曹承旭，趙春燕，馬　越，趙曉燕，張　超

（1.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧沈陽(yáng)　110866；2.北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心，果蔬農(nóng)產(chǎn)品保鮮與加工北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部華北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部都市農(nóng)業(yè)（北方）重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京　100097）

復(fù)合風(fēng)味蛋白酶提取籽瓜種子蛋白工藝的優(yōu)化

曹承旭1，趙春燕1，馬越2，趙曉燕2，*張超2

（1.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧沈陽(yáng)110866；2.北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心，果蔬農(nóng)產(chǎn)品保鮮與加工北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部華北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部都市農(nóng)業(yè)（北方）重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100097）

以加酶量、酶解溫度、酶解時(shí)間為影響因素，蛋白質(zhì)提取率為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)三因素三水平的響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化復(fù)合風(fēng)味蛋白酶提取籽瓜種子蛋白質(zhì)的提取工藝。結(jié)果顯示，加酶量對(duì)蛋白質(zhì)提取率影響最大，其次是酶解溫度和酶解時(shí)間。響應(yīng)面分析模型顯示，籽瓜種子蛋白質(zhì)提取最佳工藝為加酶量0.22%，酶解溫度59℃，酶解時(shí)間3.29 h，在該工藝下籽瓜種子蛋白質(zhì)提取率為98.2%，與實(shí)際蛋白質(zhì)提取率的相對(duì)偏差僅為0.80%，該模型真實(shí)可靠。

蛋白質(zhì)；提??；籽瓜種子；復(fù)合風(fēng)味蛋白酶

0　引言

籽瓜又名打瓜，葫蘆科，一年生草本植物［1］，主要取籽炒制而食。籽瓜種子含有蛋白質(zhì)、脂肪、VB 和VD等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)［2］，其蛋白質(zhì)含量達(dá)30%～45%［3］。本項(xiàng)目組前期比較發(fā)現(xiàn)籽瓜種子中蛋白質(zhì)含量高于大豆、花生和葵花籽，并且其中必需氨基酸配比比大豆更接近于FAO推薦比例［4］，因此籽瓜種子是一種優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)資源。

酶法提取蛋白質(zhì)的最大優(yōu)勢(shì)在于獲得蛋白質(zhì)資源的同時(shí)，改善蛋白質(zhì)的溶解性和生理功能特性，拓寬蛋白質(zhì)的應(yīng)用領(lǐng)域［5］。本項(xiàng)目組前期考察了4種蛋白酶對(duì)籽瓜種子蛋白質(zhì)提取率的影響，發(fā)現(xiàn)堿性蛋白酶提取率最高，其次是復(fù)合風(fēng)味蛋白酶和中性蛋白酶［6］。但是，堿性蛋白酶在水解過(guò)程中常常會(huì)產(chǎn)生苦味肽［7］。而采用復(fù)合風(fēng)味蛋白酶水解大豆和肉類蛋白質(zhì)后，水解液中亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、蘇氨酸等支鏈氨基酸含量，以及谷氨酸、天門冬氨酸、甘氨酸等呈味氨基酸含量豐富，未發(fā)現(xiàn)苦味肽［8-10］。因此，項(xiàng)目組以籽瓜種子為原料，利用復(fù)合風(fēng)味蛋白酶提取籽瓜種子蛋白質(zhì)。研究采用單因素試驗(yàn)結(jié)合響應(yīng)面中心組和試驗(yàn)設(shè)計(jì)，研究酶解工藝對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響，獲得最佳籽瓜種子蛋白提取工藝，為籽瓜種子蛋白質(zhì)的開發(fā)利用提供數(shù)據(jù)及理論支持。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

籽瓜種子，新疆九豐種業(yè)有限責(zé)任公司提供；復(fù)合風(fēng)味蛋白酶，江蘇銳陽(yáng)生物科技有限公司提供。

1.2儀器與設(shè)備

RT5型加熱磁力攪拌器，德國(guó)IKA公司產(chǎn)品；AL204型電子天平、FE20型實(shí)驗(yàn)pH計(jì)，METTLER TOLEDO公司產(chǎn)品；3-18K型冷凍離心機(jī)，德國(guó)SIGMA公司產(chǎn)品；FW100型萬(wàn)能粉碎機(jī)，天津泰斯特儀器有限公司產(chǎn)品。

1.3蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法

采用凱氏定氮法測(cè)定籽瓜種子總蛋白含量；采用考馬斯亮藍(lán)方法測(cè)定提取液中蛋白質(zhì)含量［11］。

1.4工藝流程

籽瓜種子去殼后利用萬(wàn)能粉碎機(jī)打碎，采用正己烷脫脂［12］，干燥后獲得籽瓜種子脫脂粉，取20 g脫脂粉按一定料液比混合、攪拌，利用0.1 mol/LNaOH溶液調(diào)節(jié)混合液pH值，使用水浴鍋控制混合液溫度，當(dāng)pH值與溫度達(dá)到設(shè)定條件后，按照一定比例加入復(fù)合風(fēng)味蛋白酶繼續(xù)攪拌，同時(shí)監(jiān)控水解液的pH值和溫度，每30 min將混合液pH值調(diào)節(jié)至設(shè)定pH值，提取結(jié)束后迅速將混合液加熱至100℃，保持5 min，然后將混合液以轉(zhuǎn)速8 000 r/min離心20 min，測(cè)定上清液的體積和蛋白質(zhì)含量，蛋白質(zhì)提取率的計(jì)算如下。

1.5單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

分別考察料液比、加酶量、酶解溫度、酶解pH值和酶解時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響。①料液比，取料液比1∶4，1∶6，1∶8，1∶10，1∶12，加酶量0.1%，酶解溫度50℃，酶解pH值7，酶解時(shí)間3 h；②加酶量，按加酶量0.05%，0.10%，0.20%，0.30%加入復(fù)合風(fēng)味蛋白酶，料液比1∶8，酶解溫度50℃，酶解pH值7，酶解時(shí)間3 h；③酶解溫度，按溫度30，40，50，60℃進(jìn)行酶解，料液比1∶8，加酶量0.10%，酶解pH值7，酶解時(shí)間3 h；④酶解pH值，按pH值4，5，6，7，8進(jìn)行酶解，料液比1∶8，加酶量0.10%，酶解溫度50℃，酶解時(shí)間3 h；⑤酶解時(shí)間，按時(shí)間4，5，6，7，8 h進(jìn)行酶解，料液比1∶8，加酶量0.10%，酶解溫度50℃，酶解pH值7。

1.6響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素研究的基礎(chǔ)上，選取加酶量、酶解溫度、酶解時(shí)間為自變量，以蛋白質(zhì)提取率為響應(yīng)值，優(yōu)化籽瓜種子蛋白提取工藝的最佳參數(shù)，采用SAS 9.2統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1　響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)

2　結(jié)果與分析

2.1料液比對(duì)籽瓜種子蛋白質(zhì)提取率的影響

料液比對(duì)籽瓜種子蛋白質(zhì)提取率的影響見(jiàn)圖1。

圖1　料液比對(duì)籽瓜種子蛋白質(zhì)提取率的影響

由圖1可知，當(dāng)料液比達(dá)到1∶10之前，蛋白質(zhì)提取率隨著料液比增大而增大；當(dāng)料液比超過(guò)1∶10之后趨于平緩。水酶法提取蛋白質(zhì)過(guò)程中水量的增加對(duì)酶解有著積極的作用，但是過(guò)量的水會(huì)導(dǎo)致酶與底物的相對(duì)含量變少，以致酶與底物接觸幾率降低，酶解的作用變差［13］，所以選擇料液比1∶10最為適宜。

2.2加酶量對(duì)籽瓜種子蛋白質(zhì)提取率的影響

加酶量對(duì)籽瓜種子蛋白質(zhì)提取率的影響見(jiàn)圖2。

圖2　加酶量對(duì)籽瓜種子蛋白質(zhì)提取率的影響

由圖2可知，隨著加酶量的增大，酶與底物的作用就越充分，但是考慮到復(fù)合風(fēng)味蛋白酶的價(jià)格較為昂貴，所以選擇加酶量在0.20%時(shí)提取籽瓜種子蛋白質(zhì)最為合適。

2.3酶解溫度對(duì)籽瓜種子蛋白質(zhì)提取率的影響

酶解溫度對(duì)籽瓜種子蛋白質(zhì)提取率的影響見(jiàn)圖3。

由圖3可知，隨著酶解溫度的增加，蛋白質(zhì)的提取率逐漸增大。但是酶解溫度過(guò)高可能會(huì)使酶發(fā)生變性，因而導(dǎo)致蛋白質(zhì)提取率降低，所以當(dāng)酶解溫度在60℃時(shí)提取籽瓜種子蛋白質(zhì)最為適宜。

圖3　酶解溫度對(duì)籽瓜種子蛋白質(zhì)提取率的影響

2.4酶解pH值對(duì)籽瓜種子蛋白質(zhì)提取率的影響

酶解pH值對(duì)籽瓜種子蛋白質(zhì)提取率的影響見(jiàn)圖4。

圖4　酶解pH值對(duì)籽瓜種子蛋白質(zhì)提取率的影響

由圖4可知，隨著溶液初始酶解pH值的增大，籽瓜種子蛋白質(zhì)的提取率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)；當(dāng)達(dá)到酶解pH值7之后呈下降趨勢(shì)。說(shuō)明在復(fù)合風(fēng)味蛋白酶水解過(guò)程中，保持水解液的酶解pH值7最為適宜。

2.5酶解時(shí)間對(duì)籽瓜種子蛋白質(zhì)提取率的影響

酶解時(shí)間對(duì)籽瓜種子蛋白質(zhì)提取率的影響見(jiàn)圖5。

圖5　酶解時(shí)間對(duì)籽瓜種子蛋白質(zhì)提取率的影響

由圖5可知，隨著酶解時(shí)間的增加，蛋白質(zhì)的提取率先升高后降低，在酶解時(shí)間3 h時(shí)蛋白質(zhì)的提取率達(dá)到最大。由于在水解的過(guò)程中，酶主要作用于細(xì)胞壁和原生質(zhì)，使細(xì)胞原生質(zhì)內(nèi)的蛋白質(zhì)與油一同溶出，隨著酶解時(shí)間的增加，油不斷地流出，使得水溶液體系中形成乳化層，最終導(dǎo)致蛋白質(zhì)提取率降低。因此，最適的酶解時(shí)間為3 h。

2.6響應(yīng)面分析方案與結(jié)果

將所得的試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SAS 9.2軟件進(jìn)行多元回歸擬合，得到以蛋白質(zhì)提取率為目標(biāo)函數(shù)的二次回歸方程：

Y=98.19+10.40A-9.86B+4.72C+6.57AB+8.54AC+ 9.12BC-26.90A2-30.72B2-10.14C2.

復(fù)合風(fēng)味蛋白酶水解提取籽瓜種子蛋白響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，回歸方程的方差分析見(jiàn)表3。

表2　復(fù)合風(fēng)味蛋白酶水解提陬籽瓜種子蛋白響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

表3　回歸方程的方差分析

方程因變量與自變量之間的線性關(guān)系明顯，該模型回歸顯著（p＜0.001），失擬項(xiàng)不顯著，并且該模型R2=96.9%，R2Adj=92.8%說(shuō)明該模型與試驗(yàn)擬合良好，自變量與響應(yīng)值之間線性關(guān)系顯著，試驗(yàn)誤差小，可以用此模型來(lái)分析和預(yù)測(cè)水酶法提取籽瓜種子蛋白的結(jié)果。由此可以認(rèn)為，上面給出的二次回歸方程模型是合適的。由F檢驗(yàn)可以得到因素貢獻(xiàn)率為A＞B＞C，即加酶量＞酶解溫度＞酶解時(shí)間。

加酶量和酶解溫度對(duì)籽瓜種子蛋白質(zhì)提取率影響見(jiàn)圖6。

圖6　加酶量和酶解溫度對(duì)籽瓜種子蛋白質(zhì)提取率影響

在選取的各因素范圍內(nèi)，通過(guò)Design Expert軟件分析，圖6顯示不同交互作用對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響，在試驗(yàn)范圍內(nèi)尋找蛋白質(zhì)提取率最高點(diǎn)為加酶量0.22%，酶解溫度59℃，酶解時(shí)間3.29 h，蛋白質(zhì)提取率的預(yù)測(cè)值為99.0%。按最優(yōu)組合方案中的提取條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，重復(fù)3次，取平均值，測(cè)得籽瓜種子蛋白質(zhì)提取率為98.2%，與理論值99.0%接近，其相對(duì)誤差為0.80%，進(jìn)一步驗(yàn)證了數(shù)學(xué)回歸模型的正確性。

3　結(jié)論

研究以加酶量、酶解溫度、酶解時(shí)間為影響因子，以蛋白質(zhì)提取率為響應(yīng)值，結(jié)果顯示加酶量對(duì)蛋白質(zhì)提取率影響最大，其次是酶解溫度和酶解時(shí)間；響應(yīng)面分析模型顯示籽瓜種子蛋白質(zhì)提取的最佳工藝為加酶量0.22%，酶解溫度59℃，酶解時(shí)間3.29 h，在該工藝下籽瓜種子蛋白質(zhì)提取率為98.2%，與實(shí)際蛋白質(zhì)提取率的相對(duì)偏差僅為0.80%，模型真實(shí)可靠。

［1］谷雅卿.黑瓜子 ［J］.農(nóng)業(yè)科學(xué)實(shí)驗(yàn)，1982（3）：34-35.

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Optimization of Protein Extraction from Seed of Seed-watermelon by Flavourzyme

CAO Chengxu1，ZHAO Chunyan1，MA Yue2，ZHAO Xiaoyan2，*ZHANG Chao2
（1.College of Food Science，Shenyang Agricultural Univrtsity，Shenyang，Liaoning 110866，China；2.Beijing Vegetable Research Center，Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences；Beijing Key Laboratory of Fruits and Vegetable Storage and Processing；Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Horticultural Crops（North China），Ministry of Agriculture；Key Laboratory of Urban Agriculture（North），Ministry of Agriculture，Beijing 100097，China）

The protein extraction from the seed of seed-watermelon by flavourzyme is optimized by surface respond experiment. The protein extraction process is optimized by the response surface of 3 factors and 3 levels.Results indicate that the enzyme amount is the key factor on the protein extraction rate，followe by enzymatic hydrolysis temperature and hydrolysis time.The optimum extraction parameters is the enzyme amount of 0.22%，temperature of 59℃，and enzyme hydrolysis time of 3.29 h. The protein extraction rate reaches 98.2%under the optimum parameters.The validation experiment proved that the surface respond model is reliable with the relative deviation of 0.80%.

protein；extraction；the seed of seed-watermelon seed；flavourzyme

TS201

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2016.08.011

1671-9646（2016）08a-0033-04

2016-06-01

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金項(xiàng)目（CARS-26&CARS-25）；北京市農(nóng)林科學(xué)院科技創(chuàng)新能力建設(shè)專項(xiàng)新學(xué)科培養(yǎng)項(xiàng)目（KJCX20140204）；果蔬農(nóng)產(chǎn)品保鮮與加工北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目（Z141105004414037）。

曹承旭（1992— ），女，碩士，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)。

張超（1978— ），男，博士，副研究員，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品加工。