劉漢杰，付　彬，付愛玲，付　琛

(西南大學(xué)藥學(xué)院，重慶　400716)

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多吡啶釕配合物[(Phen)2Ru(dppz)](PF6)2的抗菌活性及機制研究

劉漢杰，付彬，付愛玲，付琛

(西南大學(xué)藥學(xué)院，重慶400716)

目的研究多吡啶釕配合物[(Phen)2Ru(dppz)](PF6)2的抗菌活性，并進(jìn)一步探討其作用機制。方法采用最小抑菌濃度(MIC)以及最小殺菌濃度(MBC)，測定無機配合物[(Phen)2Ru(dppz)](PF6)2的抗菌活性。為了闡明其抗菌機制，首先利用配合物自身熒光特性和核酸染料對DNA的競爭性結(jié)合所導(dǎo)致的熒光強度變化，以確定配合物與DNA的結(jié)合能力；然后通過DNA凝膠電泳，檢測配合物與細(xì)菌基因組DNA結(jié)合后產(chǎn)生的效果以檢測抗菌活性的機制。結(jié)果多吡啶釕配合物[(Phen)2Ru(dppz)](PF6)2對大腸桿菌以及金黃色葡萄球菌具有較強的抗菌活性，最小抑菌濃度達(dá)0.2～0.4 g·L-1。熒光檢測顯示，配合物能夠與細(xì)菌DNA發(fā)生結(jié)合，以此為基礎(chǔ)，配合物能夠干擾細(xì)菌的轉(zhuǎn)錄過程，抑制細(xì)菌生長。結(jié)論本研究證明了多吡啶釕配合物[(Phen)2Ru(dppz)](PF6)2的抗菌活性及作用機制，為其進(jìn)一步開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

多吡啶釕配合物；抑菌活性；熒光檢測；代謝活性；DNA結(jié)合；DNA降解

由于抗生素的不合理應(yīng)用甚至濫用，導(dǎo)致產(chǎn)生了比較嚴(yán)重的耐藥問題。該問題已成為目前全球最緊迫的公共衛(wèi)生挑戰(zhàn)之一[1-4]。開發(fā)新型化學(xué)結(jié)構(gòu)和機制的高效抗菌藥物，已是目前公認(rèn)的解決耐藥性問題的主要途徑。金屬配合物類藥物曾被人們應(yīng)用于疾病診療[4,9-10]，其中多吡啶釕配合物由于具有良好的熱力學(xué)穩(wěn)定性，光物理、光化學(xué)活性等，近年來越來越受到人們的關(guān)注。由于多吡啶釕配合物有較好的DNA結(jié)合能力，能夠與之結(jié)合阻止DNA的復(fù)制、合成，甚至于直接破壞DNA，我們及同行在對其抗腫瘤方面進(jìn)行了深入的研究[5-10]。然而，目前尚缺乏對這類配合物，尤其是單核的多吡啶釕配合物，在抗微生物方面的研究。本研究將在以往的基礎(chǔ)上，證明多吡啶釕配合物[(Phen)2Ru(dppz)](PF6)2的抗菌活性，這將更大地擴寬該配合物的應(yīng)用。

據(jù)Barton等[12-13]報道，多吡啶釕配合物[(Phen)2Ru(dppz)](PF6)2具有較好的DNA結(jié)合能力，其機制是通過與DNA結(jié)構(gòu)中的小溝槽進(jìn)行結(jié)合，并且插入DNA鏈的骨架中，產(chǎn)生對于DNA結(jié)構(gòu)的破壞。以此為切入點，我們通過計算機模擬后，推測該配合物也能夠較好地與細(xì)菌DNA結(jié)合，并達(dá)到抑菌效果，見Fig 1。本實驗通過肉湯稀釋法驗證了配合物[(Phen)2Ru(dppz)](PF6)2的抑菌活性，利用熒光顯微鏡確定配合物在細(xì)菌內(nèi)的代謝情況，然后采用熒光分光光度法以及凝膠電泳的方法，測定和觀察該配合物與細(xì)菌DNA的結(jié)合情況，以闡明其抗菌活性的機制。

Fig 1　The computer imitation image of two hexafluoro-phosphate counterions are omitted for clarity

A:Chemical structure of[(Phen)2Ru(dppz)];B:The insertion situation of complex and DNA, which analyzed by computer simulation

1　材料與方法

1.1材料與儀器

1.1.1儀器YXQ-LS-50高壓蒸汽滅菌鍋(上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)，SW-CJ系列超凈工作臺(安泰公司)，F(xiàn)2500熒光分光光度儀(HITACHI)，TGL-16M高速臺式冷凍離心機(湘儀儀器有限公司)，AB135-S 電子分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)， HE33小型水平電泳槽(Hoefer)，DYY-10C電泳儀(北京六一儀器廠)，ChemiDoc MP凝膠成像儀器(Bio-rad)。

1.1.2試劑根據(jù)文獻(xiàn)合成多吡啶釕配合物[(Phen)2Ru(dppz)](PF6)2[14]，細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(天根生物有限公司)，核酸染料Gold View(天根生物有限公司)。

1.1.3實驗細(xì)菌大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(EscherichiacoliATCC35218)、金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(StaphylocccusaureusATCC25923)，購于重慶藥檢所。以上菌種均使用肉湯培養(yǎng)基(Luria-Bertani，LB培養(yǎng)基)。

1.2方法

1.2.1配合物最小抑菌、殺菌濃度(MIC/MBC)測定本實驗中各配合物的抑菌活性，按照文獻(xiàn)[3]，通過肉湯稀釋法實驗進(jìn)行測定。最小殺菌濃度(MBC)測定，按照文獻(xiàn)[3]中方法進(jìn)行。

1.2.2配合物在細(xì)菌菌體內(nèi)代謝活性觀察將1 mL隔夜培養(yǎng)的大腸桿菌菌液，與1 μL配合物(40 g·L-1)共同孵育2 h后，使用無菌生理鹽水進(jìn)行3次以上清洗以及離心。將菌體稀釋后置于載玻片上，于熒光顯微鏡下以16倍數(shù)進(jìn)行觀察，以觀察配合物是否進(jìn)入細(xì)菌菌體內(nèi)部產(chǎn)生熒光。

1.2.3配合物與DNA結(jié)合能力測定將大腸桿菌DNA提取出來，與0.1 g·L-1的配合物進(jìn)行孵育。大腸桿菌基因組DNA濃度分別為0～0.2 g·L-1。配合物與DNA的孵育條件為：37℃水浴1 h。然后，以熒光分光光度儀對其進(jìn)行測定。測定條件為：吸收波長為400 nm，發(fā)射波長為587 nm。記錄測定結(jié)果，以觀察配合物與DNA結(jié)合情況。

為了進(jìn)一步證明各配合物與細(xì)菌DNA的結(jié)合能力，測定其是否與核酸染料Gold View產(chǎn)生對于DNA的競爭性結(jié)合。在本實驗中，我們將400 μL大腸桿菌DNA溶液與2 μL核酸染料Gold View事先進(jìn)行孵育結(jié)合，再逐漸加入不同濃度配合物[(Phen)2Ru(dppz)](PF6)2(0、0.1、0.2、0.4 g·L-1)，37 ℃孵育1 h。接著使用熒光分光光度儀進(jìn)行測定和結(jié)果記錄。

1.2.4配合物與DNA結(jié)合效果的測定凝膠薄層電泳是一種常用的分析DNA片段的方法。同樣，也能夠通過DNA電泳產(chǎn)生的拖尾、條帶消失等現(xiàn)象，觀察到由于這種配合物的結(jié)合而產(chǎn)生的DNA損傷以及降解作用[15]。將大腸桿菌DNA提取出來備用。取濃度為0.4 g·L-1的配合物DMSO溶液4、2、1、0 μL分別加至DNA溶液中，合并為20 μL，然后于37 ℃水浴1 h。結(jié)束后，以未經(jīng)處理過的大腸桿菌DNA為對照組進(jìn)行電泳，接著以凝膠成像儀對結(jié)果進(jìn)行觀察記錄。

2　結(jié)果

2.1體外抗菌活性配合物[(Phen)2Ru(dppz)](PF6)2的體外抑菌活性經(jīng)過MIC及MBC實驗測定后，結(jié)果如Fig 2所示。結(jié)果表明，配合物[(Phen)2Ru(dppz)](PF6)2對革蘭陰性菌大腸桿菌以及革蘭陽性菌金黃色葡萄球菌均具有較好的抑菌以及殺菌活性。對于大腸桿菌來說，最小抑菌濃度為0.2 g·L-1，最小滅菌濃度為0.3 g·L-1。對于金黃色葡萄球菌來說，最小抑菌濃度為0.4 g·L-1，最小滅菌濃度為0.6 g·L-1。而且經(jīng)過多次實驗后發(fā)現(xiàn)，配合物對于大腸桿菌的抗菌效果要普遍優(yōu)于金黃色葡萄球菌。

Fig 2　MIC and MBC value of[(Phen)2Ru(dppz)](PF6)2on different kinds of bacteria

2.2配合物在細(xì)菌菌體內(nèi)代謝活性測定為了研究配合物在細(xì)菌菌體內(nèi)部產(chǎn)生抑制作用的機制，首先應(yīng)對配合物在細(xì)菌菌體內(nèi)的代謝活性進(jìn)行研究。將大腸桿菌隔夜培養(yǎng)后，與配合物在37 ℃下共同孵育2 h，通過熒光顯微鏡對細(xì)菌菌體進(jìn)行觀察，見Fig 3。在顯微鏡下，培養(yǎng)的大腸桿菌呈橢球形。加入配合物并孵育后，熒光顯微鏡下菌體內(nèi)呈現(xiàn)紅色熒光，而培養(yǎng)基中無明顯熒光出現(xiàn)，表明配合物可快速進(jìn)入菌體，并在菌體內(nèi)濃集，為進(jìn)一步探討配合物與細(xì)菌DNA結(jié)合情況提供實驗基礎(chǔ)。

2.3配合物與DNA結(jié)合能力測定結(jié)果由于配合物能夠進(jìn)入細(xì)菌菌體并進(jìn)行富集，因而直接提取大腸桿菌DNA并與配合物[(Phen)2Ru(dppz)](PF6)2孵育1 h。隨著DNA濃度升高，配合物熒光強度明顯下降，見Fig 4。說明該配合物可能與DNA進(jìn)行結(jié)合后發(fā)生電子轉(zhuǎn)移，從而造成熒光強度的減弱。但是由于各配合物結(jié)構(gòu)存在差異，也存在隨DNA濃度增加，熒光強度上升的情況[15,17]。因而需要進(jìn)一步的實驗對其結(jié)合情況進(jìn)行驗證。

Fig 3　Fluorescent image of E.coli after incubation with compound for 2 h observed by fluorescent microscope　(magnification×16)

A:The image of bacteria taken for a fluorescent picture;B:The image of bacteria taken in the white light;C:The merged image of these two pictures

Fig 4　The emission spectra of complex

由于多吡啶釕配合物之間存在結(jié)構(gòu)差異，與DNA結(jié)合后，熒光強度增加或者減少的趨勢不同。不能夠單純憑借上一實驗數(shù)據(jù)判斷配合物是否與DNA發(fā)生了結(jié)合，因而為進(jìn)一步對結(jié)合情況進(jìn)行研究，將已經(jīng)與核酸染料Gold View發(fā)生結(jié)合的大腸桿菌DNA與配合物[(Phen)2Ru(dppz)](PF6)2再次進(jìn)行孵育，結(jié)果見Fig 5。通過Fig 5可以發(fā)現(xiàn)，隨著配合物的逐漸加入，核酸染料Gold View的熒光強度逐漸減弱。由于核酸染料僅在與DNA結(jié)合后才能夠產(chǎn)生熒光，因而通過其熒光強度的減弱可以說明核酸染料與DNA的結(jié)合被加入的配合物競爭性取代。通過配合物與核酸染料的競爭性結(jié)合可以進(jìn)一步證明配合物與DNA發(fā)生了結(jié)合。

2.4配合物與DNA結(jié)合效果的測定經(jīng)過以上的實驗可以得出配合物[(Phen)2Ru(dppz)](PF6)2能夠與DNA發(fā)生較好的結(jié)合。而從計算機模擬結(jié)果可知該配合物具有能夠嵌入DNA雙鏈結(jié)構(gòu)內(nèi)部的能力[9]，從而對DNA造成破壞，形成抑菌的作用。因而需要進(jìn)一步進(jìn)行凝膠電泳，直觀地觀察配合物與DNA結(jié)合的狀況。如Fig 6所示，配合物[(Phen)2Ru(dppz)](PF6)2與DNA結(jié)合效果明顯。b、c組分別含有濃度為2 g·L-1以及1 g·L-1配合物，d組為37 ℃水浴1 h未加入配合物的DNA組。從結(jié)果可以觀察到，由于配合物對DNA的切割降解作用，未能夠產(chǎn)生明顯的DNA條帶。而未加入配合物僅在同樣條件下孵育的DNA未產(chǎn)生降解效果，說明配合物能夠通過嵌入DNA雙鏈內(nèi)部造成DNA的破壞。

Fig 5　Emission spectra of different concentrations of complex[(Phen)2Ru(dppz)](PF6)2 after combined

Fig 6　Gel electrophoresis of

A:Marker;b～d:DNA combined with complex[(Phen)2Ru(dppz)](PF6)2with different concentrations; e:Blank group,DNA with no treatment

3　討論

多吡啶釕配合物具有較好的生物活性，近年來在抗腫瘤方面的研究較多。雖然在多年以前Dwyer等[11]就對其抑菌活性以及細(xì)胞毒性做過報道，但是對于其產(chǎn)生抑菌活性的機制卻沒有進(jìn)行詳細(xì)的研究。最近有文獻(xiàn)報道，多吡啶釕配合物能夠與DNA結(jié)合抑制癌細(xì)胞生長[16]。因而，本實驗以此為切入點，進(jìn)行多吡啶釕配合物[(Phen)2Ru(dppz)](PF6)2對于細(xì)菌DNA的結(jié)合能力研究，以探討該配合物的抑菌機制。

本文實驗結(jié)果，經(jīng)肉湯稀釋法測定多吡啶釕配合物抑菌效果較為理想，最小抑菌濃度為0.4 g·L-1。通過熒光顯微鏡觀察后，能夠看見細(xì)菌菌體內(nèi)明顯的熒光，說明該配合物確實進(jìn)入細(xì)菌菌體內(nèi)部，擁有與菌體內(nèi)生物大分子進(jìn)行結(jié)合的可能性。通過熒光強度測定后發(fā)現(xiàn)，配合物與DNA結(jié)合后其熒光強度隨DNA濃度提高呈下降趨勢，推測該配合物能夠與DNA發(fā)生結(jié)合。利用該配合物與核酸染料競爭性結(jié)合DNA后測定發(fā)現(xiàn)，隨著該配合物的濃度增加，核酸染料的熒光強度明顯下降，證明該配合物確實存在和DNA結(jié)合的能力，其結(jié)合強度高于核酸染料。最后通過凝膠電泳觀察到配合物[(Phen)2Ru(dppz)](PF6)2不僅能夠與DNA進(jìn)行結(jié)合，還能夠嵌入DNA分子內(nèi)，并造成切割降解作用。因此，我們認(rèn)為配合物[(Phen)2Ru(dppz)](PF6)2與該類配合物抗癌機制相似，可以與細(xì)菌DNA結(jié)合后產(chǎn)生對于DNA的降解作用，從而達(dá)到較好的抑菌效果。

通過本實驗，對新型單核多吡啶釕配合物[(Phen)2Ru(dppz)](PF6)2的抑菌活性以及機制進(jìn)行了研究和探討，這有助于對多吡啶釕類抑菌配合物的開發(fā)，并且對研究和設(shè)計類似配合物起到了理論指導(dǎo)和參考作用。然而，該化合物的應(yīng)用仍然存在著一定的限制，如該配合物在不同菌種間(包括耐藥菌)產(chǎn)生的抑菌活性差異，該配合物對于細(xì)菌內(nèi)其他生物大分子的作用機制，以及該配合物對于真核細(xì)胞以及原核細(xì)胞DNA是否具有差異性等都有待進(jìn)一步研究。

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Analysis of antibacterial activity and mechanism of polypyridyl ruthenium complex

LIU Han-jie, FU-Bin, FU Ai-ling, FU Chen

(CollegeofPharmaceuticalSciences，SouthwestUniversity，Chongqing400716，China)

AimTo analyze the antibiotic activity and mechanism of a polypyridyl ruthenium complex.MethodsThe antibacterial activity of[(Phen)2Ru(dppz)](PF6)2was determined by MIC and MBC value.Based on a fluorescent activity of this complex, the fluorescent emission spectra was used to analyze the combination of complex to DNA. Then the competition combination was analyzed between complex and Gold View to DNA. Lastly, gel electrophoresis of DNA was applied to detect the combination situation between complex and DNA.ResultsThis kind of polypyridyl ruthenium complex showed a significant antibacterial activity with a minimum antibacterial conentration of 0.2～0.4 g·L-1. That was caused by the combination and distortion of DNA due to the activity of this complex.ConclusionThe antibacterial activity and the mechanism of antibacterial activity about[(Phen)2Ru(dppz)](PF6)2are confirmed in this research, which provides a good foundation for the development of such class of compound.

polypyridyl ruthenium complex; antibacterial activity; fluorescent analysis;metabolism; DNA combination; DNA degradation

2016-04-05,

2016-05-04

國家自然科學(xué)基金資助項目(No 81273416)；教育部高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(No XDJK2013A030)；教育部回國人員啟動基金(No 2012-940)；教育部新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持計劃資助

劉漢杰(1989-)，男，碩士生，研究方向：生物技術(shù)藥物篩選及其質(zhì)量控制，E-mail：liuhanjie891227@sina.com；

付琛(1985-)，男，博士，講師，研究方向：無機藥物化學(xué)及化學(xué)生物學(xué)，通訊作者，E-mail：fuchen0794@swu.edu.cn

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.09.012

A

1001-1978(2016)09-1249-05

R342.3； R378.11；R378.21；R916.3；R978.1

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2016-8-23 14:29:00網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160823.1429.024.html