宋海龍，趙鈺澤，王彩霞,2,周 祁，劉衛(wèi)群,

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院，河南 鄭州450002； 2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，河南 鄭州 450002；3.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南 鄭州 450002)

含1,3,4-噻二唑硫脲類(lèi)新型化合物的合成及對(duì)植物病害抗性的分析

宋海龍1，趙鈺澤3，王彩霞1,2,周 祁3，劉衛(wèi)群1,3

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院，河南 鄭州450002； 2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，河南 鄭州 450002；3.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南 鄭州 450002)

為了得到高性能的抗植物原害化合物，以氨基硫脲為起始原料，經(jīng)環(huán)化、烷基化，得中間產(chǎn)物5-S-烴基-2-氨基-1，3，4-噻二唑，然后和4-三氟甲基異硫氰酸苯酯反應(yīng)，合成了2種新化合物(4a，4b)，其化學(xué)結(jié)構(gòu)表征通過(guò)紅外光譜(IR)，核磁共振氫譜(1H-NMR)和核磁共振碳譜(13C-NMR )的檢驗(yàn)符合4a，4b分子表征，采用高分辨質(zhì)譜(HRMS)分析了4a，4b的相對(duì)分子質(zhì)量，與計(jì)算值基本相等，表明4a，4b化合物完全與設(shè)計(jì)的分子結(jié)構(gòu)一致?？咕鷻z驗(yàn)結(jié)果表明，在200 mg·L-1及100 mg·L-1質(zhì)量濃度下，化合物4a，4b對(duì)新月彎孢菌、棉枯萎鐮刀菌、煙草黑脛菌和禾谷鐮孢菌的抑制率均高于對(duì)照藥劑三唑酮；對(duì)煙草花葉病毒(TMV)抗性測(cè)試結(jié)果顯示，在500 mg·L-1質(zhì)量濃度下，化合物4b對(duì)TMV預(yù)防抑制率達(dá)到78.38%，比寧南霉素提高25.44%。

硫脲類(lèi)化合物；煙草；合成；生物活性

在植物真菌病害、細(xì)菌病害和病毒病害中，病原真菌引起的約占病害總數(shù)的70%～80%，每年因真菌病害引起的作物產(chǎn)量損失很大[1]。盡管不斷有新的抗菌劑研制出來(lái)，但易抗藥性使得新藥的研制仍是一項(xiàng)十分重要的任務(wù)?！安《静『Α庇兄参锇┌Y之稱(chēng)，幾乎每種農(nóng)作物都受到一種或多種病毒病的危害，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來(lái)巨大的威脅。其中，煙草花葉病毒(TMV)是一種典型的花葉病毒，可侵染38科268種植物。據(jù)估計(jì)，僅煙草花葉病毒引起的花葉病每年全世界損失達(dá)l億美元以上[2]。目前，已經(jīng)商品化的抗煙草花葉病毒藥劑如病毒必克、植病靈、井岡霉索A、寧南霉素等的大田防效在30%～60%,不能有效抑制植物病毒所造成的危害，而且有的藥劑(如病毒唑)還有藥害。這就使得創(chuàng)制高效、低毒、高選擇性、環(huán)境相容性好的抗植物病毒治療劑成為當(dāng)務(wù)之急。硫脲類(lèi)衍生物在新農(nóng)藥研究、開(kāi)發(fā)和商業(yè)化中顯示了十分重要的作用。到目前為止,國(guó)外的一些藥物公司相繼成功地開(kāi)發(fā)了數(shù)十個(gè)硫脲類(lèi)的農(nóng)藥新品種，如作為殺菌劑的代菌靈、殺蟲(chóng)劑的螟蛉畏、殺螨劑的殺螨隆、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的呋苯硫脲、殺鼠劑安妥等。在近十幾年的農(nóng)藥或醫(yī)藥領(lǐng)域內(nèi),大量文獻(xiàn)進(jìn)一步報(bào)道了硫脲類(lèi)化合物具有殺菌[3-4]、殺蟲(chóng)、除草[5-6]、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)[7-8]和抗癌[9-11]等廣泛的生物活性。另外，硫脲類(lèi)化合物還有抗病毒作用。德國(guó)SCHUSTER等于1991年首次將硫脲類(lèi)化合物用于植物病毒的研究，發(fā)現(xiàn)烯丙基硫脲衍生物對(duì)TMV，CMV有抑制作用[12]。 1,3,4-噻二唑衍生物因同樣具有廣泛生物活性[13-16]，在雜環(huán)農(nóng)藥中扮演著重要的角色，例如，殺菌劑中防治水稻白葉枯病的葉青雙，作為除草劑的氟他胺都含有噻二唑環(huán)。日本的NOGUCHI等[17]最早報(bào)道了噻二唑衍生物還具有抗植物病毒活性。為了得到高活性的抗菌和抗病毒試劑,本研究利用生物等排原理和活性拼合等藥物設(shè)計(jì)基本原理,將用硫醚基團(tuán)修飾的1,3,4-噻二唑環(huán)和硫脲基團(tuán)進(jìn)行活性拼接，以氨基硫脲為起始原料，經(jīng)環(huán)化、烷基化，得中間產(chǎn)物5-S-烴基-2-氨基-1，3，4-噻二唑，然后和4-三氟甲基異硫氰酸苯酯反應(yīng)，合成2種新的化合物N-(4-三氟甲基)苯基-N′-(5-S-烴基-1，3，4-噻二唑-2-基)硫脲,并對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，對(duì)其抗菌及抗病毒活性進(jìn)行了測(cè)定。

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1 供試植物病原真菌 新月彎孢菌(Curvularialunata)、棉花枯萎病菌(Cottonfusarium)、煙草黑脛菌(Phytophthoraparasiticavar.nicotianae)、禾谷鐮孢菌(Fusariumgraminearum)，由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)植保學(xué)院提供。

1.1.2 供試植物與供試病毒 煙草花葉病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)枯斑寄主為珊西煙(Nicotianatabacumcv.xanthinc)，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所提供；煙草花葉病毒(TMV)由貴州大學(xué)提供。

1.1.3 儀器與試劑 X-5數(shù)字顯示顯微熔點(diǎn)儀(北京泰克儀器有限公司，溫度未校正；Q-Tof MicroTM 高分辨質(zhì)譜儀；TENSOR 27傅立葉紅外光譜儀(德國(guó)Bruker)；BRUCKER 300M核磁共振儀(德國(guó)，TMS為內(nèi)標(biāo))；CL-2型恒溫加熱磁力攪拌器(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)。

2%寧南霉素(廣州穗澤環(huán)?？萍加邢薰?；三唑酮(江蘇農(nóng)禾農(nóng)業(yè)科技有限公司)；氨基硫脲，CS2,1-氯丁烷，1-溴己烷(上海諾泰化工有限公司)；N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，乙腈(上海海曲化工有限公司)；所用試劑均為市售分析純或化學(xué)純。

1.2試驗(yàn)方法

目標(biāo)化合物N-(4-三氟甲基)苯基-N′-[5-S-烴基-1,3,4-噻二唑-2-基]硫脲的合成路線(xiàn)見(jiàn)圖1。

2-氨基-5-S-烴基-1,3,4-噻二唑衍生物參看文獻(xiàn)[18]合成。

在50 mL圓底燒瓶中加入0.2 g(1.0 mmol)三氟甲基異硫氰酸苯酯，用1.5 mL DMF溶解后，再加入0.28 g(1.3 mmol)1,3,4-噻二唑衍生物和1.5 mL乙腈,加熱回流10 h后停止反應(yīng)(用TLC跟蹤)。反應(yīng)后，加水冷卻，有固體析出，用DMF和無(wú)水乙醇混合液重結(jié)晶(圖1)。

圖1 目標(biāo)化合物的合成路線(xiàn)Fig.1 Synthetic route of target compounds

新合成化合物的物理特性及結(jié)構(gòu)特征如下:

N-(4-三氟甲基)苯基-N′-[5-S-正丁基-1,3,4-噻二唑-2-基]硫脲 (4a):白色固體粉末,產(chǎn)率 78.5%,m.p.187.5～188.8 ℃.IR cm-1:3207 (N-H),1331 (C═S),1538,1490,1400,1255,1047,850 (噻二唑環(huán)),657 (C-S-C);1H-NMR (400 MHz,DMSO-d6) δ:0.91 (t,J = 8.0 Hz,3H,CH3),1.38～1.47 (m,2H,CH2),1.65～1.72 (m,2H,CH2),3.23 (t,J = 8.0 Hz,2H,SCH2),7.67 (d,J = 8.0 Hz,2H,ArH),7.96 (d,J = 8.0 Hz,2H,ArH),10.82 (s,H,NH),14.59 (br,1H,NH)；13C-NMR (100 MHz,DMSO-d6) δ:13.37 (CH3),21.11 (CH2),30.96 (CH2),32.88 (SCH2),121.61 (CF3),124.38 (CH),126.57 (CH),128.61 (C-CF3),138.96 (C-N),155.82,160.31 (噻二唑環(huán),C2,C5),181.57 (C═S); HRMS(ESI):C14H15F3N4S3m/z [M+H]+calcd.393.0489,found 393.0485.N-(4-三氟甲基)苯基)-N′-[5-S-正己基-1,3,4-噻二唑-2-基]硫脲 (4b):黃色固體粉末,產(chǎn)率 72.4%,m.p.：222.5～223.7 ℃.IR cm-1:3328 (N-H),1330 (C═S),1538,1491,1398,1256,1068,843 (噻二唑環(huán)),658 (C-S-C);1H-NMR (400 MHz,DMSO-d6) δ：0.87 (t,J = 8.0 Hz,3H,CH3),1.28～1.42 (m,6H,CH2),1.66～1.73 (m,2H,CH2),3.22(t,J = 8.0 Hz,2H,SCH2),7.66 (d,J = 8.0 Hz,2H,ArH),7.96 (d,J = 8.0 Hz,2H,ArH),10.81 (s,H,NH),14.65 (br.,1H,NH) ;13C-NMR (100 MHz,DMSO-d6) δ:13.82 (CH3),21.92 (CH2),27.56 (CH2),28.84 (CH2),30.61 (CH2),32.79 (SCH2),121.73 (CF3),123.02 (CH),125.54 (CH),125.72 (C-CF3),143.15 (C-N),154.37,162.51 (噻二唑環(huán),C2,C5),181.57 (C═S); HRMS(ESI):C16H19F3N4S3m/z [M+H]+:calcd.421.0802,found 421.0796.

1.3毒力測(cè)定

根據(jù)二倍稀釋法，將供試藥品設(shè)定為200，100，50，25，12.5 mg·L-15個(gè)質(zhì)量濃度，藥品的制備在無(wú)菌條件下進(jìn)行；以新月彎孢菌(Curvularialunata)、棉花枯萎病菌(CottonfusariumWilt)、煙草黑脛菌(Phytophthoraparasiticavar.nicotianae)、禾谷鐮孢菌(Fusariumgraminearum)為研究對(duì)象。按照生長(zhǎng)速率法[19]，將一定質(zhì)量濃度的藥品分別取3.0 mL加入到滅菌后的含27.0 mL PDA培養(yǎng)基的錐形瓶中，搖勻后倒入3個(gè)直徑90 mm的培養(yǎng)皿中，即設(shè)定3個(gè)重復(fù)，待其冷卻凝固；同時(shí)用不含藥品的培養(yǎng)基做對(duì)照。在已經(jīng)生長(zhǎng)好的待測(cè)菌種上取直徑6.5 mm的菌餅放到培養(yǎng)皿中央位置，在(28±1)℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，計(jì)算抑制率。然后以抑制率對(duì)應(yīng)的概率值為y，相對(duì)應(yīng)的化合物質(zhì)量濃度的對(duì)數(shù)值為x，通過(guò)SPSS 19做線(xiàn)性回歸，建立毒力回歸方程y=ax+b，并計(jì)算相關(guān)系數(shù)r和有效抑制中濃度EC50。

1.4煙草花葉病防治試驗(yàn)

在25 ℃防蟲(chóng)溫室內(nèi)，采取盆栽形式，以枯斑寄主半葉法[20]，選取長(zhǎng)勢(shì)一致的珊西煙為對(duì)象進(jìn)行藥劑生物活性測(cè)定試驗(yàn)。

1.4.1 預(yù)防試驗(yàn) 移栽后，挑選長(zhǎng)勢(shì)一致，具有6～7片真葉的珊西煙，對(duì)其進(jìn)行噴藥處理，24 h后，用常規(guī)汁液摩擦法接種TMV病毒液，以清水處理作為對(duì)照組，每個(gè)處理設(shè)置3次重復(fù)，觀察發(fā)病情況，及時(shí)記錄發(fā)病枯斑數(shù)，計(jì)算枯斑抑制率。

1.4.2 治療試驗(yàn) 移栽后，挑選長(zhǎng)勢(shì)一致，具有6～7片真葉的珊西煙，采用常規(guī)汁液接種法接種TMV病毒液，12 h后，對(duì)各處理噴藥，以接種后噴施清水的處理作為對(duì)照組，每個(gè)處理設(shè)置3次重復(fù)，觀察發(fā)病狀況，及時(shí)記錄發(fā)病枯斑數(shù)，計(jì)算枯斑抑制率。

2 結(jié)果與分析

2.1目標(biāo)化合物合成條件的篩選

由于反應(yīng)物質(zhì)在不同的溶劑條件下，達(dá)到的沸點(diǎn)不同，且產(chǎn)物的得率與沸騰后的回流時(shí)間有關(guān)，因此，選用N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、乙腈、乙醇及N,N-二甲基甲酰胺(DMF)和乙腈等比例混合溶劑進(jìn)行篩選合成溶劑。結(jié)果顯示，選用N,N-二甲基甲酰胺(DMF)做溶劑，沸點(diǎn)高，回流狀態(tài)下副產(chǎn)物多，且產(chǎn)物在DMF溶解度大，不易析出；選用乙腈或乙醇，雖然沸點(diǎn)低，但基本沒(méi)有產(chǎn)物生成；選用DMF和乙腈等比例混合溶劑，反應(yīng)溫度控制在回流狀態(tài)下能獲得高產(chǎn)率產(chǎn)品。采用薄板層析 [GF254硅膠板，V(乙酸乙酯)∶V(石油醚，60～90 ℃)=1∶3]跟蹤反應(yīng)結(jié)果顯示(表1)，回流10 h，反應(yīng)原料已基本消失，收率達(dá)78.52%；大于10 h，產(chǎn)率沒(méi)有明顯提高。

表1 不同反應(yīng)溶劑對(duì)目標(biāo)化合物產(chǎn)率的影響Table 1 The effect of various solvent on productivity

2.2目標(biāo)產(chǎn)物4a,4b分子結(jié)構(gòu)的波譜解析

采用紅外光譜(IR)檢測(cè)產(chǎn)物 N-H的強(qiáng)伸縮振動(dòng)出現(xiàn)在3 207～3 341 cm-1，C═S的強(qiáng)伸縮振動(dòng)峰出現(xiàn)在1 330～1 331 cm-1，1 538～843 cm-1是1,3,4-噻二唑環(huán)的振動(dòng)吸收，C-S-C的振動(dòng)吸收在657～658 cm-1處(圖2)；碳核磁共振波譜(13C-NMR)檢測(cè)C═S中的碳信號(hào)峰出現(xiàn)在181.57，1,3,4-噻二唑環(huán)上的C2,C5分別在154.37～155.82和160.31～162.51范圍內(nèi)，-CF3中的碳出現(xiàn)在121.61～121.73(圖3)，這些數(shù)據(jù)表明產(chǎn)物的分子表征符合設(shè)計(jì)的4a和4b分子結(jié)構(gòu)特征。(由圖1可知,4a和4b除了R基團(tuán)C原子數(shù)目不同外，結(jié)構(gòu)是一致的，因此，4b的光譜數(shù)據(jù)與4a相比，僅會(huì)有一些小的吸收峰不同，但不影響主要分子表征應(yīng)產(chǎn)生的峰值)。高分辨質(zhì)譜(HRMS(ESI) 中的m/z [M+H]+)檢驗(yàn)相對(duì)分子質(zhì)量結(jié)果顯示，4a和4b的相對(duì)分子質(zhì)量分別為393.0485和421.0796(圖4、圖5)與該物質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的計(jì)算值基本相等。這些特征說(shuō)明新合成化合物的波譜數(shù)據(jù)與分子結(jié)構(gòu)完全吻合。

圖2 目標(biāo)產(chǎn)物4a的紅外光譜圖Fig.2 The infrared spectra of compound 4a

圖3 目標(biāo)產(chǎn)物4a 的碳核磁共振譜圖Fig.3 The 13C-NMR spectra of compound 4a

圖4 目標(biāo)產(chǎn)物4a的高分辨質(zhì)譜圖Fig.4 The HRMS spectra of compound 4a

圖5 目標(biāo)產(chǎn)物4b的高分辨質(zhì)譜圖Fig.5 The HRMS of compound 4b

2.3目標(biāo)產(chǎn)物4a,4b對(duì)植物病原真菌的毒力測(cè)定

目前，三唑酮是廣泛應(yīng)用的抗真菌的有效藥物，因此,本試驗(yàn)以三唑酮為對(duì)照檢驗(yàn)4a和4b的抗真菌效果，結(jié)果顯示(表2)，在抗新月彎孢菌方面4a和4b的效果明顯強(qiáng)于三唑酮，尤其是4a提高9.78%；在抗棉花枯萎病菌方面，4a效果明顯強(qiáng)于三唑酮，提高9.04%；在抗煙草黑脛菌方面，4b的效果明顯強(qiáng)于三唑酮，提高15.52%；在抗禾谷鐮孢菌方面，4b效果明顯強(qiáng)于三唑酮，提高8.41%；從抑制率達(dá)到50%使用藥物質(zhì)量濃度EC50(mg·L-1)可以看出，4a和4b在抗新月彎孢菌、棉枯萎鐮刀菌和煙草黑脛菌方面，具有明顯優(yōu)勢(shì)，尤其是4b在抗新月彎孢菌和煙草黑脛菌方面，4a在抗棉枯萎鐮刀菌方面都呈現(xiàn)藥物用量明顯小于三唑酮。

表2 目標(biāo)產(chǎn)物4a，4b對(duì)4種植物病原菌的毒力測(cè)定Table 2 Inhibition effect of compound 4a,4b against four kinds of plant fungicidal

2.4目標(biāo)產(chǎn)物4a,4b對(duì)煙草花葉病(TMV)的防治效果分析

以珊西煙為試驗(yàn)材料，采取半葉枯斑法對(duì)接種TMV前后分別噴4a和4b進(jìn)行防治,結(jié)果試驗(yàn)顯示(表3)，4a，4b對(duì)煙草花葉病的治療效果并不明顯，但4b比2%寧南霉素預(yù)防效果提高25.44%。

表3 目標(biāo)產(chǎn)物4a，4b在珊西煙上對(duì)TMV的防治效果Table 3 The control effect of compound 4a,4b to TMV on Xanthi-NN

3 小結(jié)與討論

本研究描述了由初始原料氨基硫脲通過(guò)環(huán)化，烷基化，得中間產(chǎn)物5-S-烴基-2-氨基-1，3，4-噻二唑，然后和4-三氟甲基異硫氰酸苯酯作用合成目標(biāo)產(chǎn)物4a,4b的方法，并對(duì)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征。OTELEANU等[21]曾合成5個(gè)N-苯基-N′-(5-S-烴基-1,3,4-噻二唑-2-基)硫脲類(lèi)化合物，但對(duì)其生物活性沒(méi)有進(jìn)行測(cè)定；MAHAJAN等[22]合成了N-(7-氯喹啉-4-基)-N′-(5-S-乙基-1,3,4-噻二唑-2-基)硫脲，只對(duì)其抗瘧疾及抗癌活性進(jìn)行了測(cè)定。這二者合成都采用N，N-二甲基甲酰胺(DMF)為溶劑，產(chǎn)率低，后處理麻煩。本研究對(duì)新化合物的合成方法進(jìn)行改進(jìn)，后處理簡(jiǎn)單，提高了產(chǎn)率，并對(duì)化合物的抗菌性及抗煙草花葉病毒(TMV)的活性進(jìn)行了測(cè)定。初步生物活性測(cè)試結(jié)果顯示,化合物4a和4b對(duì)4種真菌有不同程度的抑制作用，其中化合物4a對(duì)新月彎孢菌，棉枯萎鐮刀菌的抑菌效果好于三唑酮，而4b新月彎孢菌，抗棉枯萎鐮刀菌及煙草黑脛菌的抑菌效果好于三唑酮。化合物4a和4b對(duì)TMV的治療抑制率略高于或接近寧南霉素，預(yù)防抑制率高于寧南霉素，尤其是化合物4b的預(yù)防抑制率達(dá)70%～80%，這和宋寶安等[23]合成的硫脲類(lèi)物質(zhì)研究結(jié)果基本相同，但是高于XU等[24]用硫醚修飾的1,3,4-噻二唑化合物對(duì)TMV的預(yù)防效果。但該類(lèi)化合物的溶解性能有待進(jìn)一步改進(jìn)。

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(責(zé)任編輯：常思敏)

Synthesisandantifungalandanti-TMVactivitiesofnovelthioureascontaining1,3,4-thiadiazole

SONG Hailong1,ZHAO Yuze3,WANG Caixia1,2,ZHOU Qi3,LIU Weiqun1,3

(1.College of Tobacco Science,Henan Agricultural University,Zhengzhou 450002,China; 2.College of Science,Henan Agricultural University,Zhengzhou 450002,China; 3.College of Life Science,Henan Agricultural University,Zhengzhou 450002,China)

In order to get compounds which have high-powered anti-microbial pathogens,two new N-heterocyclic thiourea compounds were synthesized by 1,3,4-thiadiazole derivatives and trifluoromethyl phenyl isothiocyanate.The chemical structure and molecular weight was confirmed by IR,1H-NMR,13C-NMR and HRMS.The antibacterial test showed that:compound 4a and 4b exhibited better antifungal activities at the concentration of 200 mg·L-1and 100 mg·L-1against Curvularia lunata,Cotton Fusarium,Wilt,Phytophthora parasitica var nicotianae and Fusarium graminearum compared with triadimefon.In the prevention and treatment of tobatco mosaic virus (TMV),the inhibition rate of compound 4b reached 78.38% at the concentration of 500 mg·L-1,increasing by 25.44% compared with ningnanmycin,and 4b showed a good preventive effect against TMV.

thiourea derivatives; tobacco; synthesize; biological activity

S 572

：A

2015-01-05

河南省教育廳科學(xué)技術(shù)基礎(chǔ)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(30600808)

宋海龍(1989-)，男，河南鄭州人，碩士研究生，主要從事煙草生理和化學(xué)研究。

劉衛(wèi)群(1956-)，女，河北臨城人，教授，博士生導(dǎo)師。

1000-2340(2016)03-0370-06