鐘　磊，師健友

(電子科技大學(xué)附屬醫(yī)院，四川省人民醫(yī)院，個(gè)體化藥物治療四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都　610072)

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耐吉非替尼的HCC827GR細(xì)胞的高效誘導(dǎo)及其藥理學(xué)特性

鐘磊，師健友

(電子科技大學(xué)附屬醫(yī)院，四川省人民醫(yī)院，個(gè)體化藥物治療四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都610072)

目的建立對(duì)吉非替尼(gefitinib)耐受的NSCLC細(xì)胞株，并觀察其藥理學(xué)特性。方法采用HGF和濃度遞增的gefitinib處理HCC827細(xì)胞以誘導(dǎo)細(xì)胞耐藥；MTT法測(cè)試細(xì)胞活力和藥物敏感性；克隆形成和Edu染色驗(yàn)證gefitinib對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用；qRT-PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞中c-Met表達(dá)。結(jié)果HGF的使用可縮短HCC827GR耐藥細(xì)胞的誘導(dǎo)時(shí)間；gefitinib可明顯抑制HCC827親本細(xì)胞的細(xì)胞活力、克隆形成和細(xì)胞增殖，而對(duì)HCC827GR細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用很弱；HCC827GR細(xì)胞c-Met高表達(dá)，對(duì)c-Met抑制劑高度敏感。結(jié)論成功并高效誘導(dǎo)了對(duì)gefitinib耐藥的HCC827GR細(xì)胞，該細(xì)胞生長(zhǎng)依賴c-Met蛋白活性，對(duì)c-Met抑制劑較敏感，可作為c-Met抑制劑的表型篩選模型。

非小細(xì)胞肺癌；吉非替尼；c-Met；耐藥；表型篩選；激酶抑制劑

吉非替尼(gefitinib)是第1代EGFR抑制劑，它對(duì)具有 EGFR 19 位外顯子E746-A750缺失突變和21位外顯子L858R點(diǎn)突變這兩種敏感突變，以及 EGFR 擴(kuò)增的非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)患者具有較好的療效，是治療這類患者的常規(guī)用藥[1]。然而，大部分使用gefitinib的患者在用藥后會(huì)產(chǎn)生耐受，其中，約20%的患者耐藥的原因是c-Met基因擴(kuò)增[2]。

c-Met是一種原癌基因，c-Met蛋白是肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hepatocyte growth factor，HGF)的唯一已知受體，它除了可導(dǎo)致抗腫瘤藥物耐藥以外，與腫瘤的進(jìn)展、轉(zhuǎn)移，以及腫瘤干細(xì)胞的自更新也密切相關(guān)，被認(rèn)為是有效的腫瘤治療靶點(diǎn)[3-5]。因此，建立一種c-Met過(guò)表達(dá)、且生長(zhǎng)高度依賴c-Met蛋白活性的細(xì)胞株，無(wú)論是在相關(guān)的耐藥和轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究，還是在以c-Met為靶點(diǎn)的藥物篩選和發(fā)現(xiàn)中均有十分重要的用途。本研究即以NSCLC細(xì)胞株HCC827為親本細(xì)胞，采用gefitinib和HGF共同處理此細(xì)胞，快速誘導(dǎo)產(chǎn)生了c-Met高表達(dá)的對(duì)gefitinib耐受的HCC827GR細(xì)胞，并對(duì)其藥理學(xué)特性進(jìn)行了探討。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞和試劑NSCLC細(xì)胞株購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)(ATCC)；HGF購(gòu)自美國(guó)Peprotech公司；RPMI 1640培養(yǎng)基、胰酶、DMSO、MTT和結(jié)晶紫均購(gòu)自Sigma公司；胎牛血清購(gòu)自草原綠野生物工程材料有限公司；p-Met Tyr1234/1235和c-Met抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司；β-actin和辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的二抗購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；RIPA裂解液、G250蛋白定量試劑和蛋白酶抑制劑均購(gòu)自Roche公司；Edu增殖檢測(cè)試劑盒購(gòu)自廣州市銳博生物科技有限公司；RNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司；cDNA合成試劑盒和qRT-PCR試劑盒均購(gòu)自美國(guó)BIO-RAD公司；gefitinib、Crizotinib、PHA-665752和PF-04217903等藥物購(gòu)自美國(guó)Selleck公司。

1.1.2主要儀器BHC-1000IIA/B3型生物安全柜，蘇凈安泰生物技術(shù)有限公司；IX50型倒置顯微鏡，日本Olympus公司；Heraeus BB15型細(xì)胞培養(yǎng)箱、Multiscan MK3酶標(biāo)儀、Sorvall ST16型低速離心機(jī)，美國(guó)Thermo Fisher公司；JY300C型電泳儀，北京君意東方電泳儀器有限公司；ABI7500型熒光定量PCR儀，美國(guó)Applied Biosystems公司。

1.2方法

1.2.1HCC827GR細(xì)胞的誘導(dǎo)向生長(zhǎng)狀態(tài)良好且處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HCC827細(xì)胞中加入50 μg·L-1HGF和0.1 μmol·L-1gefitinib，隨后，每3 d更換1次含細(xì)胞因子和藥物的培養(yǎng)基，待細(xì)胞對(duì)該濃度藥物耐受后再依次將藥物濃度提升至0.2、0.5、1和10 μmol·L-1，且當(dāng)藥物濃度增加至1 μmol·L-1時(shí)不再添加HGF。在藥物處理過(guò)程中，細(xì)胞長(zhǎng)滿后正常傳代，細(xì)胞貼壁后再加藥處理。以此法處理細(xì)胞4周左右即可得到對(duì)gefitinib耐受的HCC827GR細(xì)胞。

1.2.2MTT細(xì)胞活力檢測(cè)收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HCC827和HCC827GR細(xì)胞，每孔接種6 000個(gè)細(xì)胞，接種體積100 μL。次日，采用不同濃度的藥物處理細(xì)胞，每個(gè)濃度3個(gè)復(fù)孔，并設(shè)置溶劑對(duì)照組。藥物處理72 h后，向每孔加入20 μL MTT溶液(5 g·L-1)，在37 ℃孵育2～4 h，再加入50 μL質(zhì)量濃度為200 g·L-1的酸性SDS溶液，于37 ℃溶解甲臜過(guò)夜，最后采用酶標(biāo)儀檢測(cè)570 nm波長(zhǎng)下的吸光度值，并用Graphpad Prism軟件分析測(cè)試結(jié)果，繪制細(xì)胞存活率-濃度曲線。

1.2.3克隆形成實(shí)驗(yàn)收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HCC827和HCC827GR細(xì)胞，以每孔2 000個(gè)細(xì)胞的量接種于6孔板中。次日細(xì)胞貼壁后，向每孔加入不同濃度的gefitinib處理細(xì)胞，并設(shè)置溶劑對(duì)照組。此后，每3 d更換1次含藥培養(yǎng)基，連續(xù)作用12 d后，棄去培養(yǎng)基，用甲醇固定細(xì)胞，并用2.5 g·L-1的結(jié)晶紫染液對(duì)細(xì)胞克隆進(jìn)行染色并拍照。

1.2.4Edu細(xì)胞增殖檢測(cè)收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HCC827和HCC827GR細(xì)胞，以每孔8 000個(gè)細(xì)胞的量接種于96孔板中，次日細(xì)胞貼壁后，向每孔加入適宜濃度的gefitinib，作用24 h，再進(jìn)行Edu細(xì)胞增殖檢測(cè)，檢測(cè)方法按照Cell-LightTMEdu Apollo 567InVitroKit(廣州銳博生物)說(shuō)明書進(jìn)行。

1.2.5實(shí)時(shí)熒光定量PCR收集HCC827和HCC827GR細(xì)胞，按試劑盒操作說(shuō)明提取兩種細(xì)胞的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，再進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)c-Met表達(dá)。使用的引物序列如下：c-Met(forward)：5′-GAGGCAGTGCAGCATGTAGT-3′，c-Met(reverse)：5′-GATGATTCCCTCGGTCAGAA -3′；GAPDH(forward)：5′-CAGGTGGTCTCCTCTGACTT -3′，GAPDH(reverse)：5′-CCAAATTCGTTGTCATACCA-3′。

按以下參數(shù)進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)：95℃×30 s → 95℃×5 s，60℃×30 s(35個(gè)循環(huán))→ 95℃×5 s。以GAPDH mRNA表達(dá)水平作為內(nèi)參，通過(guò)檢測(cè)目的基因相對(duì)于內(nèi)參基因的表達(dá)變化來(lái)定量。1.2.6Western blot實(shí)驗(yàn)收集HCC827和HCC827GR等NSCLC細(xì)胞，裂解，超聲，提取總蛋白。采用SDS-PAGE分離蛋白，并轉(zhuǎn)至PVDF膜，使用質(zhì)量濃度為50 g·L-1的脫脂奶粉封閉2 h，再分別加入1 ∶1 000稀釋的p-Met、c-Met或β-actin抗體，于4 ℃孵育過(guò)夜。次日，再加入1 ∶5 000稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，在37 ℃ 孵育1 h，隨后用TBS/T洗脫除去過(guò)量抗體，在暗室中加入顯影液顯影曝光。

2　結(jié)果

2.1HCC827GR耐藥細(xì)胞的驗(yàn)證

2.1.1gefitinib對(duì)HCC827和HCC827GR細(xì)胞活力的影響我們采用MTT法對(duì)HCC827GR的耐藥性進(jìn)行了檢測(cè)，并以HCC827親本細(xì)胞作為對(duì)照，結(jié)果顯示，gefitinib對(duì)19位外顯子E746-A750缺失突變的HCC827親本細(xì)胞的IC50值為(2.3±0.16)nmol·L-1，而對(duì)HCC827GR細(xì)胞的IC50值為(12.4±0.48)μmol·L-1(Fig 1A)，兩者相差約5 000倍，表明HCC827GR細(xì)胞對(duì)gefitinib產(chǎn)生了耐受。

2.1.2gefitinib對(duì)HCC827和HCC827GR克隆形成的影響我們進(jìn)一步采用克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了gefitinib對(duì)HCC827和HCC827GR細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用，結(jié)果如Fig 1B所示，gefitinib在1 μmol·L-1濃度時(shí)幾乎已完全抑制了HCC827細(xì)胞的克隆形成，但是對(duì)HCC827GR的生長(zhǎng)無(wú)影響，且在10 μmol·L-1濃度時(shí)，gefitinib也未能完全抑制HCC827GR細(xì)胞形成細(xì)胞克隆。

2.1.3gefitinib對(duì)HCC827和HCC827GR細(xì)胞增殖的影響Edu細(xì)胞增殖檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如Fig 1C顯示，Edu(紅色熒光)標(biāo)記增殖的細(xì)胞，Hochest(藍(lán)色熒光)標(biāo)記腫瘤細(xì)胞核，在1 μmol·L-1濃度時(shí)，gefitinib可有效抑制HCC827細(xì)胞的增殖，而對(duì)HCC827GR細(xì)胞增殖無(wú)影響，gefitinib對(duì)兩種細(xì)胞的增殖抑制作用差異有顯著性。

Fig 1　Growth inhibition of gefitinib against HCC827 and HCC827GR cells

A:Cells were treated with gefitinib or vehicle for 72 h, and cell viability was determined by MTT assay;B:Cells were treated with gefitinib or vehicle for 12 days, and clonies were stained with crystal violet and photographed;C:Cells were treated with gefitinib for 24 h, followed by Edu cell incorporation assay.**P<0.01vsVehicle

2.1.4HCC827和HCC827GR細(xì)胞中c-Met表達(dá)水平對(duì)比為驗(yàn)證HCC827GR是否具有c-Met基因擴(kuò)增的特性，我們對(duì)兩種細(xì)胞的c-Met表達(dá)水平進(jìn)行了對(duì)比研究。RT-PCR的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HCC827GR細(xì)胞中c-Met mRNA表達(dá)水平明顯高于HCC827細(xì)胞(Fig 2A)。Western blot的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證明，在蛋白水平上，HCC827GR細(xì)胞中總c-Met和活性c-Met的表達(dá)也明顯高于HCC827親本細(xì)胞(Fig 2B)，表明誘導(dǎo)產(chǎn)生的HCC827GR細(xì)胞c-Met高表達(dá)。

2.2HCC827GR細(xì)胞對(duì)c-Met抑制劑的敏感性研究

Fig 2　c-Met expression in HCC827 and HCC827GR cells

A:c-Met mRNA expression was determined by quantitative RT-PCR;B:Expression of c-Met protein was determined by Western blot.**P<0.01vsHCC827

2.2.1NSCLC細(xì)胞中c-Met表達(dá)水平對(duì)比我們收集了6種NSCLC細(xì)胞株，并對(duì)其c-Met蛋白表達(dá)水平進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果如Fig 3所示，A549、Calu6和H1975 3種細(xì)胞中c-Met表達(dá)水平較低；H1993和H441是已知的NSCLC細(xì)胞中c-Met高表達(dá)的細(xì)胞[6]，它們的c-Met蛋白表達(dá)量較上述3種細(xì)胞略高；而HCC827GR細(xì)胞的c-Met表達(dá)水平又明顯高于H1993和H441。

Fig 3　Expression level of c-Met protein in several NSCLC cells

2.2.23種NSCLC細(xì)胞對(duì)c-Met抑制劑的敏感度對(duì)比研究我們進(jìn)一步采用c-Met抑制劑crizotinib、PHA-665752和PF-04217903處理c-Met表達(dá)水平較高的3種細(xì)胞HCC827GR、H1993和H441，以評(píng)估它們對(duì)c-Met抑制劑的敏感性。結(jié)果顯示，藥物對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用與細(xì)胞中c-Met表達(dá)水平有較高的相關(guān)性，c-Met表達(dá)量越高的細(xì)胞，藥物對(duì)其抑制作用越明顯，3種細(xì)胞中HCC827GR c-Met表達(dá)水平較高，對(duì)3種c-Met抑制劑均更為敏感(Fig 4)。

Fig 4　Sensitivity of HCC827GR, H1993 and H441 to c-Met inhibitors

3　討論

HCC827細(xì)胞是具有EGFR 19位外顯子E746-A750缺失突變的NSCLC細(xì)胞，對(duì)gefitinib高度敏感，采用常規(guī)的濃度遞增式誘導(dǎo)方法，要獲得對(duì)gefitinib耐受的HCC827GR細(xì)胞，需要約6個(gè)月時(shí)間[7-8]。而本研究在誘導(dǎo)過(guò)程中加入了HGF，使耐藥細(xì)胞的誘導(dǎo)時(shí)間縮短至1個(gè)月，其理論依據(jù)即在于，HCC827細(xì)胞本身就含有少量c-Met基因擴(kuò)增的細(xì)胞克隆[7]。采用gefitinib和HGF共同處理的方法，一方面大量殺滅了敏感細(xì)胞，另一方面刺激了c-Met基因擴(kuò)增的細(xì)胞克隆快速增殖，從而達(dá)到高效篩選并富集這類耐藥克隆的目的。采用此種方法誘導(dǎo)產(chǎn)生的HCC827GR細(xì)胞與文獻(xiàn)報(bào)道的單純采用gefitinib誘導(dǎo)的耐藥細(xì)胞一樣，細(xì)胞活力、克隆形成和細(xì)胞增殖不再受gefitinib影響，且在撤掉HGF以后傳代數(shù)次，耐藥性仍持續(xù)存在。進(jìn)一步的基因和蛋白水平的檢測(cè)結(jié)果證實(shí)，HCC827GR細(xì)胞中c-Met高表達(dá)。

基于靶點(diǎn)的篩選和基于表型的篩選是新藥研發(fā)常用的研究手段，前者通過(guò)靶點(diǎn)甄選和針對(duì)該靶點(diǎn)的酶水平測(cè)試篩選藥物，得到的化合物往往達(dá)不到預(yù)期的療效；后者利用疾病相關(guān)表型直接篩選，得到的化合物有效率高，但是在藥物靶點(diǎn)鑒定和作用機(jī)制研究中難度較大。本研究中我們成功誘導(dǎo)了c-Met高表達(dá)的HCC827GR細(xì)胞，該細(xì)胞生長(zhǎng)依賴于c-Met活性，對(duì)c-Met抑制劑高度敏感。采用該細(xì)胞進(jìn)行藥物篩選，比一般的表型篩選模型更具優(yōu)勢(shì)，可通過(guò)觀察細(xì)胞活力這一表型直接篩選到潛在的c-Met抑制劑，在c-Met抑制劑篩選和藥物靶點(diǎn)鑒定中具有重要用途。

綜上所述，本研究高效誘導(dǎo)了對(duì)gefitinib耐受的HCC827GR細(xì)胞，該細(xì)胞生長(zhǎng)高度依賴于c-Met蛋白活性，對(duì)c-Met抑制劑敏感，可作為c-Met抑制劑的表型篩選模型。

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Efficient induction of gefitinib-resistant cell line HCC827GR and its pharmacological properties

ZHONG Lei，SHI Jian-you

(HospitalofUniversityofElectronicScienceandTechnologyofChinaandSichuanProvincialPeople’sHospital,PersonalizedDrugTherapyKeyLaboratoryofSichuanProvince,Chengdu610072,China)

AimTo establish a gefitinib-resistant NSCLC cell line, and observe its pharmacological properties.MethodsHCC827 cells were treated with hepatocyte growth factor(HGF) and increasing concentration of gefitinib to induce cell resistance. MTT assay was used to test cell viability and chemosensitivity. Clone formation and Edu staining were used to verify the inhibitory effect of gefitinib on cell growth. qRT-PCR and Western blot were used to assay the expression of c-Met. ResultsThe use of HGF greatly shortened the induction time of HCC827GR resistant cells. gefitinib could significantly suppress cell viability, colony formation and cell proliferation of HCC827, but had a weaker inhibitory effect on HCC827GR cells. HCC827GR overexpressed c-Met protein, and was highly sensitive to c-Met inhibitors.ConclusionThe gefitinib-resistant HCC827GR cells were induced successfully and efficiently. The growth of HCC827GR is dependent on the activity of c-Met protein, and it can be used as a phenotypic screening model of c-Met inhibitors.

non-small cell lung cancer；gefitinib；Met；drug resistance；phenotypic screening；kinase inhibitor

2016-04-18,

2016-05-23

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 81302643)

鐘磊(1985-)，男，博士，助理研究員，研究方向：腫瘤藥理學(xué)，E-mail：zhl7235301@163.com；

師健友(1981-)，男，博士，副研究員，碩士生導(dǎo)師，研究方向：藥物化學(xué)，通訊作者，E-mail：shijianyou2010@163.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.09.019

A

1001-1978(2016)09-1284-05

R329.24；R394.2；R734.2；R965.1；R979.1

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-8-23 14:29:00網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160823.1429.038.html