祝亞嬌，宋嘉賓，陳楊陽，孫炳剛，陳敬幫，魏雪團,2*

1(華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國家重點實驗室, 湖北 武漢，430070) 2(華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢，430070)

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地衣芽胞桿菌工程菌高產(chǎn)納豆激酶的發(fā)酵罐工藝優(yōu)化及中試放大

祝亞嬌1，宋嘉賓1，陳楊陽1，孫炳剛1，陳敬幫1，魏雪團1,2*

1(華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國家重點實驗室, 湖北 武漢，430070) 2(華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢，430070)

以前期構(gòu)建的產(chǎn)納豆激酶的地衣芽胞桿菌工程菌BL10 (pP43SNT-SsacC)為研究對象，進行5 L發(fā)酵罐工藝優(yōu)化及中試放大研究?？疾炝? L罐轉(zhuǎn)速、溫度和pH對納豆激酶發(fā)酵過程的影響，優(yōu)化了發(fā)酵條件：轉(zhuǎn)速500 r/min、發(fā)酵溫度37 ℃、自然pH，納豆激酶發(fā)酵活性達(dá)62.90 FU/mL，比初始發(fā)酵活性提高了94%。在此基礎(chǔ)上，進行了葡萄糖和混合氮源補料發(fā)酵研究，確定了5 L罐的補料發(fā)酵工藝，當(dāng)葡萄糖的補加速率為1.5 g/(L·h)時，生物量提高31%，納豆激酶發(fā)酵活性達(dá)到71.23 FU/mL，比對照提高了13%。在50 L罐和300 L罐的中試放大實驗中，納豆激酶發(fā)酵酶活分別達(dá)到67.23 FU/mL和72.33 FU/mL，納豆激酶發(fā)酵活性相對穩(wěn)定，為納豆激酶的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

納豆激酶; 地衣芽胞桿菌工程菌; 液體發(fā)酵; 工藝優(yōu)化; 中試放大

血栓性疾病嚴(yán)重影響人類的健康，中國每年約260萬患者因血栓性疾病而死亡，約占全世界死亡患者的1/5。目前臨床上常用的溶栓藥物有尿激酶、鏈激酶和纖溶酶原激活劑(t-PA)，但這些藥物存在副作用大、價格昂貴、半衰期短等缺點[1]。納豆激酶是分離自日本納豆的一種微生物纖溶酶，具有高效的溶栓活性，在預(yù)防和治療血栓性疾病方面效果顯著[2-3]。與傳統(tǒng)的溶栓藥物相比，納豆激酶具有可口服、安全、高效、持久和廉價等優(yōu)勢，成為近年來溶栓類產(chǎn)品的研究熱點[2]。

重組表達(dá)是提高目標(biāo)蛋白產(chǎn)量的重要策略，通過多種基因改造方法可提高目標(biāo)蛋白的表達(dá)[4-6]。納豆激酶來源于枯草芽胞桿菌[7]，其在大腸桿菌、乳酸菌中都已實現(xiàn)了分泌表達(dá)，但表達(dá)活性較低[8-9]。在枯草芽胞桿菌中，通過優(yōu)化啟動子和構(gòu)建蛋白酶缺陷型宿主菌，可顯著增強納豆激酶的重組表達(dá)[5-10]。地衣芽胞桿菌具有高效的蛋白分泌能力，已被用于多個天然酶和重組酶的生產(chǎn)[11]。本課題組通過宿主菌改造和信號肽優(yōu)化，構(gòu)建了高效表達(dá)納豆激酶的地衣芽胞桿菌工程菌BL10 (pP43SNT-SsacC)[12]，建立了搖瓶發(fā)酵工藝，但還未進行發(fā)酵罐工藝優(yōu)化及中試放大研究。

本文以前期構(gòu)建的地衣芽胞桿菌工程菌BL10 (pP43SNT-SsacC)為生產(chǎn)菌株，在搖瓶發(fā)酵工藝的基礎(chǔ)上，進行5 L發(fā)酵罐工藝優(yōu)化和中試放大研究，進一步推動其工業(yè)化生產(chǎn)進程。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種

地衣芽胞桿菌工程菌BL10 (pP43SNT-SsacC)為本實驗室構(gòu)建保存。

1.1.2主要儀器設(shè)備

ZS-5LG-03 5L發(fā)酵罐，上海國強生化工程技術(shù)研究中心；50 L發(fā)酵罐，上海高機生物工程有限公司；300 L發(fā)酵罐，上海齊瑞生物科技有限公司；生物傳感分析儀，山東省科學(xué)院生物研究所；恒溫培養(yǎng)振蕩器，天津市歐諾儀器儀表有限公司；DHP-9052電熱恒溫培養(yǎng)箱，武漢恒豐中欣生物科技發(fā)展有限公司；超凈工作臺，上海博訊實業(yè)有限公司；立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海三申醫(yī)療器械有限公司；低溫高速離心機，力康發(fā)展有限公司；精密電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.1.3主要試劑及培養(yǎng)基

1.1.3.1主要試劑

凝血酶、纖維蛋白原，Sigma-Aldrich有限責(zé)任公司；葡萄糖，西王藥業(yè)有限公司；酵母抽提物、胰蛋白胨，英國Oxoid公司；其他常用化學(xué)試劑購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3.2主要培養(yǎng)基

LB固體培養(yǎng)基(g/L)：酵母粉5，蛋白胨10，NaCl 10，瓊脂粉15，pH 7.0～7.2。

LB液體培養(yǎng)基(g/L)：酵母粉5，蛋白胨10，NaCl 10，pH 7.0～7.2。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20，蛋白胨10，大豆蛋白胨10，酵母粉15，玉米漿5，K2HPO4·3H2O 1.0，MgSO4·7H2O 0.5，CaCl2·2H2O 0.5，pH 7.2～7.4。

1.2方法

1.2.15 L罐發(fā)酵工藝優(yōu)化

將BL10 (pP43SNT-SsacC)接種于含四環(huán)素(20 μg/mL)的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃，180 r/min培養(yǎng)10 h，轉(zhuǎn)接至LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃，180 r/min培養(yǎng)10 h即為種子液。按照3%的接種量接種至5 L發(fā)酵罐中，發(fā)酵培養(yǎng)基的裝液量為40%，通氣量為2 vvm，對發(fā)酵過程中的溫度、轉(zhuǎn)速及補料方式進行優(yōu)化。整個發(fā)酵過程中，每4 h取1次樣，檢測發(fā)酵液中菌體生物量和納豆激酶酶活力，以此確定最優(yōu)的5 L罐發(fā)酵工藝。

1.2.250 L罐及300 L罐中試放大

根據(jù)優(yōu)化的5 L罐發(fā)酵工藝，在50 L和300 L發(fā)酵罐中進行放大實驗，設(shè)定通氣量為2 vvm，發(fā)酵溫度為37 ℃，轉(zhuǎn)速500 r/min，pH自然。發(fā)酵過程中，每4 h取1次樣并記錄發(fā)酵液pH值，同時檢測發(fā)酵液樣品的菌體生物量和納豆激酶酶活力，評價50 L罐和300 L罐中納豆激酶中試發(fā)酵結(jié)果。

1.2.3納豆激酶的酶活測定方法

納豆激酶活性的測定參考我們先前應(yīng)用的纖維蛋白溶解法[13]。向試管中依次加入0.40 mL纖維蛋白原溶液(7.2 g/L)，1.4 mL Tris-HCl (50 mmol/L, pH 7.8)，37 ℃溫浴5 min，加入0.10 mL凝血酶溶液(20 U/mL)，37 ℃溫浴10 min形成人工血栓，然后加入0.10 mL的稀釋酶樣品，37 ℃溫浴60 min，最終加入2 mL三氯乙酸(0.20 mol/L)溶液靜止20 min終止反應(yīng)，10 000 r/min離心10 min，取上清液于275 nm比色測定吸光度，1個單位的納豆激酶活性(FU)相當(dāng)于每分鐘275 nm處吸光度增加0.01所需要的酶量。

2　實驗結(jié)果與分析

2.1轉(zhuǎn)速對納豆激酶發(fā)酵過程的影響

在5 L罐發(fā)酵納豆激酶的過程中，發(fā)酵溫度為37 ℃，轉(zhuǎn)速為300 r/min，每4 h取1次樣并檢測發(fā)酵液中菌體生物量和納豆激酶酶活力，發(fā)酵結(jié)果如圖1所示，最大生物量(OD600值)為8.63，最大納豆激酶活力達(dá)到32.45 FU/mL。當(dāng)發(fā)酵轉(zhuǎn)速提高到500 r/min時，最大生物量(OD600值)達(dá)21.04，最大納豆激酶發(fā)酵活性達(dá)62.90 FU/mL，比初始發(fā)酵活性提高了94%，進一步提高發(fā)酵轉(zhuǎn)速到700 r/min時，最大生物量有顯著的下降，納豆激酶發(fā)酵活性沒有顯著性變化，因此，選擇500 r/min為最適發(fā)酵轉(zhuǎn)速。

A-生物量；B-納豆激酶發(fā)酵活性圖1　轉(zhuǎn)速對納豆激酶發(fā)酵過程的影響Fig.1　Effect of agitation speed on the fermentation process of nattokinase

2.2溫度對納豆激酶發(fā)酵過程的影響

在5 L罐發(fā)酵納豆激酶的過程中，分別控制發(fā)酵溫度為32，37和42 ℃，轉(zhuǎn)速為500 r/min。由圖2A可以看出，溫度越高，菌體生長速度越快，其中，42 ℃高溫條件下細(xì)菌生長最快，但菌體衰老提前，導(dǎo)致其最大菌體密度的OD600值僅為16.68，而在37和32 ℃條件下，菌體最大比濁度OD600值分別達(dá)到22.38和20.12。相比之下，37 ℃條件下納豆激酶的活性顯著高于32和42 ℃，最有利于納豆激酶的合成，說明我們初始選擇37 ℃的發(fā)酵溫度是適宜的，這與先前報道的結(jié)果相一致[14-15]。

A-生物量；B-納豆激酶發(fā)酵活性圖2　溫度對納豆激酶發(fā)酵過程的影響Fig.2　Effect of temperature on the fermentation process of nattokinase

2.35 L罐發(fā)酵pH控制

在5 L罐納豆激酶的發(fā)酵過程中，通過自動補加濃氨水和鹽酸，分別將發(fā)酵過程中的pH控制在6.5、7.0和7.5左右，轉(zhuǎn)速500 r/min，發(fā)酵溫度37 ℃，每4 h記錄1次發(fā)酵液pH值，并檢測發(fā)酵液中菌體生物量和發(fā)酵液納豆激酶酶活力，發(fā)酵結(jié)果如圖3所示。由圖3可以看出，發(fā)酵過程中pH的控制對菌體生物量沒有顯著性影響。隨著pH的升高，納豆激酶的合成加快，但pH不加調(diào)控時，納豆激酶的合成量最大。因此，對發(fā)酵過程中的pH不加調(diào)控。

A-生物量；B-納豆激酶發(fā)酵活性圖3　pH對納豆激酶發(fā)酵過程的影響Fig.3　Effect of pH on the fermentation process of nattokinase

2.45 L罐發(fā)酵補料實驗

2.4.1葡萄糖補料發(fā)酵

在5 L罐發(fā)酵過程中，當(dāng)發(fā)酵液中的葡萄糖消耗完全后(生物傳感儀離線檢測為發(fā)酵16 h)，分別以0.5 mL/min(a)、0.25 mL/min(b)、0.1 mL/min(c)的速率補加質(zhì)量濃度為0.2 g/mL的葡萄糖溶液。由圖4可知，不同的葡萄糖添加速率都提高了工程菌的生物量，并延長了穩(wěn)定期。其中，當(dāng)葡萄糖的添加速率為0.5 mL/min時，最大比濁度為33.8，生物量比對照提高了51%，但其最大納豆激酶發(fā)酵活性比對照下降了14%，這說明高的生物量不一定有利于納豆激酶的合成。當(dāng)葡萄糖流加速率為0.25 mL/min時，納豆激酶發(fā)酵活力最大，為71.23 FU/mL，比對照提高了13%，說明補加適當(dāng)質(zhì)量濃度的葡萄糖有利于納豆激酶的合成，與先前的報道趨勢相一致[14]。

A-生物量；B-納豆激酶發(fā)酵活性圖4　不同葡萄糖流加速率對納豆激酶發(fā)酵過程的影響Fig.4　Effect of glucose flowing rate on the fermentation process of nattokinase

2.4.2復(fù)合氮源補料發(fā)酵

在5 L罐發(fā)酵過程中，分別12，24和36 h時一次性補加100 mL復(fù)合氮源(5 g蛋白胨，5 g大豆蛋白胨，7.5 g酵母粉和2.5 g玉米漿溶于100 mL蒸餾水中)，考察了補加復(fù)合氮源對納豆激酶發(fā)酵的影響。由圖5可知，不同時間段補加復(fù)合氮源對生物量并無提高作用，但在一定程度上減緩了菌體衰亡；納豆激酶的酶活并沒有隨著氮源的添加而提高，相反，12 h補加時，納豆激酶活性反而降低。先前的報道發(fā)現(xiàn)補加氮源可顯著提高野生菌的納豆激酶發(fā)酵活性[16]，與本文結(jié)果不一致。分析其原因，一方面可能是由于本文所用發(fā)酵培養(yǎng)基中氮源是充足的，故不需補加氮源，另一方面可能由于本文所用基因工程菌與野生菌存在差異，氮源對工程菌分泌納豆激酶并不是關(guān)鍵因素。

A-生物量；B-納豆激酶發(fā)酵活性圖5　不同時間段補加符合氮源對納豆激酶發(fā)酵過程的影響Fig.5　Effect of feeding nitrogen at different time on the fermentation process of nattokinase

2.550 L罐及300 L罐中試放大實驗

為了評價5 L罐發(fā)酵工藝的穩(wěn)定性，推動納豆激酶的工業(yè)化生產(chǎn)，在50 L罐和300 L罐中對納豆激酶發(fā)酵工藝進行放大實驗，結(jié)果如圖5所示。50 L和300 L罐中納豆激酶酶活都在32 h達(dá)到最大，分別為67.23 FU/mL和72.33 FU/mL，說明5 L罐發(fā)酵工藝在放大過程中保持相對穩(wěn)定，為納豆激酶的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。目前報道的商業(yè)化納豆固體發(fā)酵工藝中，納豆激酶的發(fā)酵活性水平一般為20-40 FU/g[1]，本文所報道的液體發(fā)酵工藝中納豆激酶活性遠(yuǎn)高于常用商業(yè)化固體發(fā)酵工藝水平。因此，本文的發(fā)酵水平達(dá)到了商業(yè)化生產(chǎn)水平，具有良好的工業(yè)化應(yīng)用前景。

圖6　納豆激酶50 L罐和300 L罐發(fā)酵活性Fig.6　The fermentation activity of nattokinase on 50 L and 300 L bioreactor

3　結(jié)論

本文研究了5 L發(fā)酵罐中轉(zhuǎn)速、溫度、pH對納豆激酶發(fā)酵的影響，得到最優(yōu)的發(fā)酵條件為轉(zhuǎn)速500 r/min、罐溫37 ℃、發(fā)酵過程中自然pH，在32 h時得到最大酶活為62.90 FU/mL，比初始發(fā)酵工藝提高了94%。當(dāng)以0.25 mL/min的速率補加濃度為0.2 g/mL的葡萄糖溶液時，納豆激酶活性進一步提高了13%。最后，將5 L罐發(fā)酵工藝在50 L和300 L罐中進行中試放大實驗，納豆激酶發(fā)酵活性保持相對穩(wěn)定，驗證了5 L罐發(fā)酵工藝應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)的可行性，為納豆激酶的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

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High production of nattokinase byBacilluslicheniformisgene engineering strain in bioreactor: fermentation process optimization and pilot-plant test

ZHU Ya-jiao1, SONG Jia-bin1，CHEN Yang-yang1， SUN Bing-gang1，CHEN Jing-bang1，WEI Xue-tuan1,2*

1(State Key Laboratory of Agricultural Microbiology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China) 2(College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China)

As the efficient and safe thrombolysis enzyme, nattokinase shows good potential in prevention and treatment of cardiovascular diseases. In this study, bioreactor process optimization and pilot test were performed for high production of nattokinase usingBacilluslicheniformisgene engineering strain BL10 (pP43SNT-SsacC). Effects of agitation speed, temperature and pH on nattokinase production were investigated. Under the optimal conditions (500 r/min, 37℃, and natural pH), the maximum nattokinase activity reached 62.90 FU/mL, increased by 94% compared with the initial fermentation activity. On this basis, effects of feeding of glucose and mixed nitrogen sources on nattokinase production were evaluated. Feeding 1.5 g/(L·h) glucose, the biomass increased by 31%, and the nattokinase activity reached 71.23 FU/mL, which was 13% higher than that of control. In 50 L and 300 L bioreactor, the nattokinase fermentation activity reached 67.23 FU/mL and 72.33 FU/mL respectively, indicating that the nattokinase fermentation activity was relatively stable. This study provided the basis for industrialization of nattokinase.

nattokinase;Bacilluslicheniformisengineering strain; liquid fermentation; process optimization; pilot-plant test

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201601007

學(xué)士(魏雪團副教授為通訊作者,E-mail:weixuetuan@mail.hzau.edu.cn)。

湖北省自然科學(xué)基金項目(2014CFB943)

2015-07-24，改回日期：2015-10-13