王登斌，鄒準(zhǔn)，陳文財(cái)，鄒節(jié)明

(桂林三金藥業(yè)股份有限公司，廣西 桂林 541004)

大孔樹(shù)脂對(duì)黃芪總皂苷的分離純化研究△

王登斌，鄒準(zhǔn)，陳文財(cái)，鄒節(jié)明*

(桂林三金藥業(yè)股份有限公司，廣西 桂林 541004)

目的：優(yōu)化黃芪中黃芪總皂苷的分離和純化工藝。方法：以總皂苷為指標(biāo)，考察5種商品化大孔樹(shù)脂(D101、AB-8、HPD300、HPD600、DM130)在靜態(tài)和動(dòng)態(tài)情況下對(duì)黃芪總皂苷的吸附和解吸性能。結(jié)果：HPD300樹(shù)脂純化效果最好，當(dāng)按上柱生藥量∶樹(shù)脂量=2∶1的吸附量吸附，4 BV 70%乙醇洗脫時(shí)，分離純化效果最佳。黃芪甲苷的洗脫率達(dá)86.5%，純度為33.8%。結(jié)論：優(yōu)化后的大孔樹(shù)脂純化工藝穩(wěn)定，適于黃芪總皂苷的分離和純化。

黃芪；黃芪甲苷；大孔樹(shù)脂；高效液相色譜-蒸發(fā)光散射法

黃芪為豆科植物蒙古黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao或膜莢黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.的干燥根。其主要成分為皂苷類、多糖類及黃酮類?，F(xiàn)代藥理研究表明，黃芪總皂苷具有穩(wěn)定紅細(xì)胞膜、提高血漿組織內(nèi)環(huán)腺苷酸(CAMP)的含量、增強(qiáng)免疫力、抗疲勞、耐缺氧等多種藥理作用[1]。

大孔樹(shù)脂吸附是20世紀(jì)70年代開(kāi)發(fā)應(yīng)用的吸附分離材料，其吸附分離過(guò)程綜合了機(jī)械篩分和化學(xué)吸附原理，具有吸附性獨(dú)特、選擇性高、不受無(wú)機(jī)物影響、使用周期長(zhǎng)、節(jié)省費(fèi)用等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于皂苷類物質(zhì)的提取[2-3]。有關(guān)大孔樹(shù)脂對(duì)中藥中皂苷類和黃酮類成分純化的報(bào)道已有不少[4]，但對(duì)黃芪中總皂苷類成分的相關(guān)報(bào)道相對(duì)較少[5-6]。本文從5種不同極性的大孔樹(shù)脂中篩選出一種型號(hào)為HPD300的樹(shù)脂，并研究了該樹(shù)脂對(duì)黃芪提取液中黃芪總皂苷在靜態(tài)和動(dòng)態(tài)下的吸附解吸性能，為工業(yè)分離純化黃芪總皂苷提出了技術(shù)性探索。

1 材料與儀器

1.1 儀器

Alliance高效液相色譜系統(tǒng)、2695高壓泵(美國(guó)Waters公司)；Alltech-6000蒸發(fā)光散檢測(cè)器(Alltech公司)；phenomenex luna C18柱(美國(guó)菲羅門(mén)公司)；分析天平(日本Mettler公司)；HZS-HA恒溫振蕩器(哈爾濱東明醫(yī)療儀器廠)。

1.2 材料

黃芪藥材購(gòu)自廣西中南藥業(yè)；黃芪甲苷對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110781-201314)；D101、AB-8(天津南開(kāi)大學(xué)化工廠)；HPD300、HPD600、DM130(滄州寶恩生化制劑廠)；色譜級(jí)乙腈(TIDA公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 黃芪甲苷的測(cè)定

2.1.1 色譜條件 色譜柱：phenomenex luna C18(250 mm×4.6 mm，5μm)；流動(dòng)相：乙腈-水(35∶65)；漂移管溫度：88 ℃；氮?dú)饬魉伲?.4 mL·min-1。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備 取黃芪甲苷對(duì)照品，精密稱定，加甲醇稀釋成質(zhì)量濃度為0.492 mg·mL-1的溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 取黃芪提取物約50 mg，精密稱定，置錐形瓶中，加甲醇50 mL，超聲處理30 min，濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 取2.1.2項(xiàng)下的對(duì)照品溶液，精密吸取2、4、6、8、10 mL，分別移至10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻。分別吸取各標(biāo)準(zhǔn)液20 μL，注入液相色譜儀，按2.1.1色譜條件測(cè)定峰面積。以黃芪甲苷進(jìn)樣量(μg)的常用對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)(X)，峰面積常用對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：Y=2.208 6X+9.675 3，r=0.999 3。結(jié)果表明，黃芪甲苷在1.968～9.840 μg有良好的線性關(guān)系。

2.1.5 樣品測(cè)定 按2.1.3項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，依法測(cè)定，計(jì)算黃芪甲苷的量。色譜圖見(jiàn)圖1～2。

2.2 黃芪的提取和純化

2.2.1 黃芪提取液的制備 取黃芪藥材5 kg，加入含2%氫氧化鈉(NaOH)的70%乙醇溶液，提取2次，每次2 h，濾過(guò)，合并濾液?；厥找掖贾翢o(wú)醇味，加水適量，高速離心，稀釋成0.4 g·mL-1(生藥計(jì))的樣品液，作為提取液。經(jīng)測(cè)定，黃芪甲苷的質(zhì)量濃度為為8.12 mg·mL-1。

圖1 黃芪甲苷對(duì)照品色譜圖

圖2 大孔樹(shù)脂純化后的黃芪提取物供試樣色譜圖

2.2.2 樹(shù)脂的選擇 參照文獻(xiàn)[7]方法，取D101、AB-8、HPD300、HPD600、DM130 5種樹(shù)脂，用95%乙醇浸泡24 h，充分溶脹，然后用95%乙醇不斷沖洗，至1份流出液加3份純化水不出現(xiàn)渾濁為止，再用純化水沖洗至無(wú)醇味，備用。

不同吸附樹(shù)脂對(duì)黃芪甲苷的靜態(tài)飽和吸附實(shí)驗(yàn)：稱取預(yù)處理過(guò)的D101、AB-8、HPD300、HPD600、DM130各5 g，置具塞錐形瓶中，分別加入黃芪提取液各50 mL，塞緊瓶塞，置于振蕩器上，振搖吸附24 h，使樹(shù)脂對(duì)黃芪提取液中黃芪甲苷的吸附達(dá)到平衡狀態(tài)，靜置，濾過(guò)，得吸附后黃芪甲苷溶液；再將靜態(tài)吸附的樹(shù)脂抽干，加30 mL 95%乙醇解吸，放入搖床上振蕩6 h，濾過(guò)，得黃芪甲苷洗脫液。分別取吸附后溶液、洗脫液各2 mL，蒸干，按2.1.3項(xiàng)下方法制得供試品溶液，測(cè)得溶液中黃芪甲苷量，計(jì)算吸附率和洗脫率。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 5種樹(shù)脂對(duì)黃芪甲苷的靜態(tài)吸附-洗脫性能實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由上表1中吸附率可看出：吸附率排序?yàn)镠PD600>HPD300>AB-8>DM130>D101；解吸率排序?yàn)镠PD300>AB-8>DM130>HPD600>D101。結(jié)果表明，靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)中，HPD300、AB-8型樹(shù)脂對(duì)樣品中黃芪甲苷的吸附率和洗脫率均高于D101、DM130樹(shù)脂，HPD600型樹(shù)脂吸附率雖高，但洗脫率太低?？紤]到靜態(tài)吸附與動(dòng)態(tài)吸附之間存在一定差異，我們選取靜態(tài)吸附、解吸性能較好的HPD300、AB-8型樹(shù)脂，進(jìn)一步考察其對(duì)黃芪甲苷的動(dòng)態(tài)吸附性能。

HPD300、AB-8吸附樹(shù)脂對(duì)黃芪甲苷的動(dòng)態(tài)飽和吸附實(shí)驗(yàn)：取預(yù)處理過(guò)的HPD300、AB-8適量，分別濕法裝柱(17 cm×1.5 cm)，柱體積約為30 mL，以質(zhì)量濃度為0.4 g·mL-1(生藥計(jì))的黃芪提取液上樣，流速為2 BV·h-1，分別收集流出液，每流出15 mL(相當(dāng)于0.5 BV)收集1瓶，作為一組份，測(cè)定黃芪甲苷含量，繪制各樹(shù)脂的泄漏曲線，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 HPD300、AB-8樹(shù)脂動(dòng)態(tài)吸附泄漏曲線

由圖3可見(jiàn)，等量柱體積的HPD300、AB-8兩種樹(shù)脂，對(duì)同一黃芪提取液進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附，HPB300出現(xiàn)泄漏點(diǎn)和達(dá)到吸附飽和時(shí)，所加黃芪提取液量均高于AB-8樹(shù)脂，說(shuō)明HPB300樹(shù)脂動(dòng)態(tài)飽和吸附量大于AB-8樹(shù)脂。

HPD300、AB-8吸附樹(shù)脂對(duì)黃芪甲苷的動(dòng)態(tài)解吸實(shí)驗(yàn)：取預(yù)處理過(guò)的HPD300、AB-8適量，分別濕法裝柱(17 cm×1.5 cm)，柱體積約為30 mL，以質(zhì)量濃度為0.4 g·mL-1(生藥計(jì))的黃芪提取液上樣，以2 BV·h-1的流速吸附后，先用2 BV水洗脫，再用70%乙醇以2 BV·h-1的流速洗脫，每流出15 mL(相當(dāng)于0.5 BV)收集1瓶，作為一組份，測(cè)定黃芪甲苷含量，繪制解吸曲線，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 HPD300、AB-8樹(shù)脂動(dòng)態(tài)解吸曲線

由圖4可見(jiàn)，HPD300對(duì)黃芪甲苷的解吸效果優(yōu)于AB-8。綜合兩種吸附樹(shù)脂對(duì)黃芪甲苷的動(dòng)態(tài)吸附和解吸性能，選用HPD300樹(shù)脂來(lái)分離純化黃芪提取液中總皂苷效果最佳。

2.2.3 洗脫劑濃度的篩選 將一定量的黃芪提取液通過(guò)樹(shù)脂柱，流速為2 BV·h-1，吸附結(jié)束后，用水洗至流出液不顯Molish反應(yīng)，再依次用10%、30%、50%、70%、90%洗脫劑洗脫，速度為2 BV·h-1，每個(gè)濃度洗脫4 BV，收集洗脫液，測(cè)定洗脫液中黃芪甲苷的含量。以測(cè)定結(jié)果繪制解吸曲線，見(jiàn)圖5。

注：1～4號(hào)10%乙醇解吸液；5～8號(hào)30%乙醇解吸液；9～12號(hào)50%乙醇解吸液；13～16號(hào)70%乙醇解吸液；17～20號(hào)90%乙醇解吸液。圖5 不同洗脫劑濃度乙醇對(duì)黃芪甲苷純化的影響

洗脫曲線顯示，黃芪甲苷主要集中在50%、70%乙醇洗脫液中。另取黃芪提取液2份，每份30 mL，分別上柱，先用2 BV水洗脫，再分別用50%、70%乙醇溶液各100 mL洗脫，測(cè)定黃芪甲苷洗脫率分別為71.2%、88.5%，70%乙醇的解吸效果優(yōu)于50%乙醇，故確定洗脫條件為先水洗去雜質(zhì)后，再用70%乙醇洗脫，收集70%乙醇洗脫部分。

2.2.4 吸附容量的確定 取處理后的大孔樹(shù)脂3根，吸取黃芪提取液40 mL，上柱，預(yù)吸附1 h，過(guò)柱流出液重吸附1次，靜置吸附12 h，先用2 BV水洗脫，再用70%乙醇洗脫，收集70%乙醇洗脫液，平行測(cè)定3次，測(cè)定黃芪甲苷含量，計(jì)算吸附容量。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 黃芪甲苷吸附容量的測(cè)定

注：吸附容量=(上柱液中黃芪甲苷含量-過(guò)柱液中黃芪甲苷含量)/樹(shù)脂干重。

2.2.5 上樣量的確定 取質(zhì)量濃度為0.4 g·mL-1(生藥計(jì))的黃芪提取液上樣，以0.5 BV為單位收集流出液，測(cè)定黃芪甲苷含量，考察黃芪甲苷泄漏點(diǎn)。結(jié)果顯示，出現(xiàn)泄漏的最高量為4 BV柱體積。折算成黃芪生藥量與樹(shù)脂量的比例為2.2∶1，考慮生產(chǎn)實(shí)際偏差，確定上柱生藥量與樹(shù)脂量之比為2∶1。

2.2.6 洗脫劑量的確定 取120 mL的黃芪提取液，通過(guò)預(yù)處理過(guò)的HPD300樹(shù)脂層析柱(1 BV=30 mL)，吸附結(jié)束后，先用2 BV水洗脫，棄去。再用70%乙醇以2 BV·h-1的速度進(jìn)行洗脫，按順序每0.5 BV收集1瓶，共收集9瓶。測(cè)定各號(hào)瓶中黃芪甲苷的含量，以測(cè)定結(jié)果繪制動(dòng)態(tài)解析曲線。見(jiàn)圖6。

由圖6可知，用4 BV 70%乙醇溶液，可將吸附的黃芪甲苷解析下來(lái)，因而確定洗脫劑用量為4倍柱體積的70%乙醇溶液。

圖6 黃芪甲苷的動(dòng)態(tài)解吸曲線

分別取上柱液、過(guò)柱液、解析液適量，蒸干，按2.1.3項(xiàng)下的方法制得供試品溶液，測(cè)定，計(jì)算黃芪甲苷動(dòng)態(tài)吸附率和解析率，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 HPD300樹(shù)脂對(duì)黃芪甲苷的吸附率與解析率

2.2.7 驗(yàn)證試驗(yàn) 按上述試驗(yàn)得出的優(yōu)選工藝條件進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，分別取黃芪提取液(黃芪甲苷質(zhì)量濃度為8.12 mg·mL-1)2000 mL，通過(guò)裝有預(yù)處理過(guò)的400 g HPD300樹(shù)脂柱中，先用2 BV水洗脫，棄去。再用4 BV 70%乙醇洗脫，收集70%乙醇洗脫部分，濃縮，干燥，得黃芪提取物，測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 3次驗(yàn)證試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果

2.2.8 大孔樹(shù)脂使用次數(shù)考察 取3份預(yù)處理過(guò)的HPD300樹(shù)脂，分別濕法裝柱，各吸取黃芪提取液40 mL，以2 BV·h-1的流速吸附后，先用2 BV水洗脫，再用4 BV 70%乙醇以2 BV·h-1的流速洗脫。分別收集過(guò)柱液、洗脫液，測(cè)定黃芪甲苷含量，計(jì)算樹(shù)脂柱吸附容量。最后用適量蒸餾水沖洗樹(shù)脂至滴出液無(wú)醇味，不經(jīng)再生，重復(fù)以上操作，以使用次數(shù)為橫坐標(biāo)，吸附容量為縱坐標(biāo)作圖，見(jiàn)圖7。

圖7 HPD300樹(shù)脂柱連續(xù)使用過(guò)程中黃芪甲苷吸附容量的變化

由圖7可知，樹(shù)脂初次使用時(shí)，黃芪甲苷吸附容量約為61.8 mg·g-1，使用次數(shù)增加，樹(shù)脂吸附能力有所下降。本實(shí)驗(yàn)中，連續(xù)使用18次后，黃芪甲苷吸附容量為原來(lái)的72.1%。因而可認(rèn)為樹(shù)脂首次使用后，在連續(xù)使用18次后，需要經(jīng)過(guò)再生后才能使用。

2.2.9 大孔樹(shù)脂再生方法考察 一般來(lái)講，用95%乙醇洗脫至無(wú)色，再水洗至無(wú)醇味，即可再用。但若樹(shù)脂受污染嚴(yán)重，顏色變深，吸附能力降低，應(yīng)用強(qiáng)酸堿液再生處理。本實(shí)驗(yàn)中樹(shù)脂使用18次后顏色略有變深，因而考慮用95%乙醇洗脫再生。

對(duì)已使用過(guò)18次的HPD300樹(shù)脂，先用95%乙醇浸泡2 h，裝柱，再用95%乙醇洗至滴出液無(wú)色，最后用大量水洗至無(wú)醇味，再重新上樣，考察再生后樹(shù)脂柱的吸附容量、吸附率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 95%乙醇洗脫再生工藝考察

結(jié)果表明，用95%乙醇再生后，樹(shù)脂對(duì)黃芪甲苷的吸附容量可達(dá)到新樹(shù)脂的95.5%，再生連續(xù)使用3次，樹(shù)脂對(duì)黃芪甲苷的吸附容量可達(dá)到新樹(shù)脂的93.6%。由此說(shuō)明，采用95%乙醇洗脫對(duì)樹(shù)脂進(jìn)行再生是可行的。

3 討論

黃芪甲苷是黃芪藥材重要的藥效活性物質(zhì)，但其含量較低，各產(chǎn)地藥材間差別較大[8]，質(zhì)量控制較為困難。近年來(lái)，多篇文獻(xiàn)[9-12]報(bào)道了在黃芪藥材提取或制劑分析中采用堿液處理方法，以提高黃芪甲苷的含量。本實(shí)驗(yàn)中，我們通過(guò)優(yōu)化工藝參數(shù)，選擇水解條件相對(duì)溫和的堿性乙醇回流提取黃芪總皂苷。通過(guò)皂化反應(yīng)，將黃芪中眾多環(huán)黃芪醇皂苷配糖體上含-OAC基團(tuán)轉(zhuǎn)化為-OH，提高了黃芪甲苷的含量。經(jīng)測(cè)定，水解前后樣品中總皂苷含量無(wú)明顯差異，但水解后樣品中黃芪甲苷的含量增加了近20倍。由于總皂苷中各種原生皂苷的種類和比例通過(guò)堿液水解后有了較大的變化，黃芪甲苷含量顯著提高后與原總皂苷相比是否具有增效作用還需結(jié)合具體功能作進(jìn)一步的藥理驗(yàn)證。

本文通過(guò)5種大孔樹(shù)脂對(duì)黃芪總皂苷的吸附、純化性能的對(duì)比篩選，最后選定HPD-300型樹(shù)脂作為純化樹(shù)脂。黃芪提取物經(jīng)HPD-300樹(shù)脂精制后，黃芪甲苷含量可達(dá)33.8%，精制度平均可達(dá)545.2%。

[1] 陰健，郭力弓.中藥現(xiàn)代研究與臨床應(yīng)用[M].北京：學(xué)苑出版社，2001.

[2] 古共偉，陳健，魏璽群.吸附分離技術(shù)在現(xiàn)代工業(yè)中的應(yīng)用[J].合成化學(xué)，1999，7(4)：346-353.

[3] 雷建飛，賈莉萍.大孔吸附樹(shù)脂分離純化皂苷工藝研究進(jìn)展[J].中國(guó)現(xiàn)代中藥，2006，8(11)：22-24.

[4] 程新宇，韓亞男，金燕清，等.大孔樹(shù)脂在甘草活性成分分離純化中的應(yīng)用[J].中國(guó)現(xiàn)代中藥，2014，16(4)；343-348.

[5] 隋玉蘭，李兆翌.黃芪中黃芪總皂苷的大孔樹(shù)脂純化工藝研究[J].中國(guó)實(shí)用醫(yī)藥，2010，11(5)：1-2.

[6] 李春紅，田吉.大孔樹(shù)脂對(duì)黃芪總皂苷的分離純化研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39(25)：15272-15274.

[7] 劉穎，劉樹(shù)民，于棟華，等.大孔樹(shù)脂純化穿山龍總皂苷的工藝優(yōu)化[J].醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2011，30(5)：635-637.

[8] 李英，秦雪梅，郭小青，等.不同產(chǎn)地黃芪中黃芪甲苷含量比較研究[J].中國(guó)現(xiàn)代中藥，2007，9(9)：9-11.

[9] 張金紅，周晶，宋慧琴，等.堿水解法提高黃芪藥材中黃芪甲苷的工藝研究[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2010，21(11)：2935-2937.

[10] 劉玫，周晶，張慶偉，等.氨液水解法用于提高黃芪中黃芪甲苷含量的工藝研究[J].中國(guó)中藥雜志，2008，33(6)：635-638.

[11] 張宇，呂哲，胡春玲，等.黃芪總皂苷水解為黃芪甲苷的工藝研究[J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué)，2001，24(4)：136-137.

[12] 田南卉，楊國(guó)紅，方穎，等.高效液相色譜法蒸發(fā)光散射檢測(cè)器測(cè)定黃芪和制劑中黃芪甲苷的含量[J].藥物分析雜志，2000，20(3)：199-200.

StudyonSeparationandPurificationofTotalSaponinsfromRadixAstragaliwithMacropereResin

WANG Dengbin，ZOUZhun，CHENWencai，ZOUJieming*

(GuilinSanjinPharmaceuticalCo.，Ltd.，Gangxi，Guilin541004，China)

Objective：To optimize the separation and purification processes of total saponins from Radix Astragali.Methods：The adsorption and desorption properties of total saponins of Astragalus(D101、AB-8、HPD300、HPD600、DM130)under static and dynamic conditions were investigated with the content of total saponins as index。Results：The purification effect of HPD300 resin was optimal，when the loading quantities was 2∶1(crude drug of Radix Astragali：macropere Resin)，With 70% ethanol as eluant，the amount was 4BV.The Desorption ratio and product purity reached 86.5% and 33.8% separately.Conclusion：The optimized macroporous resin purification process is stable and feasible，and can be used for separation and purification of total saponins of Astragalus.

Macropere resin；Radix Astragali；Astragaloside Ⅳ；HPLC-ELSD

2015-07-15)

廣西科技攻關(guān)項(xiàng)目(桂科攻14124004-2-10)

*

鄒節(jié)明，教授級(jí)高工，研究方向：中藥現(xiàn)代化；Tel：(0773)5842588，E-mail：zjm@sanjin.com.cn

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.2.019