王瑞生，張振凌，王勝超，李柯柯，孫翼飛

(河南中醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450008)

HPLC法同時(shí)測(cè)定五倍子發(fā)酵百藥煎中沒(méi)食子酸及鞣花酸含量△

王瑞生，張振凌*，王勝超，李柯柯，孫翼飛

(河南中醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州450008)

目的：建立同時(shí)測(cè)定五倍子發(fā)酵百藥煎中抗氧化活性成分沒(méi)食子酸和鞣花酸含量的方法，并對(duì)不同批次五倍子發(fā)酵百藥煎中的含量進(jìn)行比較。方法：反相高效液相色譜法，WatersSymmmetryShieldTMRP18(4.6×250mm，5μm)C18色譜柱；流動(dòng)相：乙腈-0.1%三氟乙酸水，梯度洗脫；流速1.0mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)254nm；柱溫35℃。結(jié)果：五倍子沒(méi)食子酸和鞣花酸含量分別為3.94%，0.25%；發(fā)酵成百藥煎含量增加，分別為14.20%，0.26%。結(jié)論：所建方法操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，適用于同時(shí)測(cè)定五倍子發(fā)酵百藥煎中沒(méi)食子酸和鞣花酸的含量，含量測(cè)定結(jié)果為百藥煎的藥用研究和產(chǎn)品的開發(fā)提供了依據(jù)。

百藥煎；沒(méi)食子酸；鞣花酸；含量測(cè)定

百藥煎始載于《丹溪心法》[1]，為五倍子同茶葉等經(jīng)發(fā)酵制成的塊狀物。性味：酸甘，平。具有潤(rùn)肺化痰，生津止渴的功效。臨床多用于治療久咳痰多，咽痛，便血，久痢脫肛，口瘡，牙疳，癰腫瘡瘍[2]。五倍子主要含沒(méi)食子酸和鞣質(zhì)類成分，發(fā)酵工藝對(duì)其有效成分的含量具有一定的差別[3]。目前關(guān)于百藥煎的質(zhì)量控制多數(shù)停留在性狀和沒(méi)食酸子酸含量測(cè)定[4]，對(duì)于鞣花酸含量測(cè)定文獻(xiàn)報(bào)道不多。由于鞣花酸抗病毒、抗氧化、鎮(zhèn)靜等作用[5]與百藥煎抗炎、抗菌、鎮(zhèn)咳等藥效作用一致[6]，將鞣花酸含量作為百藥煎質(zhì)量控制的指標(biāo)，具有重要的參考價(jià)值。因此，本文建立同時(shí)測(cè)定百藥煎藥材中沒(méi)食子酸和鞣花酸含量的HPLC方法，比較發(fā)酵對(duì)百藥煎中沒(méi)食子酸和鞣花酸的含量的影響，為百藥煎的質(zhì)量控制和開發(fā)應(yīng)用提供更全面的科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1儀器

高效液相色譜分析儀(Waters，Waters2489UV檢測(cè)器)，breeze數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，KQ-500DV型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，BS210S萬(wàn)分之一電子天平(北京賽多利斯天平有限公司)，BT25S十萬(wàn)分之一電子天平(北京賽多利斯天平有限公司)。

1.2試劑

沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品(成都普斯生物科技有限公司，批號(hào)：P0380052，純度>98.5%)，鞣花酸標(biāo)準(zhǔn)品(成都普斯生物科技有限公司，批號(hào)：P1440035，純度>98%)，乙腈(迪馬科技有限公司)，三氟乙酸(分析純)，甲醇(天津四有精細(xì)化學(xué)品有限公司，批號(hào)：140325，一級(jí)色譜純)，雙蒸水(自制)，安琪釀酒曲(湖北宜昌安琪有限公司，批號(hào)：20150120)，綠茶(河南信陽(yáng)茶葉專業(yè)市場(chǎng))。

1.3藥材

五倍子購(gòu)于安徽亳州中藥飲片廠，批號(hào)：20130812，經(jīng)河南中醫(yī)學(xué)院張振凌教授鑒定為漆樹科植物鹽膚木RhuschinensisMill.等樹上寄生倍蚜科昆蟲角倍蚜或倍蛋蚜后形成的蟲癭，符合《中國(guó)藥典》2010年版：“五倍子”項(xiàng)下的各項(xiàng)規(guī)定。百藥煎為本實(shí)驗(yàn)室炮制，批號(hào)為20141203-z，20141219-z，20150123-z，20150129-z，20150731-z，及杭州桐君堂生物科技有限公司提供，批號(hào)為20150301-q。

2 方法與結(jié)果

2.1樣品的制備

2.1.1五倍子 將五倍子藥材洗凈，60℃干燥10h，粉碎，過(guò)80目篩。

2.1.2百藥煎 置60℃烘箱中烘干，粉碎，過(guò)四號(hào)篩，備用。

2.2供試品溶液的制備

分別取各批次五倍子及百藥煎粉末(過(guò)四號(hào)篩)約0.2g，精密稱定，加入甲醇50mL，稱定重量，放置2h，超聲提取40min，放至室溫，補(bǔ)足重量，過(guò)濾，取續(xù)濾液，用0.45μm微孔濾膜過(guò)濾，即得供試品溶液。

2.3對(duì)照品溶液的制備

精密稱取沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品0.02009g，置于25mL容量瓶，甲醇溶解定容，得濃度為0.8036mg·mL-1沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液；精密稱取鞣花酸標(biāo)準(zhǔn)品0.00339g，置于100mL容量瓶，甲醇溶解定容，移取1mL，置于2mL容量瓶，甲醇定容，得0.01695mg·mL-1鞣花酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2.4色譜條件考察

色譜柱：WatersSymmmetryShieldTMRP18(4.6×250mm，5μm)；其他條件進(jìn)行研究如下。

2.4.1提取方法考察[7]考察了超聲提取和回流提取2種提取方法，依次進(jìn)行HPLC分析，結(jié)果顯示超聲提取效率更高，選擇超聲為提取方法。選取50%甲醇，95%乙醇和甲醇3個(gè)提取溶劑進(jìn)行了考察，結(jié)果顯示甲醇對(duì)百藥煎中沒(méi)食子酸及鞣花酸的提取率最高，因此選擇甲醇為提取溶劑。比較了不同的超聲時(shí)間(20，40，60min)，結(jié)果表明超聲40min和60min提取率均較高，二者之間無(wú)顯著性差異，因此選擇超聲時(shí)間為40min。

2.4.2洗脫程序考察

2.4.2.1方法一[8]：流動(dòng)相為乙腈和1%冰乙酸，梯度洗脫，流速1mL·min-1，柱溫35℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為248nm，進(jìn)樣量10uL。梯度洗脫程序?yàn)?～10min，18%乙腈；10～15min，18%～20%乙腈。

2.4.2.2方法二[9]：流動(dòng)相為乙腈(A)-0.25%甲酸溶液(B)，梯度洗脫，流速0.85mL·min-1，柱溫25℃，檢測(cè)波長(zhǎng)260nm，進(jìn)樣量10uL。梯度洗脫程序?yàn)?～6min，3%～5%B；6～15min，5%～8%B；15～17min，8%～15%B；17～25min，15～18%B；25～33min，18%～22%B；33～35min，22%～25%B；35～40min，25%～50%B；40～45min，50%～100%B。

2.4.2.3方法三[10]：流動(dòng)相為甲醇-0.1%磷酸溶液，梯度洗脫，流速1.0mL·min-1，柱溫為30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)280nm，進(jìn)樣量10uL。梯度洗脫程序?yàn)?～15min，10%甲醇；15～20min，10%～50%甲醇；20～40min，50%甲醇。

2.4.2.4方法四：流動(dòng)相為乙腈-1%三氟乙酸，梯度洗脫，流速1mL·min-1，柱溫35℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm[11]，進(jìn)樣量10uL。梯度洗脫程序?yàn)?～10min，18%乙腈；10～15min：18%～20%乙腈。

對(duì)比以上四種方法得到的色譜圖，根據(jù)沒(méi)食子酸及鞣花酸色譜峰的峰型，峰面積，分離度及峰高，選擇方法四檢測(cè)百藥煎中沒(méi)食子酸及鞣花酸含量測(cè)定的色譜條件。

2.4.3流動(dòng)相考察 對(duì)比乙腈-0.1%甲酸，乙腈-0.1磷酸，乙腈-0.1%冰醋酸，乙腈-0.1%三氟乙酸，根據(jù)色譜圖峰面積、分離度及峰型，選擇乙腈-0.1%三氟乙酸為流動(dòng)相，結(jié)果見圖1。

A：乙腈-0.1%甲酸，B：乙腈-0.1%磷酸，C：乙腈-0.1%冰醋酸，D：乙腈-0.1%三氟乙酸圖1 百藥煎不同流動(dòng)相色譜圖

2.4.4檢測(cè)波長(zhǎng)考察 將沒(méi)食子酸標(biāo)品，鞣花酸標(biāo)品及百藥煎樣品進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，掃描范圍：190nm-600nm，掃描間距：1nm，結(jié)果見圖2。沒(méi)食子酸在246nm，254nm，286nm，293nm處有最大吸收；鞣花酸在254nm，365nm處有最大吸收；百藥煎樣品在238nm，250nm，262nm，286nm，305nm處有最大吸收。綜合實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)及參考文獻(xiàn)選擇對(duì)比248nm，254nm，260nm，280nm四個(gè)波長(zhǎng)下色譜圖，最終選擇254nm為檢測(cè)波長(zhǎng)，結(jié)果見圖3。

A：沒(méi)食子酸標(biāo)品圖，B：鞣花酸標(biāo)品圖，C：百藥煎樣品圖圖2 百藥煎標(biāo)準(zhǔn)品及樣品全波長(zhǎng)掃描圖

2.4.5柱溫考察 對(duì)比30℃，35℃，40℃三個(gè)檢測(cè)溫度下的色譜圖，30℃色譜圖峰高和分離度均較低，35℃與40℃色譜圖差別較小，考慮到40℃，溫度較高對(duì)儀器及色譜柱有影響，選擇35℃為檢測(cè)柱溫，結(jié)果見圖4。

經(jīng)以上比較，確定流動(dòng)相：乙腈-0.1%三氟乙酸水，按表1梯度洗脫；流速1mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)254nm；柱溫35℃；進(jìn)樣量10μL。

表1 百藥煎沒(méi)食子酸及鞣花酸含量測(cè)定梯度洗脫程序

A：248 nm，B：254 nm，C：260 nm，D：280 nm圖3 百藥煎不同檢測(cè)波長(zhǎng)色譜圖

A：30 ℃，B：35 ℃，C：40 ℃圖4 百藥煎不同檢測(cè)柱溫色譜圖

2.5方法學(xué)考察

圖5 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖6 鞣花酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.5.1線性關(guān)系考察 取對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣2、4、6、8、10uL，以峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量(ug)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，Y沒(méi)食子酸=1337951.72X+613105(R2=0.9997)，Y鞣花酸=5240147.49X-1416(0.9994)。結(jié)果表明沒(méi)食子酸和鞣花酸分別在1.6072～8.0360ug，0.0339～0.1695ug呈良好線性，見圖5，圖6。2.5.2精密度實(shí)驗(yàn) 取20150129百藥煎粉末(過(guò)四號(hào)篩)約0.2g，精密稱定，按2.3.項(xiàng)下供試品溶液的制備方法操作，進(jìn)樣量10μL，連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄沒(méi)食子酸、鞣花酸峰面積，以沒(méi)食子酸、鞣花酸峰面積計(jì)算，測(cè)定值的RSD分別為3.41%，1.11%，表明系統(tǒng)的精密度較好。

2.5.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取20150129百藥煎粉末(過(guò)四號(hào)篩)約0.2g，精密稱定，按2.3.項(xiàng)下供試品溶液的制備方法操作，分別在0h、2h、4h、8h、12h檢測(cè)，記錄沒(méi)食子酸、鞣花酸峰面積，以沒(méi)食子酸、鞣花酸峰面積計(jì)算，測(cè)定值的RSD分別為 0.28%，0.33%，表明樣品在12h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取20150129百藥煎粉末(過(guò)四號(hào)篩)5份，每份約0.2g，精密稱定，按2.3.項(xiàng)下供試品溶液的制備方法操作，分別進(jìn)樣10μL，記錄沒(méi)食子酸、鞣花酸峰面積，以沒(méi)食子酸、鞣花酸峰面積計(jì)算，測(cè)定值的RSD分別為 1.09%，2.02%，表明方法重復(fù)性良好。

2.5.5 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的百藥煎樣品(20150129)粉末5份，加入一定量的沒(méi)食子酸和鞣花酸對(duì)照品，測(cè)定并計(jì)算回收率，結(jié)果見表2，表3。

表2 沒(méi)食子酸加樣回收率(n=6)

表3 鞣花酸加樣回收率(n=6)

2.6 含量測(cè)定 稱取3份五倍子樣品和6批次百藥煎樣品，按2.3項(xiàng)下制備下列批次的待測(cè)樣品溶液，進(jìn)樣量為10 μL，分別注入高效液相色譜儀，測(cè)定色譜峰峰面積，對(duì)照品溶液和百藥煎供試品的HPLC色譜圖，見圖7。結(jié)果見表4。

1：沒(méi)食子酸 2：鞣花酸；圖A：沒(méi)食子酸標(biāo)品圖，B：鞣花酸標(biāo)品圖，C：百藥煎樣品圖圖7 百藥煎標(biāo)準(zhǔn)品及樣品HPLC

樣品批號(hào)沒(méi)食子酸/%平均值/%鞣花酸/%平均值/%五倍子20130812-13.884.023.950.250.240.2520130812-23.673.923.800.230.240.2420130812-34.114.054.080.250.260.26百藥煎20141203-z13.7813.8213.800.250.250.2520141219-z14.0814.1214.100.260.260.2620150129-z14.0714.0314.050.260.260.2620150324-z14.5514.6014.580.260.260.2620150731-z14.1614.2214.190.260.260.2620150301-q31.3731.9831.680.180.190.19

3 討論

3.1

本文建立同時(shí)測(cè)定百藥煎中沒(méi)食子酸及鞣花酸含量的方法，比較了不同提取方法工藝條件以及不同檢測(cè)波長(zhǎng)、不同檢測(cè)柱溫、不同梯度洗脫比例對(duì)沒(méi)食子酸及鞣花酸含量的影響。與文獻(xiàn)報(bào)道[8]的同時(shí)測(cè)定五倍子中沒(méi)食子酸及鞣花酸含量的方法對(duì)比，本文所建立方法同時(shí)測(cè)定五倍子發(fā)酵前后沒(méi)食子酸及鞣花酸含量，比較發(fā)酵前后成分含量變化，對(duì)于五倍子發(fā)酵過(guò)程的控制具有一定指導(dǎo)意義。五倍子中鞣質(zhì)含量高達(dá)60%～80%[12]，發(fā)酵后鞣質(zhì)的水解產(chǎn)物包括沒(méi)食子酸和鞣花酸。本次測(cè)定結(jié)果證明五倍子沒(méi)食子酸含量為3.94%，實(shí)驗(yàn)室發(fā)酵炮制百藥煎含量為14.20%，增加3.6倍；五倍子鞣花酸含量為0.25%，發(fā)酵制成百藥煎后含量為0.26%，含量稍有增加?？紤]五倍子發(fā)酵炮制百藥煎的過(guò)程中加入了茶葉、茶汁及釀酒曲，質(zhì)量增加40%，因此，計(jì)算得沒(méi)食子酸含量實(shí)際增加5.04倍，鞣花酸含量實(shí)際增加量為0.11%。說(shuō)明發(fā)酵過(guò)程中五倍子鞣質(zhì)水解，部分生成沒(méi)食子酸及鞣花酸。

3.2

有文獻(xiàn)報(bào)道，鞣花酸具有抗癌、抗突變性能，對(duì)人體免疫缺陷病毒的抑制作用抗氧化作用，具有凝血功能[5]，對(duì)多種細(xì)菌、病毒都有很好的抑制作用[13]，有降壓、鎮(zhèn)靜作用[14]。本研究對(duì)生產(chǎn)企業(yè)提供的百藥煎進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)與本實(shí)驗(yàn)室制備的百藥煎不同，沒(méi)食子酸含量增加8倍，鞣花酸含量降低0.07%，說(shuō)明發(fā)酵時(shí)間、菌種、發(fā)酵程度的控制等工藝條件對(duì)五倍子發(fā)酵炮制的百藥煎成分的種類與含量均有顯著影響。因此，五倍子發(fā)酵炮制百藥煎的轉(zhuǎn)化是將鞣質(zhì)全部或者盡可能多地轉(zhuǎn)化成為沒(méi)食子酸，還是保留一部分中間成分，尚需要進(jìn)一步通過(guò)藥理功效甚至是中藥臨床功效的進(jìn)一步驗(yàn)證研究。其處方、工藝條件尤其是發(fā)酵程度的控制也需要進(jìn)一步研究。

[1] 元·朱震亨著.丹溪心法.上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1963：96.

[2] 江蘇新醫(yī)學(xué)院編.中藥大辭典[Z]，上海人民出版社，1977：865.

[3] 禹玉洪，韓小敏，張建麗，等.百藥煎發(fā)酵炮制的酒曲篩選研究[C].第十七屆全國(guó)色譜學(xué)術(shù)報(bào)告會(huì)及儀器展覽會(huì)會(huì)議論文集，2009：1039-1040.

[4] 禹玉洪，韓小敏，張建麗，等.百藥煎發(fā)酵過(guò)程中關(guān)鍵菌株的確定[C].全國(guó)中藥創(chuàng)新與研究論壇·論文集，2009：123-127.

[5] 李素琴，袁其朋，徐健梅.鞣花酸的生理功能及工藝開發(fā)研究現(xiàn)狀[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2001，13(5)：71.

[6] 胡昌江，楊斂芳，瞿燕.改良百藥煎的主要藥效學(xué)研究[J].陜西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2001，24(3)：44-45.

[7] 彭璐，龔千鋒，李小寧，等.RP-HPLC測(cè)定五倍子3個(gè)炮制品中沒(méi)食子酸和鞣花酸的含量[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2015，21(18)：76-79.

[8] 盛達(dá)成，陳凌，王文茂，等.高效液相色譜法同時(shí)分析五倍子提取物中的沒(méi)食子酸和鞣花酸[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2013，29(04)：148-154.

[9] 丁楠，高曉黎.HPLC法測(cè)定石榴皮提取物中鞣花酸的含量[J].新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，35(6)：770-772.

[10] 張目，朱少娟，嚴(yán)澤民，等.HPLC測(cè)定地榆中沒(méi)食子酸和鞣花酸的含量[J].現(xiàn)代科學(xué)儀器，2009，5：69-70.

[11] 張海偉，張藝，楊繼家，等.HPLC測(cè)定不同批次藏藥三果湯中沒(méi)食子酸和鞣花酸的含量[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2013，19(10)：95-97.

[12] 喬彩云，李建科.五倍子及五倍子單寧的研究進(jìn)展[J].食品工業(yè)科技，2011，32(7)：458-462.

[13] Haramo Tet al.Chem.Pharm.Bull.，1988，36(6).

[14] Gordon M H，and Jing An.J.Agric.Food Chem.，1995，43：1784-1788.

DeterminationofGallicAcidandEllagicAcidinGallnutFermentedChineseGallLeavenbyHPLC

WANGRuisheng，ZHANGZhenling*，WANGShengchao，LIKeke，SUNYifei

(HenanUniversityofChineseMedicine，Zhengzhou450008，China)

Objective：To determine the gallic acid and ellagic acid in the gallnut fermented Chinese gall leaven by HPLC and compare the content of different batches.Methods：The separation was performed on the Waters Symmmetry ShieldTMRP18(4.6×250mm，5μm) C18column，and acetonitrile-0.1% trifluoroacetic acid aqueous in gradient as mobile phase，the flow rate was1.0mL·min-1，and the detecting wavelength was set at254nm，the column temperature was kept at35℃.Results：The average content of gallic acid and ellagic acid in Chinese gall were3.94% and0.25%，respectively，and in Chinese gall leaven were14.20%，0.26%，respectively.Conclusion：The established method is suitable for the determination of gallic acid and ellagicacid in the gallnut fermented Chinese gall leaven.The results provide a basis for medicinal value research and product development of gallnut fermented Chinese gall leaven.

Chinese gall leaven；gallic acid；ellagic acid；determination

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.7.007

2016-01-30)

六神曲等7種中藥發(fā)酵技術(shù)及規(guī)范化應(yīng)用研究--百藥煎(201507004-03)；呼吸疾病診療與新藥研發(fā)河南省協(xié)同創(chuàng)新中心-研究生科研創(chuàng)新基金項(xiàng)目(20140013)

*

張振凌，博士生導(dǎo)師;研究反向：中藥飲片及新藥研究；Tel：(0371)65680970，E-mail：zhangzl6758@163.com