取20、30、40、50、60 min的提取效率，結(jié)果提取40、50、60 min各被測(cè)成分的提取量基本相等，因此選擇提取時(shí)間40 min。

3.4 小結(jié)

左歸飲是治療腎陰虛癥的經(jīng)典方劑，在近年來(lái)的臨床實(shí)驗(yàn)研究中，其在治療更年期綜合征、抗衰老、改善圍經(jīng)期卵巢功能[8-9]方面受到醫(yī)生和患者的廣泛認(rèn)可。左歸飲中水溶性成分包括多糖、馬錢(qián)苷、5-羥甲基糠醛、梓醇等。本研究建立了左歸飲中馬錢(qián)苷和5-H兩種主要成分的綜合測(cè)定方法，儀器精密度、指標(biāo)性成分穩(wěn)定性及方法的重復(fù)性和加樣回收率等均良好。因此采用本試驗(yàn)方法可為準(zhǔn)確對(duì)左歸飲進(jìn)行質(zhì)量控制提供參考，同時(shí)也為左歸飲中有效成分的繼續(xù)研究提供依據(jù)。

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DeterminationofLoganinand5-hydroxymethylFurfuralinZuoguiDrinkbyHPLC

LUChunxue，YANGShaojie，TAOHuizhu，HUANGShuming*，YANGShubin*

(HeilongjianguniversityofChinesemedicinecollegeofpharmacy.Harbin，Heilongjiang150040，China)

Objective：To determine the content of loganin and 5-hydroxymethyl furfural in Zuogui Drink.Methods：HPLC was performed on C18column using acetonitrile-water as the mobile phase at a flow rate of 1.0mL·min-1.The detection wavelength was set at 250nm.The column temperature was 30 ℃.Results：Loganin and 5-hydroxymethyl furfural showed good linearity in the concentration range of 0.51～4.04 μg (r=0.999 8) and 0.26～2.04 μg(r=0.999 8)，respectively.And their average recovery rates were 101.24% (RSD=1.40%) and 99.72%(RSD=1.10%)，respectively.Conclusion：The method is simple and accurate with good reproducibility.It can be used for the determination of loganin and 5-hydroxymethyl furfural in Zuogui Drink.

Zuogui Drink.；HPLC；loganin；5-hydroxymethyl furfural；content determination

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.4.025

2015-11-06)

*

楊書(shū)彬，副教授，研究方向：中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)及活性研究；Tel:(0451)87266807,E-mail:shubinyang0451@163.com 黃樹(shù)明，教授，研究方向：中醫(yī)藥防治神經(jīng)退行性疾病的作用及機(jī)制研究；Tel:(0451)87266872，E-mail:huangshuming1958@163.com