沈繼朵　王聰　張莉　栗俞程

摘要：為獲得大量豬α干擾素的重組蛋白，研究了其發(fā)酵條件，并對目的蛋白進(jìn)行分離純化。考察了不同IPTG誘導(dǎo)濃度（0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.5 mmol/L）、不同誘導(dǎo)溫度（17、27、32、37 ℃）、不同誘導(dǎo)時(shí)間（0、2、3、4、5、6、7、8 h）對目的蛋白表達(dá)的影響;同時(shí)對包涵體進(jìn)行提取、溶解變性進(jìn)行研究，最后采用Ni柱親和層析純化目的蛋白。采用SDS-PAGE電泳及Image Pro Plus 6.0軟件分析電泳結(jié)果，結(jié)果顯示，IPTG誘導(dǎo)濃度為 1.0 mmol/L、誘導(dǎo)溫度為27 ℃、誘導(dǎo)時(shí)間為6 h時(shí)，目的蛋白表達(dá)量最多;超聲波破碎細(xì)菌的最優(yōu)時(shí)長循環(huán)為10 s/10 s;8 mol/L尿素溶解包涵體過夜可得到大量可溶性目的蛋白含量，Ni柱親和層析后可去除大量雜蛋白，獲得較純的目的蛋白?？梢姳驹囼?yàn)通過優(yōu)化重組豬α干擾素誘導(dǎo)表達(dá)條件及純化方法，獲得了高表達(dá)、高純度的重組豬α干擾素蛋白，為今后研究其生物活性奠定了初步基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：豬α干擾素;工程菌;誘導(dǎo)表達(dá);包涵體;純化

中圖分類號：S188 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）09-0214-04

干擾素（interferon，IFN）是動物細(xì)胞在受到某些病毒感染后，分泌的一種具有抗病毒功能的宿主特異性糖蛋白。通常根據(jù)產(chǎn)生干擾素的細(xì)胞不同將其分為Ⅰ、Ⅱ型干擾素，Ⅰ型干擾素主要包括α、β等6種，是由微生物、病毒等誘導(dǎo)產(chǎn)生，而Ⅱ型干擾素主要包括γ干擾素[1]。豬α干擾素是一種廣譜抗病毒藥，對豬的輪狀病毒腹瀉、流行性腹瀉、傳染性胃腸炎等病毒有較好的療效，可用于防治豬病毒性疾病[2]。傳統(tǒng)豬α干擾素表達(dá)量低、時(shí)間長，無法滿足防治疾病的要求，因而采用基因工程體外表達(dá)生產(chǎn)IFN-α，重組豬α干擾素是將豬α干擾素基因重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸埃希菌原核表達(dá)系統(tǒng)中[3]。目前，含有豬α干擾素基因的重組質(zhì)粒在大腸桿菌中如何高表達(dá)，如何獲得純度較高的α干擾素一直是研究領(lǐng)域的急需解決的一個(gè)問題。因此，本研究以表達(dá)豬α干擾素的基因工程重組大腸埃希菌BL21（DE3）為試驗(yàn)對象，主要考察了不同IPTG濃度、不同誘導(dǎo)溫度、不同誘導(dǎo)時(shí)間對目的蛋白含量的影響，并進(jìn)一步地研究如何將以包涵體形式存在的目的蛋白溶解，最后通過Ni柱親和層析純化了目的蛋白，旨在為后續(xù)研究重組豬α干擾素的生物活性及產(chǎn)業(yè)化開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株

重組大腸埃希工程菌BL21（DE3）/pET-32a-IFNα，購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 試劑

彩虹245廣譜蛋白Marker、雙色預(yù)染Marker、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、IPTG、氨芐青霉素（Amp）、尿素、鹽酸胍購自北京索萊寶科技有限公司;His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒（包涵體蛋白）購自康為世紀(jì)生物科技有限公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 重組豬α干擾素工程菌的誘導(dǎo)表達(dá)

1.3.1 不同濃度IPTG對目的蛋白表達(dá)量的影響 用接種環(huán)從-80 ℃保藏的工程菌甘油管中蘸取菌液1環(huán)，在含有Amp的LB固體平板上采用分三區(qū)劃線的方法進(jìn)行劃線接種，37 ℃ 過夜恒溫培養(yǎng)16 h。無菌操作挑取工程菌的單菌落，放入含5 μL Amp（終濃度為100 μg/mL）的5 mL液體培養(yǎng)基LB中，37 ℃、150 r/min過夜振蕩培養(yǎng)15 h。按1%的接種量分別接入7瓶含5 μL Amp（終濃度為100 μg/mL）的5 mL液體培養(yǎng)基LB中，另外1瓶按1%的接種量接入含6 μL Amp（終濃度為100 μg/mL）的6 mL液體培養(yǎng)基LB中，均于 37 ℃、150 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)至D600 nm約0.6時(shí)。從6 mL的LB液體培養(yǎng)基中，取出1 mL菌液作為未誘導(dǎo)對照。然后在8瓶都含有 5 mL LB液體培養(yǎng)基中，加入誘導(dǎo)劑IPTG，使IPTG終濃度分別為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.5 mmol/L，37 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)6 h。6 h后每瓶分別取出1 mL菌液，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，棄上清，留菌體沉淀。沉淀用80 μL雙蒸水吹散，加入20 μL 5×Loading Buffer，使樣品緩沖液和蛋白樣品充分混勻，然后將其置于沸水浴中煮沸 10 min。取上清10 μL進(jìn)行12% SDS-PAGE檢測表達(dá)量與IPTG濃度之間的關(guān)系。

1.3.2 不同濃度IPTG對目的蛋白表達(dá)量的影響 按“2.1.1”節(jié)的方法活化工程菌，挑取活化后的單菌落，放入含5 μL Amp（終濃度為100 μg/mL）的5 mL液體培養(yǎng)基LB中，37 ℃、150 r/min 過夜振蕩培養(yǎng)15 h。按1%的接種量分別接入4瓶含5 μL Amp（終濃度為100 μg/mL）的5 mL液體培養(yǎng)基LB中;于37 ℃、150 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)至D600 nm約0.6時(shí)，每瓶培養(yǎng)液中分別加入終濃度為1.0 mmol/L的IPTG，然后將4瓶菌液分別放入17、27、32、37 ℃ 4個(gè)不同溫度的恒溫?fù)u床中，150 r/min振蕩培養(yǎng)6 h。然后各取1mL菌液，菌液離心，樣品處理方法同“1.3.1”節(jié)中步驟，取上清10 μL進(jìn)行12% SDS-PAGE檢測表達(dá)量與誘導(dǎo)溫度之間的關(guān)系。

1.3.3 不同誘導(dǎo)溫度對目的蛋白表達(dá)量的影響

按“1.3.1”節(jié)的方法活化工程菌，挑取活化后的單菌落，放入含5 μL Amp（終濃度為100 μg/mL）的5 mL液體培養(yǎng)基LB中，37 ℃、150 r/min 過夜振蕩培養(yǎng)15 h。按1%的接種量分別接入含10 μL Amp（終濃度為100 μg/mL）的10 mL液體培養(yǎng)基LB中;于37 ℃、150 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)至D600 nm約0.6時(shí)，在培養(yǎng)液中加入終濃度為1.0 mmol/L的IPTG，取出1 mL作為未誘導(dǎo)對照。然后將菌液于27 ℃、150 r/min條件下振蕩培養(yǎng)，分別于2、3、4、5、6、7、8 h各取1 mL菌液，菌液離心，樣品處理方法同“1.3.1”節(jié)中步驟，取上清10 μL進(jìn)行12% SDS-PAGE檢測表達(dá)量與誘導(dǎo)時(shí)間之間的關(guān)系。

1.4 重組豬α干擾素蛋白的分離純化

1.4.1 不同超聲時(shí)間間隔對菌體破碎的影響

按“1.3.1”節(jié)的方法活化工程菌，挑取活化后的單菌落將放入含5 μL Amp（終濃度為100 μg/mL）的5 mL液體培養(yǎng)基LB中，37 ℃、150 r/min過夜振蕩培養(yǎng)15 h。按1%的接種量分別接入含150 μL Amp（終濃度為100 μg/mL）的150 mL液體培養(yǎng)基LB中;于37 ℃、150 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)至D600 nm約0.6時(shí)，加入終濃度為1.0 mmol/L的IPTG，于27 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)6 h。取50 mL菌液，共3管，于4 ℃，8 000 r/min離心 20 min，棄上清，得到菌體。稱取菌體細(xì)胞的濕質(zhì)量，按每 100 mg 菌體加入2 mL細(xì)菌蛋白萃取劑（含20 μL蛋白酶抑制劑），混合均勻，平均分到3管中，于4 ℃，功率30%，超聲波破碎時(shí)間間隔分別設(shè)置為5 s/5 s、3 s/3 s、10 s/10 s，破碎細(xì)胞20 min，然后4 ℃、8 000 r/min離心20 min，分離上清和沉淀，收集上清和沉淀，處理樣品后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，確定最佳超聲破碎菌體的時(shí)間。

1.4.2 不同條件溶解包涵體

按“1.3.1”節(jié)步驟得到的包涵體沉淀用5 mL 0.01 mmol/L的PBS磷酸鹽緩沖液吹散沉淀，洗滌菌體，采用4 ℃、8 000 r/min離心15 min，棄上清，留沉淀，重復(fù)此步驟2次。包涵體沉淀分別采用以下3種方式處理：（1）5 mL的Binding Buffer緩沖液（48 g尿素，0.5 mL Imidazole，16.7 mL NaCl，2 mL Tris-HCl，pH值7.9）重懸沉淀;（2）5 mL的6 mol/L鹽酸胍溶液重懸沉淀;（3）用5 mL的 8 mol/L 尿素溶液重懸沉淀;3種方法均采用超聲破碎10 min使其充分混勻，分別4 ℃過夜，然后8 000 r/min、4 ℃離心 20 min，分離收集上清和沉淀，處理樣品后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，確定最佳溶解包涵體的條件。

1.4.3 Ni柱親和層析純化目的蛋白

取誘導(dǎo)表達(dá)后的菌液離心收集菌體，采用10 s/10 s超聲條件超聲，采用8 mol/L尿素溶液過夜重懸包涵體沉淀使至溶解，然后溶解后的目的蛋白進(jìn)行Ni柱親和層析純化，按照His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒（包涵體蛋白）說明書進(jìn)行操作。用1.5 mL EP管分別收集Binding Buffer緩沖液沖洗層析柱的液體，Elution Buffer緩沖液洗脫層析柱的液體，每管約1 mL左右。挑取收集的樣品，處理樣品后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，方法同“1.3.1”節(jié)。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組豬α干擾素工程菌的誘導(dǎo)表達(dá)

2.1.1 不同IPTG濃度對目的蛋白表達(dá)的影響

構(gòu)建的重組α干擾素的分子量約為19 ku，從圖1左圖可以看出，在 19 ku 處，泳道10無目的蛋白，其余不同濃度IPTG均能誘導(dǎo)出目的蛋白，然后采用Image Pro Plus 6.0分析軟件對不同誘導(dǎo)濃度下的目的蛋白濃度進(jìn)行分析，結(jié)果如圖1柱狀圖所示，IPTG濃度為1.0 mmol/L時(shí)，目的蛋白含量最高，因此，在后續(xù)試驗(yàn)中選擇1.0 mmol/L作為最佳誘導(dǎo)濃度。

2.1.2 不同誘導(dǎo)溫度對目的蛋白表達(dá)的影響

根據(jù)不同IPTG濃度對目的蛋白表達(dá)的影響試驗(yàn)中結(jié)果，采用 1.0 mmol/L IPTG誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)，重組α干擾素的分子量約為19 ku，從圖2左圖可以看出，在17、27、32、37 ℃不同溫度下有誘導(dǎo)出目的蛋白，然后采用Image Pro Plus 6.0分析軟件對不同誘導(dǎo)溫度下的目的蛋白濃度進(jìn)行分析，結(jié)果如圖2右圖所示，誘導(dǎo)溫度為27 ℃時(shí)，目的蛋白含量最高，因此，在后續(xù)試驗(yàn)中選擇27 ℃作為最佳誘導(dǎo)溫度。

2.1.3 不同誘導(dǎo)時(shí)間對目的蛋白表達(dá)的影響

根據(jù)不同IPTG濃度和不同溫度對目的蛋白表達(dá)的影響試驗(yàn)中結(jié)果，采用1.0 mmol/L IPTG，誘導(dǎo)溫度27 ℃，誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)，重組α干擾素的分子量約為19 ku，從圖3左圖可以看出，在 2、3、4、5、6、7、8 h有誘導(dǎo)出目的蛋白，然后采用Image Pro Plus 6.0[CM（24*8]分析軟件對不同誘導(dǎo)時(shí)間下的目的蛋白濃度進(jìn)行分析，結(jié)果如圖3右圖所示，誘導(dǎo)時(shí)間為6 h時(shí)，目的蛋白含量最高，因此，在后續(xù)試驗(yàn)中我們選擇6 h作為最佳誘導(dǎo)時(shí)間。

2.2 重組豬α干擾素蛋白的分離純化

2.2.1 不同的超聲時(shí)間間隔對菌體破碎的影響

采用不同的超聲條件裂解菌體，獲得更多的目的蛋白，如圖4所示，菌體經(jīng)超聲裂解后，目的蛋白主要以包涵體形式存在沉淀中，上清中可溶行目的蛋白含量很少，在3種條件下，得到包涵體含量差異不明顯，所以為了能更多地裂解菌體得到包涵體，后續(xù)試驗(yàn)采用10 s/10 s超聲條件。

2.2.2 不同條件溶解包涵體

為了使目的蛋白以可溶性形式存在，采用3種不同條件溶解包涵體，溶解后取上清SDS-PAGE電泳。從圖5、圖6中可見，溶解后上清中蛋白含量較少，用鹽酸胍溶解包涵體后，目的蛋白仍主要以包涵體的形式存在;而采用8 mol/L尿素溶液過夜溶解包涵體，上清中可溶性的目的蛋白較多，包涵體基本被溶解變性，以可溶性的形式存在于溶液中（圖7），可用于后面的分離純化。

2.2.3 Ni柱親和層析純化目的蛋白

重組豬α干擾素工程菌在IPTG濃度為1.0 mmol/L，誘導(dǎo)溫度27 ℃，誘導(dǎo)6 h后，

目的蛋白含量最高，菌體經(jīng)采用10 s/10 s超聲裂解，用 8 mol/L 尿素溶液溶解包涵體，目的蛋白以可溶性的形式存在于溶液中，豬α干擾素重組質(zhì)粒帶有His標(biāo)簽，采用His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒（包涵體蛋白）對可溶性的目的蛋白進(jìn)行純化，去除雜蛋白，分別取樣品流出液、清洗液以及洗脫液電泳。從圖8可以看出，經(jīng)過Ni柱純化，大部分雜蛋白可以去除，得到較純的可溶性的目的蛋白。

3 討論

干擾素是細(xì)胞受到病毒或其他誘生劑的誘導(dǎo)分泌的糖蛋白，是細(xì)胞內(nèi)的一種重要細(xì)胞因子，具有抗病毒、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)活性。由于傳統(tǒng)干擾素表達(dá)量低、時(shí)間長，無法滿足防治疾病的要求，因而采用基因工程方法制備重組的干擾素，目前所知的重組干擾素表達(dá)系統(tǒng)主要有大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)、酵母表達(dá)系統(tǒng)、動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)等[4-6]。其中研究較為深入的是大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，該系統(tǒng)具有培養(yǎng)條件簡單、易操作、培養(yǎng)周期較短、成本相對低、產(chǎn)量高、易于規(guī)?；扔袃?yōu)點(diǎn)，但也存在其不足之處——表達(dá)的蛋白常以包涵體的形式存在，需要對其進(jìn)行變性、復(fù)性處理。外界表達(dá)許多條件對重組蛋白的表達(dá)具有重要的影響。大腸桿菌是利用乳糖操縱子作為啟動子表達(dá)下游基因，需要乳糖作為誘導(dǎo)物進(jìn)行誘導(dǎo)，但是因?yàn)榇竽c桿菌可利用乳糖，所以，目的基因表達(dá)不能夠被持續(xù)誘導(dǎo)。而IPTG結(jié)構(gòu)上與乳糖相似，可以代替乳糖且不會被大腸桿菌利用，外源基因也可以持續(xù)表達(dá)，但是不同誘導(dǎo)濃度對目的蛋白表達(dá)量有影響。另外誘導(dǎo)溫度對目的蛋白表達(dá)也有重要影響，高溫不利于蛋白結(jié)構(gòu)的形成，溫度太低不利于菌體生長，影響外源蛋白表達(dá)量;誘導(dǎo)時(shí)間的長度對目的蛋白的表達(dá)也具有至關(guān)重要的作用，隨著時(shí)間的推遲，目的蛋白也可能被酶降解[7]。本研究首先對不同IPTG濃度、誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時(shí)間進(jìn)行摸索，以期找到最佳的目的蛋白表達(dá)條件。通過SDS-PAGE的凝膠電泳最終確定使目的蛋白表達(dá)最高的最適IPTG濃度為1.0 mmol/L，最適溫度為27 ℃，最適誘導(dǎo)時(shí)間為6 h。

為了使目的蛋白充分從菌體中釋放出來，本研究采用超聲波破碎法提取目的蛋白，超聲波破碎法利用聲波在液體介質(zhì)中形成很多小氣泡，當(dāng)小氣泡炸裂，會產(chǎn)生很強(qiáng)的能量以及熱量，從而起到破碎細(xì)胞等物質(zhì)的作用[8]。本研究對比了不同的超聲時(shí)間間隔（5 s/5 s，3 s/3 s，10 s/10 s）對菌體破碎的影響試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果顯示上清比沉淀的條帶顏色淺得多，目的蛋白主要以不溶性包涵體形式存在于沉淀中，在3種條件下得到包涵體沉淀量無明顯差異，最終為了讓菌體裂解充分，選擇在10 s/10 s條件下裂解菌體。

包涵體是一種不溶性的蛋白質(zhì)顆粒，一般是由于表達(dá)的蛋白合成速度太快，進(jìn)行錯(cuò)誤折疊，形成錯(cuò)配二硫鍵，彼此之間非特異性結(jié)合，沒有達(dá)到足夠的溶解度，從而形成沉淀。需要對沉淀中的包涵體作出變性處理，使之溶解在上清中，才能進(jìn)行最后的純化試驗(yàn)[8]。首先采用包涵體提取試劑盒中的Binding Buffer緩沖液溶解包涵體，可以看出上清中條帶的顏色非常淺，說明包涵體未充分溶解;采用鹽酸胍溶解包涵體，可以看出，整個(gè)圖片的條帶都是扭曲的，這是由于鹽酸胍電泳時(shí)與SDS結(jié)合形成沉淀，造成蛋白無法進(jìn)行SDS-PAGE電泳以及親和層析，否則會損壞層析柱，且蛋白上的鹽酸胍無法有效除去。故采用8 mol/L尿素過夜溶解包涵體，試驗(yàn)結(jié)果可以很明顯地看出，尿素溶解后的上清目的蛋白條帶顏色很深，說明尿素處理后可溶性的目的蛋白含量較多，而沉淀中目的蛋白含量卻很少，因此，最終采用8 mol/L尿素過夜溶解包涵體，為后續(xù)純化奠定基礎(chǔ)。

重組大腸埃希工程菌[BL21（DE3）/pET-32a-IFNα]His（組氨酸）標(biāo)簽，采用了Ni柱親和層析純化目的蛋白[9]。在試驗(yàn)過程中，當(dāng)尿素和Binding Buffer混合液通過層析柱時(shí)，帶有His標(biāo)簽的目的蛋白就會與鎳離子吸附而滯留在層析柱中。而雜蛋白不會被吸附，直接流出，就可以與目的蛋白分開，然后用含有較低咪唑濃度的Binding Buffer緩沖液（His標(biāo)簽與鎳離子的結(jié)合力沒有咪唑與鎳離子的結(jié)合力強(qiáng)）將與柱子結(jié)合不緊密的雜蛋白洗脫下來，再用含有較高咪唑濃度的Elution Buffer洗脫液將結(jié)合緊密的目的蛋白洗脫下來，采用此種方法蛋白純度可以達(dá)到相對較高的程度。試驗(yàn)結(jié)果顯示，泳道2、3是尿素和Binding Buffer緩沖液混合后過柱子流出的，目的蛋白結(jié)合在柱子上，雜蛋白沒結(jié)合上去，因此洗掉很多雜蛋白。泳道4、5、6是Binding Buffer緩沖液洗脫柱子后流出的，而雜蛋白在前面已經(jīng)被洗掉，因此此處的雜蛋白含量少（有部分雜蛋白也結(jié)合在柱子上，但連接不緊密），條帶顏色有些淡。又因?yàn)橛糜谶^柱子的蛋白比較多，所以此處有些未結(jié)合在柱子上的目的蛋白被洗脫下來。泳道7、8、9是Elution Buffer洗脫液洗脫下來的蛋白，可以看出目的蛋白很多，雜蛋白很少，蛋白純度相對較高，實(shí)現(xiàn)純化目的蛋白的目的。

綜上，本研究使目的蛋白表達(dá)量最多的IPTG誘導(dǎo)濃度為1.0 mmol/L、誘導(dǎo)溫度為27 ℃、誘導(dǎo)時(shí)間為6 h;超聲波破碎細(xì)菌的最優(yōu)時(shí)長循環(huán)為10 s/10 s;8 mol/L尿素溶解包涵體過夜可得到大量可溶性目的蛋白含量，Ni柱親和層析后可去除大量雜蛋白，為后續(xù)研究重組豬α干擾素的生物活性及產(chǎn)業(yè)化開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

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