韓 麗，何瀟湘,，王瑞寧，曹貝貝，耿靜微，陳紅英,，魏戰(zhàn)勇,

(1. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，河南 鄭州 450002；2. 河南省動(dòng)物性食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州450002)

豬IL-18增強(qiáng)豬細(xì)小病毒滅活疫苗豬體細(xì)胞免疫效果的研究

韓 麗1，何瀟湘1,2，王瑞寧2，曹貝貝1，耿靜微2，陳紅英1,2，魏戰(zhàn)勇1,2

(1. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，河南 鄭州 450002；2. 河南省動(dòng)物性食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州450002)

為了研究豬白細(xì)胞介素18是否增強(qiáng)豬細(xì)小病毒(PPV)滅活疫苗在豬體免疫效果，分別將豬白細(xì)胞介素18與自制豬細(xì)小病毒滅活疫苗和豬細(xì)小病毒滅活疫苗聯(lián)合免疫仔豬，并設(shè)豬白介素18和生理鹽水對(duì)照組。免疫后分別用間接ELISA方法和流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)仔豬抗體水平變化和仔豬外周血T淋巴細(xì)胞亞群動(dòng)態(tài)變化。結(jié)果顯示，免疫后豬白細(xì)胞介素18聯(lián)合滅活疫苗組抗體水平與無豬白介素18滅活疫苗組相似，但免疫后豬白介素18聯(lián)合PPV滅活疫苗組的CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞所占比值均高于相應(yīng)的PPV滅活疫苗組，但差異不顯著,且CD4+/CD8+在正常范圍內(nèi)。研究證實(shí)豬白介素18主要增強(qiáng)PPV油乳劑滅活疫苗的細(xì)胞免疫應(yīng)答。

豬白細(xì)胞介素18；豬細(xì)小病毒；滅活疫苗

豬細(xì)小病毒病是由豬細(xì)小病毒(Porcine Parvovirus, PPV)感染引起的妊娠母豬繁殖障礙性疾病。該病毒主要導(dǎo)致初產(chǎn)母豬出現(xiàn)不孕、流產(chǎn)、產(chǎn)死胎、木乃伊胎及弱胎等臨床癥狀。豬細(xì)小病毒病廣泛存在并流行于世界各地養(yǎng)豬場(chǎng)，嚴(yán)重制約了養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，給全球養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。PPV的感染尚無有效的治療方法，疫苗免疫預(yù)防仍是控制該病的主要手段。目前，PPV疫苗主要包括滅活疫苗、弱毒疫苗、基因工程亞單位疫苗、基因工程活病毒載體疫苗等，其中滅活疫苗具有安全性好、產(chǎn)生抗體時(shí)間長(zhǎng)、不需要低溫保存的優(yōu)點(diǎn)；弱毒疫苗免疫效力較強(qiáng)、產(chǎn)生抗體快、用量少、成本低，但安全性較差；基因工程亞單位疫苗免疫源性較好，但成本和技術(shù)要求都比較高；基因工程活病毒載體疫苗可以同時(shí)預(yù)防兩種病或多種病的、能夠誘導(dǎo)較強(qiáng)的免疫反應(yīng)，但生產(chǎn)技術(shù)復(fù)雜、 成本較高；基因疫苗生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單、免疫劑量小、成本低廉、可構(gòu)建多基因或多價(jià)疫苗，但其安全性受到廣泛關(guān)注[1-3]。目前使用最廣泛的豬細(xì)小病毒病疫苗是滅活疫苗。滅活疫苗具有安全性好、保護(hù)力持久等優(yōu)點(diǎn)，但也存在免疫應(yīng)激強(qiáng)、有效免疫抗體產(chǎn)生慢、引起細(xì)胞免疫弱甚至無法引起細(xì)胞免疫等諸多問題。因此，開發(fā)一種安全、高效的滅活疫苗免疫增強(qiáng)劑對(duì)豬細(xì)小病毒病的防制至關(guān)重要。豬白細(xì)胞介素18(Interleukin-18，IL-18)是在一種具有多種生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)[4]。它既能增強(qiáng)抗原的免疫原性，又能作用于體內(nèi)免疫細(xì)胞，促進(jìn)其分化、增殖，具有較好的疫苗免疫佐劑效應(yīng)，在提高免疫應(yīng)答水平方面發(fā)揮著重要作用，是一種重要的細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)因子。IL-18能使HBV核酸疫苗誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)向Thl型為主的細(xì)胞免疫反應(yīng)轉(zhuǎn)變，并增強(qiáng)特異性的CTL反應(yīng)[5]。故可以用IL-18聯(lián)合PPV滅活疫苗來增強(qiáng)豬體的細(xì)胞免疫，從而彌補(bǔ)滅活疫苗的不足。由于IL-18可通過對(duì)IFN-γ的誘導(dǎo)作用，促進(jìn)MHC I類分子的表達(dá),因此可作為免疫佐劑增強(qiáng)疫苗的免疫效果[6]。本實(shí)驗(yàn)通過PPV特異性IgG抗體、豬外周血CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞亞群百分?jǐn)?shù)指標(biāo)的檢測(cè)，研究了其對(duì)豬體免疫效果的影響，為新型免疫增強(qiáng)劑的開發(fā)提供了理論基礎(chǔ)和試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1試劑及儀器

豬細(xì)小病毒ELISA診斷試劑盒(PPV ELISA KIT 96T,NC27606 USA)購(gòu)自BioXL公司；Multiskan MK3型酶標(biāo)儀購(gòu)自Therm公司)；FACsort流式細(xì)胞儀(Becton Dickinson,USA)；大鼠抗小鼠CD3+、CD4+和CD8+T細(xì)胞亞群?jiǎn)慰寺】贵w以及異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記兔抗大鼠IgG抗體購(gòu)自北京邦定泰克生物技術(shù)有限公司。

1.2疫苗

豬細(xì)小病毒油乳劑滅活疫苗購(gòu)自中牧實(shí)業(yè)股份有限公司(批號(hào)1009006-2)；自制豬細(xì)小病毒油乳劑滅活疫苗，滅活病毒的血凝(HA)效價(jià)為1∶29。

1.3豬白細(xì)胞介素18

由河南省動(dòng)物性食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的重組質(zhì)粒pcDNA-IL18，已經(jīng)被證實(shí)具有一定的生物學(xué)活性[7]。經(jīng)試驗(yàn)測(cè)定，豬白細(xì)胞介素18免疫仔豬的最佳免疫劑量為2 mL·頭-1。

1.4安全性檢驗(yàn)

1.4.1 小鼠的安全性檢驗(yàn) 取10 d SPF健康昆明乳鼠15只，分3組，每組5只。將自制豬細(xì)小病毒油乳劑滅活疫苗和豬白介素18分別皮下接種每組小鼠，每只0.1 mL，另外1組設(shè)不接種對(duì)照組。觀察2周，看是否出現(xiàn)不良反應(yīng)；如無異常則證明該疫苗和白介素18對(duì)乳鼠安全。

1.4.2 仔豬的安全性檢驗(yàn) 取PPV陰性健康仔豬9頭，分3組，每組3頭。將自制豬細(xì)小病毒油乳劑滅活疫苗及豬白細(xì)胞介素18分別肌肉注射每組仔豬，每頭接種10 mL，另外1組設(shè)不接種對(duì)照組。觀察2周，看是否出現(xiàn)不良反應(yīng)。如無異常則證明該疫苗和白介素18對(duì)仔豬安全。

1.5試驗(yàn)動(dòng)物及免疫

試驗(yàn)所用30頭35日齡斷奶仔豬(由鄭州市某豬場(chǎng)提供)隨機(jī)分為6組，每組5頭，經(jīng)ELISA檢測(cè)，PPV抗體陰性。試驗(yàn)分組及免疫情況見表1。

1.6特異性抗體水平測(cè)定

應(yīng)用間接ELISA方法，按照豬細(xì)小病毒ELISA診斷試劑盒(BioXL)說明書用試劑盒檢測(cè)仔豬血清中PPV特異性IgG抗體。

1.7外周血T淋巴細(xì)胞亞群測(cè)定

免疫后0、1、2、3、4周，每組分別隨機(jī)挑選2頭仔豬，前腔靜脈采血2 mL于含檸檬酸鈉抗凝劑的采血管中，分離淋巴細(xì)胞并計(jì)數(shù)，用無菌PBS溶液將細(xì)胞濃度調(diào)至5.0×106個(gè)·mL-1。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)分別檢測(cè)其CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞亞群含量。

表1 試驗(yàn)分組及免疫情況Table 1 Grouping and vaccination of tested pigs

2 結(jié)果與分析

2.1安全性檢驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 小鼠安全性檢驗(yàn) 接種小鼠觀察2周，小鼠精神食欲正常，無不良反應(yīng)，注射部位沒有出現(xiàn)紅腫，瘙癢，破潰等局部反應(yīng)。

2.1.2 仔豬安全性檢驗(yàn) 接種健康仔豬觀察2周，豬群體溫正常、采食、精神正常，注射部位未發(fā)現(xiàn)腫塊，無不良反應(yīng)。證明該自制疫苗和白細(xì)胞介素18對(duì)仔豬安全。

2.2特異性抗體水平測(cè)定

采用PPV診斷試劑盒分別對(duì)每周采集分離的血清進(jìn)行PPV特異性IgG抗體水平的檢測(cè)，對(duì)各試

驗(yàn)組所測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，得到豬細(xì)小病毒IgG抗體消長(zhǎng)的規(guī)律(圖1)。從圖1可以看出，免疫后各疫苗組IgG抗體水平均逐漸上升，并在第4周達(dá)到峰值，豬白細(xì)胞介素18組及生理鹽水組抗體水平無顯著變化。免疫后第3～5周，豬白細(xì)胞介素18聯(lián)合PPV滅活疫苗組的抗體效價(jià)高于相應(yīng)的滅活疫苗免疫組，但差異不顯著。滅活疫苗免疫組的抗體水平與生理鹽水對(duì)照組差異顯著(P<0.05)，豬白細(xì)胞介素18對(duì)照組與生理鹽水對(duì)照組差異不顯著。

疫苗接種后時(shí)間/周Time after vaccination

2.3外周血T淋巴細(xì)胞亞群動(dòng)態(tài)變化

2.3.1 免疫仔豬外周血CD3+T淋巴細(xì)胞動(dòng)態(tài)變化 免疫后各組CD3+T淋巴細(xì)胞百分比值均出現(xiàn)了動(dòng)態(tài)的變化(如圖2-A)。從圖2-A可見，豬白細(xì)胞介素18聯(lián)合PPV滅活疫苗的CD3+T淋巴細(xì)胞的所占比值高于相應(yīng)的無豬白細(xì)胞介素18 PPV滅活疫苗組，但差異不顯著(P>0.05)。在免疫后第3～4周，各免疫組與生理鹽水對(duì)照組差異顯著(P<0.01)。

疫苗接種后時(shí)間/周Time after vaccination

2.3.2 免疫仔豬外周血CD3+CD4+T淋巴細(xì)胞動(dòng)態(tài)變化 免疫后各組CD3+T淋巴細(xì)胞百分比值均出現(xiàn)了動(dòng)態(tài)的變化(如圖2-B)。從圖2-B可見，豬白細(xì)胞介素18聯(lián)合PPV滅活疫苗組的CD3+CD4+T淋巴細(xì)胞所占比值高于相應(yīng)的無豬白細(xì)胞介素18聯(lián)合PPV滅活疫苗組，豬白細(xì)胞介素18對(duì)照組高于生理鹽水對(duì)照組，但差異均不顯著(P>0.05)。

2.3.3 免疫仔豬外周血CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞動(dòng)態(tài)變化 免疫后各組CD3+T淋巴細(xì)胞百分比值均出現(xiàn)了動(dòng)態(tài)的變化(如圖2-C)。從圖2-C可見，豬白細(xì)胞介素18聯(lián)合PPV滅活疫苗組的CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞所占比值高于相應(yīng)的無白細(xì)胞介素18 PPV滅活疫苗組，豬白細(xì)胞介素18對(duì)照組高于生理鹽水對(duì)照組，但差異均不顯著(P>0.05)。

2.3.4 免疫仔豬外周血CD4+/CD8+淋巴細(xì)胞動(dòng)態(tài)變化 CD4+/CD8+的正常比值范圍為1.0～2.87，過高或過低都反映機(jī)體免疫功能紊亂。從圖3可見，豬白細(xì)胞介素18聯(lián)合PPV滅活疫苗組的(CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞比值)均趨于正常范圍，說明沒有對(duì)機(jī)體免疫功能造成壞的影響。

疫苗接種后時(shí)間/周Time after vaccination

3 討論

IL-18能誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ[8]，IFN-γ是IL-18誘導(dǎo)抗病毒免疫的介導(dǎo)因子[9]。IL-18可通過誘導(dǎo)CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞而明顯提高細(xì)胞免疫和體液免疫功能，從而有效地發(fā)揮IL-18的免疫佐劑作用。而且，IL-18能夠促進(jìn)Th1類細(xì)胞因子的表達(dá),促進(jìn)機(jī)體誘導(dǎo)特異性Th1細(xì)胞和CTL細(xì)胞反應(yīng)，增強(qiáng)機(jī)體的特異性細(xì)胞免疫功能[5]。IL-18還能顯著提高T淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率，提高機(jī)體的細(xì)胞免疫水平。IL-18的早期應(yīng)用還能起到防御病毒入侵和保護(hù)心肌的作用[10]。因此，本試驗(yàn)就通過用豬白介素18作為免疫增強(qiáng)劑來增強(qiáng)豬細(xì)小病毒滅火疫苗在豬體的細(xì)胞免疫功能。

間接ELISA方法檢測(cè)免疫后仔豬血清PPV抗體動(dòng)態(tài)變化，結(jié)果顯示豬白細(xì)胞介素18聯(lián)合PPV滅活疫苗組抗體效價(jià)均高于相應(yīng)的滅活疫苗單獨(dú)免疫組，并呈持續(xù)增長(zhǎng)趨勢(shì)，在第3、4周抗體效價(jià)顯著增高(P<0.05)。豬白細(xì)胞介素18單獨(dú)免疫組的抗體效價(jià)在免疫后第4-6周上升比生理鹽水對(duì)照組高。結(jié)果表明，豬白細(xì)胞介素18能夠增強(qiáng)PPV滅活疫苗的體液免疫應(yīng)答強(qiáng)度。

T淋巴細(xì)胞亞群是構(gòu)成機(jī)體免疫系統(tǒng)的重要成分。CD3分子是存在于所有成熟T淋巴細(xì)胞膜表面的重要分化抗原，是成熟T細(xì)胞的特征性標(biāo)志，其主要功能是傳遞T細(xì)胞活化信號(hào)[11-12]。CD4+T淋巴細(xì)胞是免疫系統(tǒng)的主要調(diào)節(jié)細(xì)胞，能分泌多種細(xì)胞因子，具有誘導(dǎo)和增強(qiáng)免疫應(yīng)答的作用[13-14]。CD3+、CD4+淋巴細(xì)胞亞群激活后可增殖分化為Th1和Th2 效應(yīng)細(xì)胞，并通過表達(dá)不同的細(xì)胞因子介導(dǎo)各自的免疫功能[13-15]。本研究利用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)免疫后各組仔豬脾臟T淋巴細(xì)胞亞群的動(dòng)態(tài)變化，評(píng)價(jià)豬白細(xì)胞介素18對(duì)PPV滅活疫苗的細(xì)胞免疫水平的影響。結(jié)果顯示，豬白細(xì)胞介素18 聯(lián)合PPV滅活疫苗組的CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞所占比值均高于相應(yīng)的PPV滅活疫苗免疫組。免疫后21～28d，豬白細(xì)胞介素18聯(lián)合PPV滅活疫苗試驗(yàn)組的CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)與相應(yīng)的滅活疫苗單獨(dú)免疫組差異顯著(P<0.05)。免疫后第21天，豬白細(xì)胞介素18聯(lián)合PPV滅活疫苗組的CD8+T淋巴細(xì)胞所占比值比相應(yīng)的滅活疫苗單獨(dú)免疫組高，且差異顯著(P<0.05)。從本研究的CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞比值變化情況看，CD4+T淋巴細(xì)胞在豬白細(xì)胞介素18增強(qiáng)細(xì)胞免疫應(yīng)答中發(fā)揮著重要作用，表明豬白細(xì)胞介素18佐劑主要通過CD4+T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)作用增強(qiáng)仔豬的細(xì)胞免疫應(yīng)答。各免疫組免疫仔豬后，豬白細(xì)胞介素18聯(lián)合PPV滅活疫苗組的CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞比值比相應(yīng)的滅活疫苗單獨(dú)免疫組高。研究結(jié)果表明，白細(xì)胞介素18能夠提高PPV油乳劑滅活疫苗的體液免疫水平細(xì)胞，同時(shí)還能增強(qiáng)PPV油乳劑滅活疫苗的細(xì)胞免疫應(yīng)答強(qiáng)度，證明豬白細(xì)胞介素18能夠被用作PPV油乳劑滅活疫苗的免疫增強(qiáng)劑。

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(責(zé)任編輯：蔣國(guó)良)

Enhancingimmuneresponsestoinactivatedporcineparvovirusoilemulsionvaccinebyco-inoculatingporcineinterleukin18inporcine

HAN Li1, HE Xiaoxiang1,2, WANG Ruining2, CAO Beibei1, GENG Jingwei2, CHEN Hongying1,2, WEI Zhanyong1,2

(1. College of Animal Husbaudry and Veterinary Science， Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002,China； 2. Key Laboratory for Animal-derived Food Safety of Henan Province, Zhengzhou 450002, China)

The objective of this study is to characterize the enhancing immune responses to inactivated porcine parvovirus(PPV) oil emulsion vaccine by co-inoculating porcine interleukin 18 (IL-18) in porcine. In this study, the immunogenicity of PPV vaccine and the immuno-regulatory activities of IL-18 were investigated. The inactivated PPV vaccines with or without IL-18 were inoculated into piglet by subcutaneous injection. Then humoral and cellular immune responses were evaluated by indirect enzyme-linked immunosorbent assays(ELISA) and fluorescence-activated cell sorter analyses (FACS). The results demonstrated that after immunity, the swine IL-18 joint inactivated vaccine group antibody levels were similar to inactivated vaccine without IL-18, and the T lymphocyte ratio of swine IL-18 joint PPV inactivated vaccine group CD3+,CD3+CD4+,CD3+CD8+were higher than PPV inactivated vaccine group,but the difference was not significant. In conclusion, these results suggest that IL-18 possess better cellular immune-enhancing capability and can be exploited into an effective immune-adjuvant for inactivated vaccines.

porcine interleukin 18; porcine parvovirus; inactivated vaccine

S852.4

：A

2015-12-12

河南省重大科技攻關(guān)項(xiàng)目(132102110034)；河南省科技開放合作項(xiàng)目(142106000042)

韓 麗(1989-)，女，河南南陽人，碩士研究生，主要從事動(dòng)物分子病毒學(xué)研究。

魏戰(zhàn)勇(1975-)，男，河南安陽人，教授，碩士生導(dǎo)師。

1000-2340(2016)02-0224-05