王延偉，郭　倩，陳　冬，陳　丹，徐秀泉

(江蘇大學(xué)藥學(xué)院，江蘇　鎮(zhèn)江　212013)

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響應(yīng)面法優(yōu)化Tween-80超聲提取藤茶二氫楊梅素工藝*

王延偉，郭倩，陳冬，陳丹，徐秀泉

(江蘇大學(xué)藥學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013)

利用響應(yīng)面法優(yōu)化藤茶中二氫楊梅素的提取工藝。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取Tween-80濃度、超聲時(shí)間和超聲溫度為自變量，二氫楊梅素得率為響應(yīng)值，進(jìn)行Box-benhnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，運(yùn)用響應(yīng)面設(shè)計(jì)法優(yōu)化提取條件。獲得最優(yōu)提取條件為：料液比30 mL/g，Tween-80濃度6.8%，超聲溫度54 ℃，超聲時(shí)間29 min，藤茶中二氫楊梅素的提取得率為355.8 mg/g，理論值為353.7 mg/g，RSD為0.59%。采用響應(yīng)面設(shè)計(jì)方優(yōu)化的藤茶中二氫楊梅素Tween-80協(xié)同超聲提取工藝方法可行，結(jié)果可靠。

藤茶；二氫楊梅素；超聲提??；Tween-80；響應(yīng)面法

二氫楊梅素是富含于藤茶(Ampelopsisgrossedendata)幼嫩莖葉中具多酚羥基的二氫黃酮醇類化合物[1]?，F(xiàn)代藥理學(xué)表明，二氫楊梅素具有顯著的抗腫瘤、抗氧化、抗炎、抗阿茲海默癥等生理活性[2-4]，極具開發(fā)價(jià)值。從藤茶中提取二氫楊梅素多采用溶劑加熱回流方法[5]，該方法周期長、溫度高、效率低、有機(jī)溶劑消耗嚴(yán)重，尋求高效的提取方法是目前研究的熱點(diǎn)之一。超聲提取技術(shù)是利用超聲波的空化效應(yīng)、機(jī)械效應(yīng)和熱效應(yīng)，能夠提高植物細(xì)胞的通透性，可加速有效成分的溶出，具有提取效率高、時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于中藥活性成分的提取領(lǐng)域[6]。表面活性劑具有雙親結(jié)構(gòu)，能顯著降低溶液的表面張力，增強(qiáng)溶劑對中藥材的滲透作用，對中藥材中的有效成分具有增溶作用，表現(xiàn)出良好的提取效率[7]。本文擬綜合二者的優(yōu)勢，首次利用Tween-80表面活性劑體系結(jié)合超聲提取方法，采用響應(yīng)面試驗(yàn)法優(yōu)化Tween-80協(xié)同超聲提取藤茶中二氫楊梅素的工藝，探索高效提取藤茶中二氫楊梅素的有效方法。

1　實(shí)　驗(yàn)

1.1材料與儀器

藤茶購自張家界旺盛商貿(mào)有限公司，經(jīng)江蘇大學(xué)藥學(xué)院湯建副教授鑒定為葡萄科植物顯齒蛇葡萄Ampelopsisgrossedentata的干燥莖葉，粉碎過60目篩備用；二氫楊梅素對照品，南京澤朗有限公司；色譜純甲醇，蘇州天可貿(mào)易有限公司；其余試劑均為國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司分析純；試驗(yàn)用水為雙蒸超純水。

LC-20AT高效液相色譜儀，日本島津公司；KQ-250DB數(shù)控超聲波清洗儀，昆山市超聲儀器有限公司；BSA124S型電子天平，北京賽多利斯儀器有限公司；Pico型超速離心機(jī)，美國熱電公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1二氫楊梅素含量測定方法的建立

精密稱取定量干燥至恒重的二氫楊梅素對照品于量瓶中，加適量色譜甲醇溶解，定容至刻度，得0.48 mg/mL的對照品溶液。分別精密移取0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 mL該溶液，置于10 mL量瓶中，加色譜甲醇定容至刻度，得系列濃度對照品溶液。按照下列色譜條件進(jìn)行測定[8]： Kromasil C18分析柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)，甲醇-水-磷酸(27:73:0.2)為流動(dòng)相，流速：1.0 mL/min，柱溫：25 ℃，檢測波長: 292 nm，進(jìn)樣體積:20 μL。以對照品濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y=11738x-4052，R2=0.9997，結(jié)果表明在9.6～96 μg/mL范圍內(nèi)對照品濃度與峰面積呈現(xiàn)良好的線性相關(guān)。

1.2.2藤茶中二氫楊梅素的提取得率測定

精密量取1.0 mL藤茶提取液用色譜甲醇稀釋到一定倍數(shù)，0.45 μm微孔濾膜過濾后，按照1.2.1色譜條件，進(jìn)樣檢測，計(jì)算二氫楊梅素提取得率。

1.2.3響應(yīng)面設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以Tween-80濃度(X1)、超聲時(shí)間(X2) 、超聲溫度(X3) 三個(gè)因素為自變量，以二氫楊梅素得率為響應(yīng)值，采用Design-Expert. 8.05 軟件中的Box-Behnken Design試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法進(jìn)行設(shè)計(jì)。各因素水平及編碼見表1。

表1　響應(yīng)面分析因子及水平表

2　響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

由單因素試驗(yàn)結(jié)果可知，料液比對二氫楊梅素得率影響不大，因此固定料液比1:25，以Tween-80濃度、提取時(shí)間和溫度為自變量，二氫楊梅素得率為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)3因素3水平共15個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，其中12個(gè)為析因試驗(yàn)，3個(gè)為中心試驗(yàn)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)與及結(jié)果見表2。

表2　響應(yīng)面分析試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

續(xù)表2

710-1293.78101316.390-1-1323.6100-11341.41101-1318.912011325.413000354.414000348.615000350.1

表3　回歸模型方差分析

注：*表示顯著(0.05>P>0.01)，**表示高度顯著(0.01>P>0.001)，***表示極顯著(P<0.001)。

運(yùn)用Expert-design 8.05中的RSR(response surface repression)程序?qū)?5個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)值進(jìn)行回歸分析，得到Tween-80濃度、超聲提取時(shí)間和溫度對響應(yīng)值的回歸方程為：

回歸方程方差分析結(jié)果見表3。由方差分析可知，該回歸方程的確定系數(shù)R2為0.9866，方程的F值為40.98均達(dá)到極顯著水平，說明回歸方程擬合良好；調(diào)整確定系數(shù)R2Adj為0.9626，說明該數(shù)學(xué)模型能解釋96.26%的響應(yīng)值變化。

由P值可以分析各因素對響應(yīng)值的影響程度。一次項(xiàng)中，Tween-80濃度、提取時(shí)間和溫度對二氫楊梅素得率的影響均高度顯著；二次項(xiàng)中，Tween-80濃度對二氫楊梅素得率的影響極顯著，提取時(shí)間和溫度對二氫楊梅素得率的影響均高度顯著；交互項(xiàng)X1X2、X1X3、X2X3均未達(dá)到顯著水平。

三維響應(yīng)面圖可以用來反應(yīng)單因素對響應(yīng)值的影響，若曲面坡度平緩，說明該因素對響應(yīng)值影響較小，若曲面坡度陡峭，則該因素對響應(yīng)值影響較大。根據(jù)表1結(jié)果，繪制響應(yīng)面為圖2(A～C)。

圖2　各交互作用對藤茶二氫楊梅素得率影響的響應(yīng)面

由圖2(A)可知，二氫楊梅素得率隨Tween-80濃度的增加迅速提高而后慢慢降低，曲面坡度較提取時(shí)間的變化更為陡峭，這與單因素試驗(yàn)結(jié)果一致，說明Tween-80濃度較提取時(shí)間對二氫楊梅素得率的影響更為顯著。Tween-80為非離子型表面活性劑，在水中形成微膠團(tuán)降低溶劑的表面張力，提高二氫楊梅素在體系中的溶解度，所以Tween-80濃度增加，形成的微膠團(tuán)越多，對二氫楊梅素的增溶作用越強(qiáng)，但是濃度增加到一定程度，會(huì)增加溶劑的粘度，阻礙二氫楊梅素的溶出。在圖2(B)中，二氫楊梅素得率隨Tween-80濃度和超聲溫度的變化均為先顯著增加后顯著降低，兩因素的曲面坡度都非常陡峭，說明二者均對二氫楊梅素得率具有顯著影響，在一定范圍內(nèi)提高Tween-80濃度和超聲溫度能夠增加微膠團(tuán)的數(shù)目，加速溶劑的運(yùn)動(dòng)速度，提高二氫楊梅素得率，但是溫度過高，將導(dǎo)致微膠團(tuán)起濁破裂，Tween-80增溶作用大大降低，致使二氫楊梅素得率的大大降低。在圖2(C)中，兩因素的曲面坡度均較平緩，說明固定了Tween-80濃度之后，在選定的范圍內(nèi)，二者對二氫楊梅素得率的影響小于Tween-80濃度的變化。

根據(jù)所得模型，獲得藤茶中二氫楊梅素超聲提取的最優(yōu)工藝條件：固定料液比30 mL/g，Tween-80濃度為6.8%，超聲溫度54 ℃，超聲時(shí)間29 min，理論值為353.7 mg/g，進(jìn)行三次驗(yàn)證試驗(yàn)，藤茶中二氫楊梅素的提取得率為355.8 mg/g，與理論值非常接近，RSD為0.59%，?？梢娡ㄟ^響應(yīng)面法建立的回歸模型具有較高的可靠性，優(yōu)化工藝可行。

3　結(jié)　論

藤茶中富含的二氫楊梅素是值得深入研究的高活性化合物。本文綜合了超聲輔助提取和表面活性劑提取的優(yōu)點(diǎn)，利用單因素和響應(yīng)面分析法優(yōu)化了藤茶中二氫楊梅素的最優(yōu)提取工藝：固定料液比30 mL/g，Tween-80濃度為6.8%，超聲溫度54 ℃，超聲時(shí)間29 min，二氫楊梅素得率可達(dá)355.8 mg/g，與理論值的相對誤差很小，充分說明了提取工藝的可靠性。采用響應(yīng)面設(shè)計(jì)方優(yōu)化藤茶中二氫楊梅素Tween-80協(xié)同超聲提取工藝方法可行，綠色環(huán)保，為進(jìn)一步開發(fā)二氫楊梅素具有很大的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

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Optimization of Ultrasonic-assisted Tween-80 Mediated Extraction of Dihydromyricetin fromAmpelopsisgrossedendataby Response Surface Methodology*

WANG Yan-wei, GUO Qian, CHEN Dong, CHEN Dan, XU Xiu-quan

(School of Pharmacy, Jiangsu University, Jiangsu Zhenjiang 212013, China)

A noval method based on ultrasonic-assisted Tween-80 mediated extraction was developed for the extraction of dihydromyricetin from Ampelopsis grossedentata. The non-ionic surfactant Tween -80 was chosen as extraction solvent. The key parameters including the concentration of Tween-80, ultrasonic temperature and time were optimized by response surface methodology. The optimum conditions were determined as 6.8%(V/V) aqueous Tween-80, ultrasonic temperature of 54 ℃, ultrasonic time of 29 min and meterial-liquid ratio of 1:25 for the highest dihydromyricetin content of 355.4 mg/g. The experimental values were well agreed with the predicted 353.7 mg/g with 0.59% of RSD. The results showed that the response surface methodology was useful for optimizing the Tween-80 mediated extraction of dihydromyricetin fromAmpelopsisgrossedendata.

Ampelopsis grossedentata; dihydromyricetin; ultrasonic-assisted extraction; Tween-80 mediated; response surface methodology

江蘇省中醫(yī)藥管理局項(xiàng)目(LZ13244)；江蘇省博士創(chuàng)新項(xiàng)目(CXLX13-686)；江蘇省大學(xué)生創(chuàng)新項(xiàng)目(201410299084X)；江蘇大學(xué)大學(xué)生科研立項(xiàng)項(xiàng)目(13A169)。

王延偉(1993-)，碩士研究生。

徐秀泉(1978-)，博士。

R284.2

A

1001-9677(2016)016-0063-03