蔣鑫，王欣佩，雷帆*，余煊，邢東明，謝偉東，杜力軍

(1.清華大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院醫(yī)學(xué)院 藥物藥理實(shí)驗(yàn)室，北京 100084；2.清華大學(xué) 深圳研究生院 生命科學(xué)與健康學(xué)部，深圳 518055)

·基礎(chǔ)研究·

石榴葉總鞣質(zhì)對正常和肥胖模型小鼠糖脂吸收的影響△

蔣鑫1，2，王欣佩1，雷帆1*，余煊1，邢東明1，謝偉東2，杜力軍1

(1.清華大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院醫(yī)學(xué)院 藥物藥理實(shí)驗(yàn)室，北京 100084；2.清華大學(xué) 深圳研究生院 生命科學(xué)與健康學(xué)部，深圳 518055)

目的：石榴葉總鞣質(zhì)(PLT)具有降低高糖高脂模型動物以及單純性肥胖動物模型血中三酰甘油(TG)的作用。方法：為深入研究其降脂作用機(jī)理，在給予小鼠一定量的PLT后不同時間一次性灌胃橄欖油，測定血中TG濃度變化與時間的關(guān)系。結(jié)果：實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，提前0.5 h灌胃PLT可以顯著降低正常小鼠和肥胖小鼠口服橄欖油所致的血中TG水平上升，但是對于腹腔注射橄欖油引起的TG升高沒有作用，鞣酸可以抑制口服和灌胃橄欖油引起的TG升高；提前2 h給予PLT對于復(fù)合橄欖油引起的TG的升高作用不明顯，但是可以降低血中總膽固醇(TC)和血糖的濃度，鞣酸可以降低復(fù)合橄欖油引起的TG、TC和血糖的升高。結(jié)論：總之，PLT可以顯著減少腸道脂質(zhì)的吸收，起到降脂減肥的作用。PLT中的鞣酸為其主要有效成分。

石榴葉總鞣質(zhì)；脂質(zhì)吸收；鞣酸；降脂作用

石榴的皮、葉、果皮、果汁中都含有豐富的鞣質(zhì)類成分[1]。本課題組研究成果表明，石榴葉中的鞣質(zhì)類成分具有降低高血糖合并高血脂大鼠的總膽固醇(TC)和總?cè)８视?TG)作用，據(jù)研究其作用可能和鞣酸質(zhì)類物質(zhì)抑制肝臟HMG-COA還原酶活性相關(guān)[2]；在高熱量飲食誘導(dǎo)的單純性肥胖小鼠模型上，石榴葉鞣質(zhì)表現(xiàn)出顯著的減肥降脂的作用[3]。此外，臨床研究表明石榴提取物與他汀類藥物合用具有更好的降低血脂和抗動脈粥樣硬化作用[4]。為深入研究石榴葉總鞣質(zhì)(PLT)降脂作用的藥理作用靶點(diǎn)和主要活性成分，參考相關(guān)實(shí)驗(yàn)[5]進(jìn)行設(shè)計，觀察一次性給予PLT和鞣酸對小鼠胃腸道吸收TG能力的影響，以探討PLT減肥的作用機(jī)理及作用方式，為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 動物

雄性ICR小鼠，體重：(20.03±1.97)g(北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司)，合格證號：SCXK(京)2007-0003。

1.2 試劑

PLT(本室自制，批號：080203)；鞣酸(Garlic)；TG試劑盒、TC試劑盒和葡萄糖試劑盒(北京中生生物工程高技術(shù)公司，批號：20101207)；食用橄欖油；復(fù)合橄欖油：蛋黃體積分?jǐn)?shù)為0.05%，淀粉體積分?jǐn)?shù)為0.05%，橄欖油體積分?jǐn)?shù)為50%，0.9%氯化鈉溶液體積分?jǐn)?shù)為49.9%，勻漿器調(diào)勻。藥用淀粉(同仁堂制藥有限公司)。

1.3 儀器

550 Microplate Reader(Bio-rad)。

2 方法

2.1 PLT和鞣酸對正常小鼠脂質(zhì)吸收的影響

小鼠18只，隨機(jī)分為3組，每組6只，分別為空白對照組、PLT組(800 mg·kg-1)和鞣酸組(200 mg·kg-1)。禁食12 h后給予同體積PLT、鞣酸和蒸餾水(空白對照組)，0.5 h后每只小鼠眼底靜脈叢采血0.2 mL，隨后一次性灌胃給予食用橄欖油(5 mL·kg-1)。分別在第1、2、4、6 h眼底靜脈叢采血，每次0.2 mL，3000 r·min-1離心5 min，取血清，用試劑盒測定血樣品中的TG和血糖含量。小鼠在實(shí)驗(yàn)期間可自由飲水但不進(jìn)食。計算不同時間血液中TG濃度，做出時量曲線，進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

2.2 PLT長期給藥對肥胖小鼠脂質(zhì)吸收的影響

用高脂飼料造成單純性肥胖模型小鼠12只，按照體重隨機(jī)分為兩組，一組給予蒸餾水灌胃，另一組給予PLT(800 mg·kg-1)灌胃。給藥6周后，單純性肥胖模型小鼠的平均體重為(39.9±2.77)g，給PLT組肥胖小鼠體重為(30.48±2.45)g；同批次飼喂普通飼料的空白對照鼠6只，體重(33.65±2.01)g。按照2.1中方法處理，一次性灌胃給予食用橄欖油(5 mL·kg-1)后，不同時間采血分離血清，進(jìn)行血脂和血糖含量測定。計算不同時間血中TG、TC和葡萄糖濃度(mmol·L-1)，做出時量曲線。

2.3 PLT和鞣酸給藥后不同時間對小鼠脂質(zhì)吸收的影響

2.3.1 給藥后0.5 h對小鼠腸道TG吸收的影響 小鼠分為5組，分別為：第1組，模型對照組，口服等體積0.9%氯化鈉溶液；第2組，鞣酸對照組，給藥劑量為800 mg·kg-1；第3、4、5組為PLT高、中、低劑量組，灌胃給藥劑量分別為800、400、200 mg·kg-1，給藥體積20 mL·kg-1。各組給藥0.5 h后口服或腹腔注射食用橄欖油(10 mL·kg-1)。分別于口服或腹腔注射橄欖油后1、2、4、6 h眼眶采血。分離血清，用試劑盒測定其中TG含量。給藥前采血作自身對照。做血中TG的時量曲線，并進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

2.3.2 提前給藥2 h對小鼠TG吸收的影響 按照2.3.1中的方法進(jìn)行分組，各組給藥2 h后，隨后給食用橄欖油(10 mL·kg-1)。分別于口服橄欖油后1、2、4、6 h眼眶采血。分離血清，備測。給藥前采血作自身對照。做出血中TG的時量曲線，并進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

2.3.3 給藥2 h后對小鼠腸道營養(yǎng)吸收的影響 給藥2 h后，用復(fù)合橄欖油代替食用橄欖油進(jìn)行灌胃，劑量為10 mL·kg-1。按照2.3.2的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，檢測血中的TG、TC和葡萄糖的含量，做出時量曲線，并進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

2.4 數(shù)據(jù)分析

3 結(jié)果

3.1 PLT和鞣酸可抑制正常小鼠對TG的吸收

給予食用橄欖油后小鼠血中TG濃度呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，大約在第2小時達(dá)峰值。從第1小時開始，PLT組和鞣酸組的小鼠血中TG濃度顯著低于空白對照組，并持續(xù)到第6小時。通過對各個曲線上升部分和下降部分?jǐn)?shù)據(jù)的直線擬合發(fā)現(xiàn)，正常小鼠對脂質(zhì)吸收最快(擬合直線斜率為4.01)，TG自血中消除速率也最快(曲線下降段擬合直線斜率為-0.99)。PLT和鞣酸對脂質(zhì)吸收速度具有一定抑制作用，曲線上升段擬合直線斜率相近，分別為1.51和1.79；同時，其還抑制TG自血中消除，消除段速率較正常小鼠慢50%左右，斜率為-0.53；鞣酸組小鼠體內(nèi)TG消除速度最慢，擬合直線斜率為-0.23。這一結(jié)果顯示給予PLT和鞣酸可以抑制小鼠對TG的吸收，0～6 h TG總吸收量(圖1中各曲線下面積)為：PLT組(16.26)<鞣酸組(22.89)<空白對照組(38.81)。其中PLT可抑制58%的TG吸收入血，鞣酸的抑制率為41%。結(jié)果見圖1、表1。

小鼠血中TC濃度在實(shí)驗(yàn)過程中持續(xù)降低，給藥組和空白對照組沒有顯著差異。第2小時鞣酸組和PLT組血中葡萄糖顯著低于空白對照組，說明PLT大劑量可顯著抑制進(jìn)食引起的血糖升高，但是對血糖的消除沒有影響。結(jié)果見表2。

圖1 一次性給予食用橄欖油后給藥組小鼠血中TG濃度隨時間變化圖

表1 灌胃食用橄欖油后小鼠血中TG濃度曲線上升段和下降段線性擬合回歸方程

注：Y表示血中TG濃度(mmol·L-1)，X表示口服食用橄欖油后時間(h)。

表2 一次性給予食用橄欖油后小鼠血中TC和葡萄糖濃度經(jīng)時變化 /mmol·L-1

注：與空白對照組相比，*P<0.05，**P<0.01；下同。

3.2 PLT抑制肥胖小鼠TG的吸收

長期給PLT的肥胖組小鼠，給予食用橄欖油后，小鼠血中TG濃度迅速上升，在2 h達(dá)峰值，然后緩慢下降。肥胖模型組小鼠血中TG的含量顯著高于正常對照組，說明肥胖小鼠可顯著增加對食物中TG的攝取。6 h小鼠吸收入血的TG總量為：高脂模型組(23.52 mmol·L-1)>PLT高劑量組(18.51 mmol·L-1)>空白對照組(14.67 mmol·L-1)，其中石榴葉大劑量對TG吸收的抑制率為21.3%。見圖2。

注：與高脂模型組小鼠相比，*P<0.05；**P<0.01。圖2 一次性給予食用橄欖油后各組小鼠血TG濃度隨時間變化圖

3.3 給藥時間對小鼠血脂吸收的影響

3.3.1 給藥后0.5 h口服食用橄欖油 從圖3中可以看出，提前0.5 h給予不同濃度的PLT和鞣酸，可以顯著降低口服食用橄欖油后小鼠血中TG水平的升高，驗(yàn)證了上面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。但是，對于腹腔注射食用橄欖油，PLT不具有降低血中TG水平的作用，而鞣酸具有顯著降低TG的作用，說明其作用機(jī)理與PLT作用機(jī)理不完全相同。

注：A.口服；B.腹腔注射。圖3 給藥0.5 h后口服或腹腔注射食用橄欖油血中TG的時量變化

3.3.2 給藥后2 h口服食用橄欖油 從圖4中可以看出，提前2 h給予鞣酸和不同濃度的PLT，再口服食用橄欖油對小鼠血中TG濃度變化影響不大，不同時間點(diǎn)TG濃度與對照組相比沒有顯著差異。而鞣酸組小鼠血中TG濃度時量曲線下面積(32.85)和PLT 800 mg·kg-1組(33.45)低于對照組(47.15)，說明鞣酸和PLT高劑量組提前2 h給藥具有一定減少腸道吸收脂肪的作用。

3.3.3 給藥后2 h口服復(fù)合橄欖油 從圖5中可以看出，在食用橄欖油中增加膽固醇和淀粉類成分灌胃小鼠后，鞣酸組的小鼠血中TG、TC和葡萄糖的濃度與對照組相比顯著降低，并隨著時間的延長降低幅度越來越大。而給予不同劑量的PLT組小鼠，血中TG濃度與對照組差異不大，但是血糖和TC的濃度降低，其中400 mg·kg-1劑量組降低效果最好。

圖4 給藥2 h后口服食用橄欖油血中TG的時量變化

注：A.TG含量隨時間變化圖；B.TC隨時間變化圖；C.葡萄糖隨時間變化圖。圖5 給藥2 h灌胃復(fù)合橄欖油后小鼠血TG、TC、葡萄糖的時量變化圖

4 討論

早在20世紀(jì)90年代，在臨床上治療肥胖病人時發(fā)現(xiàn)肥胖癥患者食用低脂肪含量的飲食較僅控制卡路里飲食更能減重，并有利于低體重的維持[6]。研究表明，患者體重降低和食物中脂肪含量降低呈正相關(guān)，降低食物中10%脂肪攝入量可以使肥胖者平均減重5～10 kg[6-8]。實(shí)驗(yàn)表明，給予相同量的食用橄欖油，3 h內(nèi)肥胖小鼠吸收入血的TG為正常小鼠的170%，而且消除速度為正常小鼠的3倍左右(消除相斜率之比)，這也許就是肥胖患者限制飲食減肥效果依然不好或減肥后反彈的原因之一。PLT可以降低正常小鼠和肥胖小鼠的脂質(zhì)吸收率，降低比例分別達(dá)到58%和21.3%，說明PLT與食物同時進(jìn)食時阻礙了食物中脂肪的吸收。雖然長期給予PLT不能改變肥胖小鼠已經(jīng)發(fā)生的消化系統(tǒng)病理生理改變，和肥胖模型組比對脂質(zhì)吸收和從血中消除的速率沒有太大影響，但是其可以顯著抑制餐后血脂的持續(xù)增高，降低每餐總脂質(zhì)吸收量。因此，PLT的這種作用有助于改善肥胖者的餐后高血脂癥狀，緩解過高的血脂對肝臟和血管壁等組織器官的損傷，降低動脈粥樣硬化的風(fēng)險。此外，根據(jù)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，PLT還可抑制給予復(fù)合橄欖油后TC和血糖的上升，說明PLT還可以抑制TC和血糖的上升。這可能是其減肥和改善高血脂癥狀的機(jī)理之一。已上市的減肥藥奧利司他[9]就是通過抑制胰脂肪酶抑制腸道脂肪吸收而發(fā)揮減肥作用的藥物。

鞣質(zhì)是廣泛存在于植物中的一類多酚類化合物，其可以和蛋白質(zhì)相結(jié)合，從而使得蛋白質(zhì)發(fā)生變性，最早用于皮革的鞣制[10]?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，鞣質(zhì)具有清除氧自由基、抗氧化[11]、抗菌、抗病毒[12]、改善腎功能[13]、抑制腸道對食物中脂肪的吸收、減慢腸蠕動速度、延長食物在腸道中停留時間[14]、降糖降脂等多種藥理活性。石榴中的鞣質(zhì)類成分主要是可水解鞣質(zhì)，水解后生成多酚酸類化合物，本實(shí)驗(yàn)中口服PLT和鞣酸可以產(chǎn)生相似的藥理作用。分別給予PLT和鞣酸后，灌胃食用橄欖油，小鼠血中TG濃度顯著低于正常對照，對二者血脂和時間曲線上升段進(jìn)行直線擬合后發(fā)現(xiàn)斜率類似，也就是給予PLT和鞣酸后小鼠腸道脂質(zhì)吸收速度相似，說明PLT抑制脂質(zhì)吸收作用可能與其中含有的鞣酸類物質(zhì)有關(guān)。當(dāng)進(jìn)食富含脂質(zhì)、膽固醇和碳水化合物的復(fù)合飲食后，PLT和鞣酸都可以降低血中TC和葡萄糖的濃度，說明二者對膽固醇和血糖的代謝具有促進(jìn)作用，降低TC和血糖。從促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)代謝的角度來講，鞣酸類物質(zhì)可能是PLT的主要有效成分。但是，鞣酸和PLT的藥理作用也存在不一致的地方，主要表現(xiàn)在降脂的作用機(jī)理上，PLT只有在提前0.5 h給藥才有效，說明其主要抑制了腸道脂質(zhì)吸收。而鞣酸可以降低直接腹腔注射橄欖油的TG量，以及給藥2 h后還具有降低血脂的作用，說明了鞣酸可以進(jìn)入血液循環(huán)，可加快TG的體內(nèi)代謝過程。二者降脂作用的不同可能是由于鞣質(zhì)類物質(zhì)難以被腸道吸收，只有水解成為鞣酸才能被腸道吸收，因此，PLT在腸道的作用占主要部分，而鞣酸被吸收入血，發(fā)揮影響營養(yǎng)物質(zhì)代謝的作用。

PLT可以顯著抑制小鼠腸道脂質(zhì)的吸收，總鞣質(zhì)中含有的鞣酸類物質(zhì)可吸收入血，加速血中TG、膽固醇和葡萄糖的消除。PLT可以抑制腸道TG吸收和餐后持續(xù)的血脂、血糖升高，主要活性物質(zhì)為鞣酸類化合物。

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EffectofTotalTenninsofPomegranateLeafonGlycolipidAbsorptioninNormalandObeseMice

JIANGXin1，2，WANXinpei1，LEIFan1*，YUXuan1，XINGDongming1，XIEWeidong2，DULijun1

(1.LaboratoryofMolecularPharmacologyandPharmaceuticalSciences，SchoolofLifeSciencesandSchoolofMedicine，TsinghuaUniversity，Beijing100084，China；2.ShenzhenKeyLabofHealthScienceandTechnology，DivisionofLifeScience&Health，GraduateSchoolatShenzhen，TsinghuaUniversity，Shenzhen518055，China)

Objective：Pomegranate leaf tanninnes(PLT)has been found to decrease the blood triglycerides in hyperlipidemia and obesity animal models.Methods：To explore the mechanism of the lipid-lowering effect of PLT，mice were given same amount of olive oil，0.5 or 2 hours after administering different doses of PLT and tannic acid.Blood concentration of triglyceride was measured at a certain time intervals，and the relationship between the blood triglyceride concentration and time was analyzed.Results：Results show that PLT significantly inhibited the increased concentration of triglyceride both in normal and obese mice induced by an oral administration of olive oil，but showed no effect on blood triglyceride level caused by intraperitoneal injection of olive oil.While，tannic acid could inhibit the TG increase caused by olive oil both in oral and injected administration.Administered 2 hours in advance，PLT could inhibit the glucose and the cholesterol level raised，caused by compound olive oil，but had no effect on TG level.Tannic acid could reduce TG，TC and glucose levels after composite olive oil administration in the same condition.Conclusion：Therefore，we can conclude that PLT can significantly reduce the intestinal lipid absorption，while，tannic acid can increase the blood triglyceride，cholesterol and glucose elimination from blood.

Pomegranate leaf tannins；fat metabolism；tannic acid；lipid-lowering effect

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.4.007

2015-04-20)

國家自然科學(xué)基金(30801523，81374006)；“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(2011ZX09101-002-11，2012ZX09103-201-041)

*

雷帆，講師，研究方向：中藥藥理學(xué)和分子藥理學(xué)；Tel：(010)62798546，E-mail：leifan@tsinghua.edu.cn