孫靜，王集會

(1.山東中醫(yī)藥大學 藥學院，山東 濟南 250355；2.山東中醫(yī)藥大學 實驗中心，山東 濟南 250355)

全蝎三種產(chǎn)地加工方法的對比研究△

孫靜1，王集會2*

(1.山東中醫(yī)藥大學 藥學院，山東 濟南250355；2.山東中醫(yī)藥大學 實驗中心，山東 濟南250355)

目的：比較三種產(chǎn)地加工全蝎粉的含水量、含鹽量、醇提取物含量、蛋白質(zhì)含量、平衡吸濕量以及牛磺酸含量的不同，找出最適合的產(chǎn)地加工方法。方法：用快速水分測定儀測定含水量；用滴定法測定全蝎粉含鹽量；用lowry法測定蛋白質(zhì)含量；用重量法測定醇提取物含量；用平衡吸濕曲線測定臨界相對溫度(CRH)值；用高效液相外標一點法測牛磺酸含量。結(jié)果：比較三種產(chǎn)地加工方法在各種指標上的差異性，結(jié)果顯示，常溫風干蝎和冷凍干燥蝎之間差異較小，而高溫鹽蝎與前兩者之間有顯著差異。結(jié)論：全蝎冷凍干燥和常溫風干可作為產(chǎn)地加工方法。

全蝎粉；產(chǎn)地加工方法；蛋白質(zhì)；臨界相對溫度；?；撬?/p>

全蝎是我國傳統(tǒng)的中藥材，具有息風鎮(zhèn)痙、通絡(luò)止痛、攻毒散結(jié)等功能?，F(xiàn)代研究表明，鮮全蝎含有蝎毒、?；撬?、軟硬脂酸等蛋白質(zhì)及非蛋白質(zhì)成分[2]。其中蝎毒素為可溶性蛋白，是一種含碳、氫、氧、氮、硫等元素的毒性蛋白。全蝎的醇提取物及蝎毒粗毒是抗癌的主要活性成分[3]，現(xiàn)已成為治療多種疑難病的臨床藥物。

產(chǎn)地加工是影響全蝎藥材質(zhì)量的重要因素。鹽水煮沸風干、淡水煮沸風干使可溶性蛋白等有效成分喪失，為此我們嘗試將野生活蝎捕捉后快速清水漂洗，除去泥沙，-18 ℃直接冷凍凍死，粉碎，自然風干和冷凍干燥。為了考察不同產(chǎn)地加工方法全蝎粉的質(zhì)量，我們選擇含水量、含鹽量、醇提取物含量、蛋白質(zhì)含量、平衡吸濕量以及?；撬岷康戎笜诉M行分析研究，擬找出全蝎最佳產(chǎn)地加工方法。

1 材料與儀器

1.1材料

氯化鈉、鉻酸鉀指示劑、硝酸銀溶液、乙醇、硫酸溶液、Lorry試劑、福林酚試劑(國藥集團，分析純)；正己烷、冰醋酸(天津市科密歐化學試劑有限公司，色譜純)；乙腈(上海星可高純?nèi)軇┯邢薰荆V純)；三乙胺(天津市化學試劑一廠，分析純)；?；撬?中國食品藥品檢定研究院)。

野生全蝎購自山東臨沂，均為野生活蝎，選擇成年蝎，剔除幼蝎，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學生藥系鑒定為鉗蝎科東亞鉗蝎ButhusmartensiiKarsch。高溫鹽蝎按《中華人民共和國藥典》一部制取，自然風干粉按參考文獻[4]進行加工，凍干粉自制。

1.2儀器

冠亞牌SPF系列快速鹵素水分測定儀(深圳市冠亞電子科技有限公司)；FA1004N型電子分析天平(上海精密儀器有限公司)；KQ-500E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；智能編程層析柜(上海嘉鵬科技有限公司)；SKB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵disb-zc(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；四環(huán)凍干機LGJ-18A(北京四環(huán)科學儀器廠有限公司)；LC-10ATVP(日本島津公司)；MettlerAE240電子天平(瑞士梅特勒公司)。

2 方法

2.1全蝎凍干粉加工方法

取野生全蝎，清水漂洗，去凈泥沙，凍結(jié)，打碎成漿，預(yù)冷凍。將預(yù)冷凍好的全蝎粉放入冷凍干燥機中，冷阱溫度為-60℃，真空度為1Pa，物料溫度為25℃，環(huán)境溫度25℃，冷凍干燥24h即得。

2.2含水量的測定

取3種全蝎粉各0.5g，平鋪于快速水分測定儀的托盤上，按儀器使用說明測定。

2.3含鹽量的測定

2.3.1 供試液制備 取3種全蝎粉各5g，精密稱定，放在三角燒杯中，加水90mL，浸泡30min，超聲波震蕩10min，加熱至微沸30min，過濾，濾液備用。濾渣加水70mL，泡20min，微沸20min，過濾，濾渣再加水50mL，微沸20min，沖洗濾渣，濾液并用，定容至250mL量瓶中備用[4]。

2.3.2 供試液滴定 分別取3種供試液各25mL，滴加1mL鉻酸鉀指示劑，充分混勻后，用硝酸銀滴定液(0.100 0mol·L-1)滴定至溶液出現(xiàn)磚紅色，用硝酸銀的消耗量推算出氯化鈉含量。

2.4醇提取物的測定

稱定供試品約2～4g(精密稱定)，置250mL錐形瓶中，精密加20%的乙醇100mL，密塞，稱定質(zhì)量，靜置1h。連接回流冷凝管，加熱沸騰，保持微沸1h，冷卻至室溫。取錐形瓶密塞稱質(zhì)量，用水補足減失的重量，搖勻，用干燥濾器濾過，精密量取濾液25mL，置干燥后的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，于105 ℃干燥3h，干燥器中冷卻30min，迅速精密測定醇提物質(zhì)量[5]。

2.5蛋白質(zhì)含量的測定

牛血清蛋白的標準曲線的測定[6]：標準曲線方程為Y=2.141 3X+0.007 1[Y為吸光度，X為蛋白質(zhì)濃度(mg·mL-1)]，相關(guān)系數(shù)r=0.999 0，線性關(guān)系良好。

取3種粉末各0.5 g于小錐形瓶中，加入20 mL水超聲30 min，分離上清液后，再加入20 mL水超聲30 min，抽濾后，將3種溶液定容到100 mL，離心，取1 mL用Lowry法測定蛋白質(zhì)含量。

2.6平衡吸濕量的測定

取各種樣品供試品分別置于7～9個不同相對濕度的密閉干燥器中，相對濕度為10%～100%，即得各相對濕度下的平衡吸濕量。以吸濕率為縱坐標，相對濕度為橫坐標作圖，得吸濕曲線。將吸濕曲線陡直部分延長與橫坐標相交，即為樣品CRH。

2.7?；撬岷繙y定

2.7.1 衍生化試劑制備 精密量取0.3mLPITC，置于25mL棕色量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，濃度為0.1mol·L-1，搖勻，4 ℃保存，作為PITC的乙腈溶液；精密量取14mL三乙胺，置于100mL棕色量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，濃度為1mol·L-1，搖勻，作為三乙胺的乙腈溶液[7]。

2.7.2 對照品溶液制備 精密稱取牛磺酸對照品10.43mg，用蒸餾水溶解并定容至25mL，制成質(zhì)量濃度為0.417 7mg·mL-1的對照品溶液A。

2.7.3 樣品溶液的制備 精密稱取3種全蝎粉末各0.5g，按最佳超聲提取工藝提取，定容至100mL。

2.7.4 衍生化步驟 精密吸取待分析溶液5mL于25mL棕色量瓶中，精密加入0.1mol·L-1PITC的乙腈溶液2.5mL，1mol·L-1三乙胺的乙腈溶液2.5mL，搖勻，室溫放置1h后，加50%的乙腈稀釋至刻度，搖勻。精密移取5mL，加入5mL正己烷，振搖后放置10min，取下層溶液，用微孔濾膜(0.45μm)過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.7.5 色譜條件AgilentZORBAXSB-C18色譜柱(150mm×4.6mm，5μm)以0.07mol·L-1醋酸-醋酸鈉緩沖液-2.5%乙腈(pH=6.5)為流動相A，以乙腈-甲醇-水(40∶15∶45)為流動相B,進行梯度洗脫：0～15min96.5%→89%A，15～30min89%→0%A，30～45min0%A；檢測波長為254nm；流速為1.0mL·min-1；進樣量為5μL。用外標一點法測定?；撬岷俊?/p>

2.7.6 線性關(guān)系考察 分別精密吸取上述對照品溶液(質(zhì)量濃度為0.417 7mg·mL-1)，用水稀釋成6個不同濃度的對照品稀釋液，按上述方法進行衍生化，并按上述色譜條件測定峰面積，以?；撬釋φ掌愤M樣量(μg)為橫坐標X，峰面積值為縱坐標Y，以最小二乘法計算回歸方程。

2.7.7 精密度試驗 取上述對照品溶液進行衍生化，并測定峰面積，連續(xù)進樣5次。

2.7.8 重復(fù)性試驗 分別稱取3種樣品各3份，精密稱定，按最佳超聲提取工藝提取并進行衍生化，按上述色譜條件測峰面積，計算樣品中?；撬崞骄俊?/p>

2.7.9 加樣回收率試驗 稱取已知?；撬岷康臉悠?份，每份0.104 9 g，置具塞錐形瓶中，分別精密加入?；撬釋φ掌啡芤?質(zhì)量濃度為0.412 8 mg·mL-1)1.0 mL，水19 mL，密塞，稱定質(zhì)量。按最佳超聲工藝超聲處理，制備樣品溶液，進行色譜分析，計算回收率。

3 結(jié)果

3.1含鹽量、含水量、醇溶物含量及蛋白質(zhì)含量

見表1。

表1 3種全蝎粉含鹽量、含水量、醇溶物含量及CRH數(shù)值

注：*、**表示單因素方差分析各組之間差異有統(tǒng)計學意義，P<0.01。

3.2三種全蝎粉的CRH

見圖1。

注：A.高溫鹽蝎；B.常溫風干蝎；C.冷凍干燥蝎。圖1 3種全蝎粉相對濕度

3.3高效液相色譜圖

見圖2。

注：A.?；撬針藴势?；B.冷凍干燥蝎；C.高溫鹽蝎；D.常溫風干蝎；E.陰性對照。圖2 3種全蝎粉、牛磺酸標準品陰性對照品的?；撬岣咝嗌V

3.4標準曲線方程及線性范圍

標準方程為Y=1273400X+62009，r=0.9991。在0.08354～0.4177μg進樣量與峰面積之間呈良好的線性關(guān)系。

3.5精密度試驗

取標準品5份，與試驗組用相同衍生法處理后，用高效液相法測定?；撬岱迕娣e，峰面積平均值為1387200.093，RSD為1.84%，表明本方法精密度良好。

3.6加樣回收率試驗

見表2。

表2 3種全蝎粉的加樣回收率

3.7三種樣品牛酸含量

見表3。

表3 3種全蝎粉的磺酸含量

3.8重復(fù)性試驗

稱取全蝎粉樣品3份，精密稱定，按最佳超聲提取工藝提取并進行衍生化，按上述色譜條件測峰面積，計算出樣品中?；撬崞骄繛?21.9mg·g-1，經(jīng)計算RSD為3.2%，表明該方法重復(fù)性良好。

4 討論

4.1含鹽量

高溫鹽蝎的含鹽量是其他兩種加工方法的20倍，據(jù)報道有些品種全蝎藥材的含鹽量可達到100%～300%，而目前《中華人民共和國藥典》2010版也未對全蝎藥材的含鹽量作出明確的限定。含鹽量過高使全蝎藥材的實際用藥量下降，既不利于準確用藥，也不利于判斷藥材質(zhì)量的優(yōu)劣。

4.2醇提取物含量

實驗中用20%的乙醇做溶劑，提取出來的物質(zhì)主要是水溶性的成分。高溫鹽蝎中含有大量的鹽，所以其醇提取物含量較高，可能是鹽的因素。

4.3蛋白質(zhì)含量

高溫鹽蝎加工時會使蛋白質(zhì)流失，使蝎子粉中有效成分降低。

4.4CRH

全蝎中既有水不溶性的動物纖維,又有水溶性的蛋白質(zhì)、酸性黏多糖等成分，因此為兩性混合物。高溫鹽蝎由于含有大量的鹽分，CRH值較小，大約在50%左右。冷凍干燥蝎由于干燥方式的原因，藥材的形態(tài)較疏松，水分已進入藥粉內(nèi)部，所以也易吸潮。自然風干的全蝎粉較密實，較不易吸濕，所以，根據(jù)三者的CRH，高溫鹽蝎和冷凍干燥蝎在儲藏中尤其應(yīng)注意密閉低溫保存。

4.5?；撬岷?/p>

實驗中的HPLC圖有兩個較大的峰，一個是?；撬?，峰在25min左右；另一個是衍生化試劑PITC的峰，在38min左右。通過計算得出，冷凍干燥蝎牛磺酸含量最高，為111.10mg·g-1，其次為風干蝎，含量為82.96mg·g-1，最低為高溫鹽蝎，含量為39.12mg·g-1。這可能是因為高溫鹽蝎在產(chǎn)地加工過程中隨煮沸水的棄去而流失，所以冷凍干燥是最有利于保存牛磺酸的制作工藝。

由以上討論可知，沸水煮全蝎并不是最適宜的產(chǎn)地加工方式，將捕捉到的野生全蝎直接凍死后粉碎成粉，冷凍干燥或直接自然風干能最大限度地保留全蝎的蛋白質(zhì)和牛磺酸等活性成分，更有利于保護全蝎的藥用價值。

[1] 陳秀敏.全蝎不良反應(yīng)分析[J].時珍國醫(yī)國藥，2003，14(10)：635.

[2] 王燕平，呂欣然.東亞鉗蝎蝎毒分離純化及藥理作用的研究進展[J].中草藥，2000，31(1)：59-61.

[3] 張紅梅，劉巖峰，張景海.蝎及蝎毒抗腫瘤作用研究進展[J].沈陽藥科大學學報，2006，23(6)：401.

[4] 王集會，曲仕明，高世杰.全蝎兩種產(chǎn)地加工方法的對比研究[J].山東中醫(yī)雜志，2009，28(2):131-132.

[5] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社,2010.

[6] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：二部[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社,2010.

[7] 蒲秋易，張一竹，張二云，等.柱前衍生化高效液相色譜法測定全蝎中游離牛磺酸的含量[J].中國新藥雜志，2013(02):230-234.

ComparativeStudyofThreeHabitat-processingMethodforButhusmartensiiKarsch

SUNJing1，WANGJihui2*

(1.ShandongUniversityofTraditionalChineseMedicineofPharmacy,Jinan250355,China；2.ShandongUniversityofTraditionalChineseMedicineofexperimentcenter,Jinan250355,China)

Objective：Three habitat-processing method for Buthus martensii Karsch were compared with each other in the aspects of water，salt，protein，taurine concentration，alcohol extracts and CRH.Methods：The water concentration was measured with the rapid moisture check device,the salt with titrametric analysis，the protein with Lowry method，the alcohol extracts’ with gravimetric method，the CRH value with the balance curve line of the moisture absorption，the taurine with external standard one point method and HPLC.Results：By comparing the difference between the various indicators in every index，the lyophilization and the air dry have little difference，but the high temperature has much significance difference.Conclusion：The lyophilization and nature drying are availiable ways of the three habitat-processing methed for B. martensii.

Buthus martensii Karsch；habitat-processing method；protein；CRH； taurine

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.7.022

2015-04-21)

山東中醫(yī)藥大學大學生研究訓練(SRT)計劃資助項目(201310441026)；山東省科技發(fā)展計劃項目(2013GSF11908)

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王集會，副教授，研究方向：蟲類中藥發(fā)酵及活性成分研究;E-mail：wangjihui10@126.com