周良云，劉談，王升，唐金富，康利平，郭蘭萍

(中國中醫(yī)科學(xué)院 中藥資源中心 道地藥材國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，北京 100700)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR研究進(jìn)展及其在中藥領(lǐng)域的應(yīng)用△

周良云，劉談，王升，唐金富，康利平，郭蘭萍*

(中國中醫(yī)科學(xué)院 中藥資源中心 道地藥材國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，北京 100700)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-Time PCR or qRT-PCR)是一種在PCR反應(yīng)體系中加入熒光物質(zhì)，利用熒光信號(hào)對(duì)整個(gè)PCR進(jìn)程進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測，從而達(dá)到對(duì)未知起始模板進(jìn)行定量分析的方法。該技術(shù)具有操作簡單、方便快捷、靈敏度高、特異性強(qiáng)、動(dòng)力學(xué)范圍寬、污染率低等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于核酸定量等分析中。本文對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量的基本原理、定量類型及其在中藥領(lǐng)域中的應(yīng)用作一綜述。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR；中藥領(lǐng)域；應(yīng)用

1993年，Higuchi等人將PCR技術(shù)和封閉式檢測相結(jié)合，對(duì)目的核酸數(shù)量進(jìn)行定量分析，提出了熒光定量PCR技術(shù)的概念。1995年美國PE公司成功研制了TaqMan技術(shù)，1996年又推出了首臺(tái)熒光定量PCR檢測系統(tǒng)，通過檢測每個(gè)循環(huán)的熒光強(qiáng)度，并使用Ct值進(jìn)行分析，達(dá)到定量核酸的目的，自此Real-Time PCR技術(shù)才得以真正的推廣和應(yīng)用。到目前為止，實(shí)時(shí)熒光定量已被廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)科學(xué)研究、臨床診斷、疾病研究及藥物研發(fā)等科學(xué)領(lǐng)域。

1 原理

Real-Time PCR是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光物質(zhì)，利用熒光信號(hào)對(duì)整個(gè)PCR進(jìn)程進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測，從而達(dá)到對(duì)未知起始模板進(jìn)行定量分析的目的。它是一種將酶動(dòng)力學(xué)、核酸擴(kuò)增、光譜分析和實(shí)時(shí)檢測技術(shù)相結(jié)合的技術(shù)。隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，反應(yīng)產(chǎn)物不斷累積，熒光信號(hào)強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過一個(gè)循環(huán)，收集一個(gè)熒光信號(hào)，這樣就可以通過熒光信號(hào)強(qiáng)度變化實(shí)時(shí)監(jiān)測PCR產(chǎn)物量的變化，從而得到一條描述PCR動(dòng)態(tài)進(jìn)程的曲線，即擴(kuò)增曲線。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增曲線可以分為4個(gè)階段[1]：基線期、早期指數(shù)期、對(duì)數(shù)-線性期和平臺(tái)期，見圖1。在基線期(通常1～15個(gè)循環(huán))，擴(kuò)增的熒光信號(hào)被熒光背景信號(hào)所掩蓋，無法判斷產(chǎn)物量的變化；早期指數(shù)期，熒光信號(hào)超過背景信號(hào)并到達(dá)閾值(通常為基線信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍[2])，此時(shí)循環(huán)數(shù)稱為Ct(Cycle threshold)值或Cp(Crossing point)值[2-3]，Ct值與模板起始濃度的對(duì)數(shù)值成反比線性關(guān)系，因而Ct值可被用來定量模板起始濃度[2]；對(duì)數(shù)-線性期，在理想反應(yīng)條件下每經(jīng)歷一個(gè)循環(huán)，PCR產(chǎn)物加倍；平臺(tái)期，擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級(jí)的增加，PCR的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系，所以根據(jù)最終的PCR產(chǎn)物量不能計(jì)算出起始模板拷貝數(shù)[1-2]。

圖1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增曲線

實(shí)時(shí)熒光定量PCR能準(zhǔn)確地確定初始模板拷貝數(shù)，結(jié)果重現(xiàn)性好，誤差小，與常規(guī)PCR在終點(diǎn)定量上相比更具重要意義。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果不僅可以定性(判斷一段序列的存在與否)，還可定量(確定基因的拷貝數(shù))，而常規(guī)PCR只能做到半定量。另外，實(shí)時(shí)熒光定量PCR的反應(yīng)和檢測都是在封閉的反應(yīng)管中進(jìn)行的，樣品污染幾率大大降低，無需擴(kuò)增后的實(shí)驗(yàn)操作，大大節(jié)省了實(shí)驗(yàn)時(shí)間，提高了實(shí)驗(yàn)效率[2]。

2 Real-Time PCR定量類型

實(shí)時(shí)熒光定量分析包括絕對(duì)定量和相對(duì)定量。絕對(duì)定量是對(duì)未知樣品絕對(duì)拷貝數(shù)進(jìn)行測定的方法；相對(duì)定量不是測定樣品的絕對(duì)拷貝數(shù)，而是比較樣品之間同一目的基因的相對(duì)表達(dá)量，以期分析樣品之間目的基因的表達(dá)差異。

2.1 絕對(duì)定量

絕對(duì)定量是使用一系列已知濃度(通常為5～6個(gè)梯度稀釋的濃度)的標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立Ct值與起始模板量[總核糖核酸(RNA)或脫氧核糖核酸(DNA)]的對(duì)數(shù)值之間的線性關(guān)系，達(dá)到對(duì)未知樣品絕對(duì)的定量。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制首先是標(biāo)準(zhǔn)品的選擇，標(biāo)準(zhǔn)品可以是DNA(重組質(zhì)粒DNA、基因組DNA、純化的RT-PCR產(chǎn)物及合成的寡核苷酸DNA[5-7])或RNA(體外轉(zhuǎn)錄RNA[5，8-10])。但是為了保持與待測樣品間擴(kuò)增效率的一致性，標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)盡量選擇與待測樣品結(jié)構(gòu)近似的樣品，該方法要求梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品都必須與待測樣品同時(shí)平行擴(kuò)增，且待測樣品濃度應(yīng)包含在已知標(biāo)準(zhǔn)品濃度范圍之內(nèi)。

2.2 相對(duì)定量

相對(duì)定量解析方法相對(duì)復(fù)雜，一般用于基因表達(dá)分析。根據(jù)選用的標(biāo)準(zhǔn)不同可分為以質(zhì)量單位為標(biāo)準(zhǔn)的相對(duì)定量和以內(nèi)參基因?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)的相對(duì)定量。以質(zhì)量單位(細(xì)胞的數(shù)目或核酸的微克數(shù))作為標(biāo)準(zhǔn)的相對(duì)定量優(yōu)點(diǎn)是實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)概念簡單，數(shù)據(jù)分析處理簡單易學(xué)，缺點(diǎn)是很難準(zhǔn)確量化初始材料；而以內(nèi)參基因作為標(biāo)準(zhǔn)的相對(duì)定量優(yōu)點(diǎn)是能準(zhǔn)確量化初始材料的載量，尤其當(dāng)初始材料受限時(shí)，進(jìn)行相對(duì)表達(dá)分析十分方便。缺點(diǎn)是要求得到一個(gè)或多個(gè)在所有待測樣本中恒定表達(dá)的內(nèi)參基因。目前，使用較多的是以內(nèi)參基因作為標(biāo)準(zhǔn)的定量方法。

2.2.1 內(nèi)參基因的穩(wěn)定性評(píng)價(jià) 為了確保定量結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性，在qRT-PCR中需選擇合適的內(nèi)參基因?qū)Σ煌瑯悠分g因質(zhì)量、RNA的提取效率以及反轉(zhuǎn)錄效率不同所產(chǎn)生的差異進(jìn)行校正，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)不同樣品中RNA的定量和數(shù)據(jù)歸一化[11-12]。理想的內(nèi)參基因應(yīng)滿足以下條件：1)在不同發(fā)育階段和不同組織器官中表達(dá)穩(wěn)定[11]；2)表達(dá)不受生物學(xué)、實(shí)驗(yàn)條件的影響[13]；3)其穩(wěn)定的表達(dá)水平與目的基因表達(dá)水平相近[10]。在植物qRT-PCR研究中用的最多的內(nèi)參基因通常是看家基因(housekeeping genes)，然而越來越多的研究表明，看家基因在不同類型細(xì)胞和不同生理狀態(tài)下的表達(dá)并不是恒定不變的[11，14]，若盲目選擇看家基因作為內(nèi)參，可能會(huì)導(dǎo)致基因表達(dá)分析結(jié)果不準(zhǔn)確，甚至得到相反的或者錯(cuò)誤的結(jié)論[15]。因此選擇合適的、穩(wěn)定的內(nèi)參用于基因表達(dá)的差異分析非常關(guān)鍵。目前，geNorm[13]、NormFinder[16]、BestKeeper[17]、Delta CT[18]等分析方法被廣泛用于內(nèi)參基因的篩選與評(píng)價(jià)[19-21]。Xie等[22]將上述4種方法整合成一個(gè)在線的分析工具—RefFinder，用于各種實(shí)驗(yàn)條件下內(nèi)參的篩選，避免了單個(gè)分析方法的片面性。

2.2.2 引物的特異性及擴(kuò)增效率的檢測 為了使結(jié)果準(zhǔn)確可靠，qRT-PCR中還要求引物的特異性好，擴(kuò)增效率接近100%。劉正霞等[23]研究顯示，引物的特異性和擴(kuò)增效率對(duì)定量PCR結(jié)果分析有顯著影響。

引物的特異性評(píng)估：引物的特異性可以通過凝膠電泳、PCR產(chǎn)物克隆測序以及qRT-PCR的熔解曲線來檢查。凝膠電泳的條帶若為單一條帶，則說明PCR產(chǎn)物特異性好，若有多條則說明特異性差，需要優(yōu)化PCR反應(yīng)條件和體系或重新設(shè)計(jì)引物；PCR產(chǎn)物克隆測序結(jié)果在去除載體序列后與原序列進(jìn)行比對(duì)，分析測得的序列是否位于上下游引物之間；在qRT-PCR中，可以通過熔解曲線來判斷引物的特異性，若熔解曲線為單峰則說明引物的特異性好。通過上述3種方法均可以對(duì)設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行特異性檢測，以便篩選特異性較好的引物進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

擴(kuò)增效率的計(jì)算：相對(duì)定量結(jié)果的準(zhǔn)確性還受到目的基因和內(nèi)參基因的PCR擴(kuò)增效率影響。一般來說，擴(kuò)增效率接近100%是優(yōu)化實(shí)驗(yàn)使得結(jié)果重復(fù)性好且可靠的最好標(biāo)志。實(shí)際操作時(shí)，反應(yīng)的擴(kuò)增效率應(yīng)該在90%～105%之間，如果擴(kuò)增效率低，可能原因是引物設(shè)計(jì)不佳，或是反應(yīng)的條件沒有優(yōu)化；擴(kuò)增效率大于100%時(shí)，可能的原因有非特異性產(chǎn)物擴(kuò)增，如引物二聚體、錯(cuò)配等引起的PCR產(chǎn)物產(chǎn)生。

傳統(tǒng)計(jì)算擴(kuò)增效率的方法[6]是將已知模板稀釋成一系列梯度濃度(不少于5個(gè)點(diǎn))，并進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)，利用拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值和Ct值建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)曲線的優(yōu)劣有兩個(gè)指標(biāo)，相關(guān)系數(shù)(r)和斜率。相關(guān)系數(shù)反映標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線性，越接近1說明直線性越好，定量越精確；斜率與擴(kuò)增效率相關(guān)，計(jì)算公式：擴(kuò)增效率(E)=10(-1/斜率)-1。在PCR過程中，擴(kuò)增效率在指數(shù)期相對(duì)穩(wěn)定，但是隨著循環(huán)數(shù)的增加，Taq酶、脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP)、引物，甚至DNA模板等各種PCR要素逐漸不敷需求，擴(kuò)增效率也就越來越趨向于0。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線得出的擴(kuò)增效率不能反映PCR進(jìn)程中擴(kuò)增效率的變化。由于PCR結(jié)果往往是通過Ct值來計(jì)算的，由擴(kuò)增效率引起的最終差異只能反映在Ct值上的變化[24]。為了減小這種情況引起的誤差，在定量時(shí)確保各樣品濃度值在一系列梯度濃度的范圍內(nèi)，即Ct值在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)。此外，尚有根據(jù)PCR進(jìn)程中的原始數(shù)據(jù)或擴(kuò)增曲線的形狀，再基于不同的數(shù)學(xué)算法開發(fā)出來的一些軟件來計(jì)算擴(kuò)增效率的[25-27]。這些算法或軟件使得擴(kuò)增效率的計(jì)算更加簡單易行，特別是對(duì)于那些表達(dá)量很低的基因很難通過一系列的梯度稀釋來求擴(kuò)增效率。該方法缺點(diǎn)是不同軟件基于的算法不同，因此各軟件得到的結(jié)果也有差異；噪音導(dǎo)致可用的數(shù)據(jù)點(diǎn)很有限，計(jì)算的擴(kuò)增效率也就不精確。

2.2.3 數(shù)據(jù)處理方法 對(duì)于不同的實(shí)驗(yàn)需求，我們可以采用不同的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)分析，在這里只討論以內(nèi)參基因?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)的相對(duì)定量方法。常用的方法有雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法、2-△△Ct法、用參照基因的△Ct法和Pfaffi法，應(yīng)用每種方法必須對(duì)應(yīng)適應(yīng)的條件。

雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法[28]：首先分別對(duì)目的基因和看家基因的5個(gè)(盡量不少于5個(gè)點(diǎn))濃度梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品制作兩條標(biāo)準(zhǔn)曲線。各待測樣品與標(biāo)準(zhǔn)品同時(shí)進(jìn)行反應(yīng)，得到目的基因的Ct值，分別代入目的基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到看家基因的Ct值，分別代入看家基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線，這樣就可以換算出各待測樣品目的基因和看家基因的起始模板量。其次，利用內(nèi)參對(duì)各待測樣品進(jìn)行歸一化，即用目的基因的定量結(jié)果除以看家基因的定量結(jié)果。最后對(duì)不同樣品之間目的基因的表達(dá)量進(jìn)行比較，通常將對(duì)照樣品的表達(dá)量作為1，計(jì)算出相對(duì)量，再進(jìn)行樣品間相對(duì)量比較。

2-△△Ct(Livak)法[29]：2-△△Ct法是定量PCR實(shí)驗(yàn)中分析基因表達(dá)相對(duì)變化的一種簡便方法，但條件是目的基因和內(nèi)參基因擴(kuò)增效率都接近100%，且相互間效率偏差在5%以內(nèi)，否則會(huì)產(chǎn)生較大的誤差[30]。使用2-△△Ct法之前，必須驗(yàn)證目的基因和內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率。其操作步驟如下：首先，對(duì)所有的待測樣品和對(duì)照樣品，用內(nèi)參基因的Ct值歸一化目的基因的Ct值：△Ct=Ct(目的基因)-Ct(內(nèi)參基因)；其次，用對(duì)照樣品的△Ct值歸一化待測樣品的△Ct值：△△Ct=△Ct(待測樣品)-△Ct(對(duì)照樣品)；最后，計(jì)算表達(dá)水平比率：表達(dá)量的比值=2-△△Ct。如果目的基因和內(nèi)參基因有同樣的擴(kuò)增效率，但是擴(kuò)增效率不等于2，那么2-△△Ct法的公式可以修正為用實(shí)際擴(kuò)增效率值代替等式中的2。如果目的基因和內(nèi)參基因擴(kuò)增效率不相近，可以優(yōu)化或重新設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)。

用參照基因的△Ct法：用參照基因的△Ct法是2-△△Ct法的一種變化形式，它更容易掌握且結(jié)果相同。與2-△△Ct得到的△Ct值相比，△Ct法是每個(gè)樣本之間參照基因與目的基因的Ct值的差值。雖然這種方法的操作步驟簡單，但同樣也能真實(shí)衡量基因表達(dá)水平，將參照基因的表達(dá)水平計(jì)算在內(nèi)。結(jié)果顯示，主要的差異是校準(zhǔn)樣本的表達(dá)水平不是1。如果用這個(gè)方法得到的表達(dá)值除以所選的校準(zhǔn)樣本的表達(dá)值，計(jì)算結(jié)果與2-△△Ct法的結(jié)果正好相同，即表達(dá)量的比值=2(△Ct(內(nèi)參基因)-△Ct(目的基因))

Pfaffi法[31]：當(dāng)目的基因和內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率相近時(shí)，用2-△△Ct法定量相對(duì)基因表達(dá)是最合適的方法，但是如果兩個(gè)擴(kuò)增子擴(kuò)增效率不同，必須選擇另一種方法來確定不同樣本之間目的基因的相對(duì)表達(dá)量。Pfaffi法則是目前最好的選擇方法，計(jì)算公式為：

表達(dá)量的比值=C(A-E)/D(F-B)(C和D分別是目的基因和內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率；A和E分別是對(duì)照樣品和待測樣品中目的基因的Ct值；F和B分別是待測樣品和對(duì)照樣品中內(nèi)參基因的Ct值)。

2.2.4 歸一化 歸一化是對(duì)所有樣品之間的差異進(jìn)行校正。不同的樣品，即使反應(yīng)時(shí)使用相同量的總RNA，但因細(xì)胞來源不同，RNA總表達(dá)量并非一致。因此僅僅將反應(yīng)時(shí)RNA量統(tǒng)一，起始的細(xì)胞數(shù)也不一定相同。其實(shí)在進(jìn)行表達(dá)量分析時(shí)，比較的是相同數(shù)量細(xì)胞中的某個(gè)基因拷貝數(shù)目。實(shí)際上要將樣品材料統(tǒng)一到相同細(xì)胞數(shù)提取是非常困難的，同時(shí)還不能保證RNA提取效率、反轉(zhuǎn)錄效率以及PCR擴(kuò)增效率完全相同?；谏鲜鲈颍谶M(jìn)行表達(dá)量分析時(shí)，有必要選擇內(nèi)參基因?qū)λ袠悠愤M(jìn)行歸一化處理，以獲得目的基因特異性表達(dá)的真正差異。

篩選出穩(wěn)定的內(nèi)參基因后，先對(duì)目的基因歸一化處理，然后進(jìn)行表達(dá)差異分析。目前進(jìn)行歸一化分析的方法有兩種：單基因歸一化和多基因歸一化。

實(shí)時(shí)熒光定量最早被用于基因表達(dá)差異分析時(shí)，大多文獻(xiàn)報(bào)道都是以單個(gè)基因作為內(nèi)參基因，對(duì)目的基因的表達(dá)量進(jìn)行歸一化[29，32-33]。然而，基于單一內(nèi)參基因進(jìn)行歸一化存在許多缺點(diǎn)，可能導(dǎo)致比較大的誤差。因此，多個(gè)看家基因[15，20]開始被應(yīng)用于歸一化分析中。

3 在中藥領(lǐng)域中的應(yīng)用

3.1 基因表達(dá)分析

熒光定量PCR最普遍的應(yīng)用是基因表達(dá)分析。從基礎(chǔ)科學(xué)研究到實(shí)際應(yīng)用，檢測基因表達(dá)都是基本的也是很重要的一項(xiàng)工作。Olofsson等[34]對(duì)黃花蒿不同組織中萜類代謝途徑上的基因進(jìn)行表達(dá)差異分析，為評(píng)估青蒿素的前體對(duì)青蒿素產(chǎn)量的影響提供科學(xué)參考。植物在生物和非生物脅迫下，基因表達(dá)水平的相對(duì)變化與次生代謝產(chǎn)物累積相關(guān)性的研究越來越受到科研工作者的青睞。如Cheng等[35]用YE、Ag+和MeJA 3種誘導(dǎo)子組合誘導(dǎo)丹參毛狀根。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在處理24、36 h后，SmCPS的表達(dá)量顯著上調(diào)，次生代謝產(chǎn)物隱丹參酮和二氫丹參酮Ⅰ的含量也隨之顯著上升，這表明丹參酮類化合物含量的升高可能與SmCPS基因表達(dá)量的上調(diào)有關(guān)。在植物的不同發(fā)育階段，其次生代謝產(chǎn)物的累積量及基因的表達(dá)水平也會(huì)不同。如Kim等[36]對(duì)人參在葉片不同開放期(閉合階段、中間階段、全開放階段)其體內(nèi)人參皂苷及生物合成途徑上的關(guān)鍵酶基因進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，在中間階段和全開放階段人參皂苷生物合成途徑上的酶基因PgSS和PgSE的表達(dá)量比閉合階段增加約1.5倍，PgDDS的表達(dá)量則增加4倍以上；主根和側(cè)根中，人參皂苷的含量在葉片開放的中間階段達(dá)到最大值，而葉片中人參皂苷的含量在全開放階段達(dá)到最高。此外，實(shí)時(shí)熒光定量的差異表達(dá)分析在中藥領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，如在甘草[37]、黃花蒿[38-40]等藥用植物中都有大量的研究。

3.2 中藥品種及真?zhèn)舞b別

中藥的真?zhèn)沃苯佑绊懪R床用藥的準(zhǔn)確性和中藥的質(zhì)量，因此對(duì)于中藥品種真?zhèn)蔚蔫b別歷來是中藥研究中極為重要的工作。

Xue等[41]依據(jù)骨碎補(bǔ)的正品及其混淆品trnL-trnF間隔序列，設(shè)計(jì)Scorpion探針，通過實(shí)時(shí)熒光定量對(duì)骨碎補(bǔ)的真?zhèn)芜M(jìn)行鑒別，同時(shí)對(duì)多個(gè)混合樣品(正品中加入一種混淆品，按一定比例梯度混合)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，以分析正品中混淆品的摻入量。另外，Xue等[42]基于升麻及其替代品之間內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)序列的長度、鳥嘌呤(G)、胞嘧啶(C)含量的差異，采用LightCycler定量儀擴(kuò)增升麻及其替代品的ITS序列，并分析各產(chǎn)物的熔解曲線。通過解鏈溫度的差異區(qū)分鑒別升麻及其替代品，為快速、穩(wěn)定鑒別升麻及其替代品建立了標(biāo)準(zhǔn)。董玉茹等[43]將限制性內(nèi)切酶引入熔解曲線分析中，建立了一種新的單核苷酸多態(tài)性(SNP)分型方法，成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)金銀花與山銀花、白術(shù)與蒼術(shù)品種及真?zhèn)蔚蔫b別。此外，有研究者[44-45]基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，分別對(duì)鐵皮石斛近緣種冒充鐵皮石斛以及三七粉摻假等現(xiàn)象建立快速的檢測方法。

4 小結(jié)

植物在生長、發(fā)育及受外界環(huán)境刺激等過程中，其基因在不同時(shí)空的表達(dá)存在著很大差異。對(duì)基因的表達(dá)量進(jìn)行差異分析，是了解生物體生長、發(fā)育和調(diào)控等機(jī)理的一個(gè)重要內(nèi)容。Northern雜交、Southern雜交和原位雜交等都可以用來進(jìn)行目的基因的定量分析，但這些方法耗時(shí)且敏感性較差。普通PCR終點(diǎn)定量的缺陷是擴(kuò)增出來的DNA產(chǎn)物需要通過瓊脂糖凝膠電泳、溴化乙錠(EB)染色后才可以顯示出來，這些步驟耗時(shí)且不易精確定量。此外，由于酶動(dòng)力學(xué)的特點(diǎn)，在PCR反應(yīng)進(jìn)程中有基線期、早期指數(shù)期、對(duì)數(shù)-線性期和平臺(tái)期，理論上來說，所有樣本的DNA擴(kuò)增量最后是相同的，但實(shí)際上，不同樣本的平臺(tái)期是不一樣的。在這種情況下，通過終點(diǎn)定量分析，反而將反應(yīng)效率中很小的差別放大出來，造成定量的不準(zhǔn)確。實(shí)時(shí)熒光定量為起始定量，誤差相對(duì)較小，這使其在定量方面得到快速的發(fā)展。PCR產(chǎn)物長度或組成不同，其熔解曲線(熔鏈溫度)也存在差異，因此可根據(jù)熔解曲線的差異進(jìn)行物種的鑒別。中藥鑒定要解決其中一個(gè)很重要的問題就是真?zhèn)?。?shí)驗(yàn)過程中，我們可通過設(shè)計(jì)特異性引物來擴(kuò)增不同的樣品，從而得到不同的PCR產(chǎn)物，再根據(jù)相應(yīng)的熔解曲線鑒定中藥材的真?zhèn)魏蛽絺蔚闹兴幉摹４送?，?shí)時(shí)熒光定量PCR還可廣泛用于等位基因分析及轉(zhuǎn)基因生物檢測等。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR自建立以來，發(fā)展迅速、應(yīng)用廣泛，擁有許多優(yōu)點(diǎn)。近年來，許多科研工作者基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR的基本原理對(duì)其進(jìn)行不斷地研究和改進(jìn)，使實(shí)時(shí)熒光定量PCR得到了進(jìn)一步的完善[46]。隨著實(shí)時(shí)熒光定量PCR的不斷標(biāo)準(zhǔn)化，該技術(shù)將在生物學(xué)、醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究等科研領(lǐng)域中得到更加廣泛的推廣與應(yīng)用。

[1] Tichopad A，Dilger M，Schwarz G，et al.Standardized determination of real-time PCR efficiency from a single reaction set-up[J].Nucleic Acids Res，2003，31(20)：e122.

[2] Heid C A，Stevens J，Livak K J，et al.Real time quantitative PCR[J].Genome Res，1996，6(10)：986.

[3] Von Ahsen N，Schütz E，Armstrong V W，et al.Rapid detection of prothrombotic mutations of prothrombin(G20210A)，factor V(G1691A)，and methylenetetrahydrofolate reductase(C677T)by real-time fluorescence PCR with the LightCycler[J].Clin Chem，1999，45(5)：694.

[4] Wong M L，Medrano J F.Real-time PCR for mRNA quantitation[J].Biotechniques，2005，39(1)：75.

[5] Bustin S A.Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays[J].J Mol Endocrinol，2000，25(2)：169.

[6] Pfaffl M W，Hageleit M.Validities of mRNA quantification using recombinant RNA and recombinant DNA external calibration curves in real-time RT-PCR[J].Biotechnol Lett，2001，23(4)：275.

[7] Wittwer C.Rapid cycle real-time PCR：methods and applications[M].Berlin：Germany Springer Berlin Heidelberg，2001.

[8] Pfaffl M.Development and validation of an externally standardised quantitative insulin-like growth factor-1 RT-PCR using LightCycler SYBR Green I technology[M]//Rapid Cycle Real-Time PCR.Berlin：Germany Springer Berlin Heidelberg，2001.

[9] Pfaffl M W，Georgieva T M，Georgiev I P，et al.Real-time RT-PCR quantification of insulin-like growth factor(IGF)-1，IGF-1 receptor，IGF-2，IGF-2 receptor，insulin receptor，growth hormone receptor，IGF-binding proteins 1，2 and 3 in the bovine species[J].Domest Anim Endocrin，2002，22(2)：91.

[10] Fronhoffs S，Totzke G，Stier S，et al.A method for the rapid construction of cRNA standard curves in quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction[J].Mol Cell Probe，2002，16(2)：99.

[11] Bustin S A.Quantification of mRNA using real-time reverse transcription PCR(RT-PCR)：trends and problems[J].J Mol Endocrinol，2002，29(1)：23.

[12] Suzuki T，Higgins P J，Crawford D R.Control selection for RNA quantitation[J].Biotechniques，2000，29(2)：332-337.

[13] Vandesompele J，De Preter K，Pattyn F，et al.Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes[J].Genome Biol，2002，3(7)：research0034.

[14] Huggett J，Dheda K，Bustin S，et al.Real-time RT-PCR normalisation；strategies and considerations[J].Genes Immun，2005，6(4)：279.

[15] Gutierrez L，Mauriat M，Guénin S，et al.The lack of a systematic validation of reference genes：a serious pitfall undervalued in reverse transcription‐polymerase chain reaction(RT‐PCR)analysis in plants[J].Plant Biotechnol J，2008，6(6)：609.

[16] Andersen C L，Jensen J L，?rntoft T F.Normalization of real-time quantitative reverse transcription-PCR data：a model-based variance estimation approach to identify genes suited for normalization，applied to bladder and colon cancer data sets[J].Cancer Res，2004，64(15)：5245.

[17] Pfaffl M W，Tichopad A，Prgomet C，et al.Determination of stable housekeeping genes，differentially regulated target genes and sample integrity：BestKeeper-Excel-based tool using pair-wise correlations[J].Biotechnol Lett，2004，26(6)：509.

[18] Silver N，Best S，Jiang J，et al.Selection of housekeeping genes for gene expression studies in human reticulocytes using real-time PCR[J].BMC Mol Biol，2006，7(1)：33.

[19] 周良云，莫歌，王升，等.基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)鎘處理下黃花蒿內(nèi)參基因穩(wěn)定性的分析[J].中國中藥雜志，2014，39(5)：777.

[20] 李竹君，郭健雄，李永文，等.穿心蓮實(shí)時(shí)定量PCR 分析中內(nèi)參基因的選擇[J].廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，30(2)：240.

[21] 張崗，趙明明，張大為，等.鐵皮石斛實(shí)時(shí)定量PCR內(nèi)參基因的篩選[J].中國藥學(xué)雜志，2013，48(19)：1664.

[22] Xie F，Sun G，Stiller J W，et al.Genome-wide functional analysis of the cotton transcriptome by creating an integrated EST database[J].PLoS One，2011，6(11)：e26980.

[23] 劉正霞，徐陽，徐進(jìn)梅，等.不同引物及數(shù)據(jù)分析方法對(duì)定量PCR結(jié)果的影響[J].南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2009，29(8)：1112.

[24] Giulietti A，Overbergh L，Valckx D，et al.An overview of real-time quantitative PCR：applications to quantify cytokine gene expression[J].Methods，2001，25(4)：386.

[25] Ruijter J M，Ramakers C，Hoogaars W M H，et al.Amplification efficiency：linking baseline and bias in the analysis of quantitative PCR data[J].Nucleic Acids Res，2009，37(6)：e45.

[26] Zhao S，F(xiàn)ernald R D.Comprehensive algorithm for quantitative real-time polymerase chain reaction[J].J Comput Biol，2005，12(8)：1047.

[27] Rutledge R G，Stewart D.A kinetic-based sigmoidal model for the polymerase chain reaction and its application to high-capacity absolute quantitative real-time PCR[J].BMC Biotechnol，2008，8(1)：47.

[28] Livak K J.ABI Prism 7700 sequence detection system[J].User bulletin，1997，2：1.

[29] Livark K J，Schmittgen T D.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T))method[J].Methods，2001，25(4)：402.

[30] Liu W，Saint D A.A new quantitative method of real time reverse transcription polymerase chain reaction assay based on simulation of polymerase chain reaction kinetics[J].Anal Biochem，2002，302(1)：52.

[31] Pfaffl M W.A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR[J].Nucleic acids Res，2001，29(9)：e45.

[32] 程琪慶，何云飛，李耿，等.丹參4-羥基-3-甲基-2-丁烯基焦磷酸還原酶基因的全長克隆與誘導(dǎo)表達(dá)分析[J].藥學(xué)學(xué)報(bào)，2013，48(2)：236.

[33] Yu Z X，Li J X，Yang C Q，et al.The jasmonate-responsive AP2/ERF transcription factors AaERF1 and AaERF2 positively regulate artemisinin biosynthesis inArtemisiaannuaL[J].Mol Plant，2012，5(2)：353.

[34] Olofsson L，Engstr?m A，Lundgren A，et al.Relative expression of genes of terpene metabolism in different tissues ofArtemisiaannuaL[J].BMC Plant Biol，2011，11(1)：45

[35] Cheng Q，He Y，Li G，et al.Effects of combined elicitors on tanshinone metabolic profiling and SmCPS expression inSalviamiltiorrhizahairy root cultures[J].Molecules，2013，18(7)：7473.

[36] Kim Y J，Jeon J N，Jang M G，et al.Ginsenoside profiles and related gene expression during foliation inPanaxginsengMeyer[J].J Gins Res，2014，38(1)：66.

[37] Nasrollahi V，Mirzaie-asl A，Piri K，et al.The effect of drought stress on the expression of key genes involved in the biosynthesis of triterpenoid saponins in liquorice(Glycyrrhizaglabra)[J].Phytochemistry，2014，103：32.

[38] Stimulation of artemisinin synthesis by combined cerebroside and nitric oxide elicitation inArtemisiaannuahairy roots[J].Appl Microbiol Biot，2009，85(2)：285.

[39] Arsenault P R，Vail D，Wobbe K K，et al.Reproductive development modulates gene expression and metabolite levels with possible feedback inhibition of artemisinin inArtemisiaannua[J].Plant Physiol，2010，154(2)：958.

[40] Guo X X，Yang X Q，Yang R Y，et al.Salicylic acid and methyl jasmonate but not Rose Bengal enhance artemisinin production through invoking burst of endogenous singlet oxygen[J].Plant Sci，2010，178(4)：390.

[41] Xue C Y，Xue H G.Application of Real-Time Scorpion PCR for Authentication and Quantification of the Traditional Chinese Medicinal PlantDrynariafortunei[J].Planta medica，2008，74(11)：1416.

[42] Xue C Y，Li D Z，Wang Q Z.Application of LightCycler Polymerase Chain Reaction and Melting Curve Analysis to the Authentication of the Traditional Chinese Medicinal PlantCimicifugafoetida[J].Planta medica，2009，75(8)：873.

[43] 童玉茹，蔣超，黃璐琦，等.基于熔解曲線分析技術(shù)的三七粉分子鑒定[J].藥物分析雜志，2014，34(8)：49.

[44] Xu H，Hou B，Zhang J，et al.Detecting adulteration ofDendrobiumofficinaleby real‐time PCR coupled with ARMS[J].International Journal of Food Science & Technology，2012，47(8)：1695.

[45] 蔣超，黃璐琦，袁媛，等.酶切-熔解曲線分析：一種新的SNP分型方法及其在中藥材鑒定中的應(yīng)用[J].藥學(xué)學(xué)報(bào)，2014，49(4)：558.

[46] Bustin S A，Benes V，Garson J A，et al.The MIQE guidelines：minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments[J].Clin Chem，2009，55(4)：611.

Real-TimePCRandItsApplicationinStudyofTraditionalChineseMedicine(TCM)

ZHOULiangyun，LIUTan，WANGSheng，TANGJinfu，KANGLiping，GUOLanping*

(StateKeyLaboratoryBreedingBaseofDao-diHerbs，NationalResourceCenterforChineseMateriaMedica，ChinaAcademyofChineseMedicalSciences，Beijing100700，China)

Real-time PCR is a quantitative analysis method of initial template，which real-time monitors the whole PCR reaction by adding fluorescent substance into PCR reaction system to detect the fluorescence signal.Due to its advantages of simple operation，convenient and efficient，tremendous sensitivity，highly sequence-specific，a large dynamic range and low pollution，Real-time PCR has become one of the most widely used methods of nucleic acid quantitation and so on.This review discusses the theory，types of quantitation and its application in detailed TCM study.

Real-Time PCR；TCM study；application

2015-05-25)

國家自然科學(xué)基金(81130070，81325023，81473307)；國家科技支撐項(xiàng)目(2012BAI29B02，2012BAI28B002)

*

郭蘭萍，研究員，研究方向：中藥資源生態(tài)學(xué)及道地藥材形成的環(huán)境機(jī)制研究；Tel：(010)64011944，E-mail：glp01@126.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.2.027