李　晶，陳　丹，周　宇，鮑翠玉

(湖北科技學(xué)院1.糖尿病心腦血管病變湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、2.護(hù)理學(xué)院，湖北 咸寧　437100)

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NADPH氧化酶在高脂誘導(dǎo)的MIN6胰島β細(xì)胞損傷中的作用

李晶1，陳丹1，周宇2，鮑翠玉2

(湖北科技學(xué)院1.糖尿病心腦血管病變湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、2.護(hù)理學(xué)院，湖北 咸寧437100)

目的探討NADPH氧化酶在高脂誘導(dǎo)的MIN6胰島β細(xì)胞損傷中的作用。方法不同濃度(0.1、0.3、0.5、0.8 mmol·L-1) 高脂刺激MIN6胰島β細(xì)胞(24、48、72、96 h) ，MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況；免疫印跡法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)p22phox、p47phox、p67phox以及gp91phox等NADPH氧化酶亞基的表達(dá)水平及凋亡相關(guān)蛋白(Bcl-2及Bax)的表達(dá)水平。結(jié)果0.5 mmol·L-1高脂刺激MIN6胰島細(xì)胞48 h 時(shí)，細(xì)胞增殖率出現(xiàn)明顯下降；p22phox、p47phox、p67phox以及gp91phox等NADPH 氧化酶亞基和Bax的表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)，而B(niǎo)cl-2表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)；NADPH氧化酶抑制劑 diphenyliodonium(DPI，10 μmol·L-1)預(yù)處理后并高脂刺激MIN6胰島β細(xì)胞48 h，與高脂刺激組相比，DPI處理組細(xì)胞Bcl-2表達(dá)明顯上升(P<0.05)，Bax表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05)。結(jié)論NADPH氧化酶活性對(duì)高脂引起的MIN6胰島β細(xì)胞損傷的防治有重要意義。

NADPH氧化酶；高脂；MIN6；胰島β細(xì)胞；Bcl-2；Bax

糖尿病是嚴(yán)重影響人類健康的一種內(nèi)分泌紊亂，以往的研究表明[4]，血糖代謝紊亂時(shí)通常伴隨著活性氧(reactive oxygen species，ROS)產(chǎn)生過(guò)量導(dǎo)致的氧化應(yīng)激，這種應(yīng)激表現(xiàn)為機(jī)體氧化和抗氧化系統(tǒng)間的失衡，在胰島β細(xì)胞功能的衰退中起著重要的作用[1]。因此通過(guò)抗氧化機(jī)制保護(hù)胰島β細(xì)胞功能也是糖尿病治療的策略之一。ROS作為NADPH氧化酶的催化產(chǎn)物，參與到體內(nèi)多種防御和信息傳遞生理過(guò)程中，由于過(guò)度激活NADPH氧化酶，從而生成過(guò)多ROS，易導(dǎo)致氧化應(yīng)激性損傷[2]。而對(duì)于胰島細(xì)胞來(lái)說(shuō)，致病因素包括糖毒性及脂毒性。尤其脂毒性對(duì)胰島β細(xì)胞來(lái)說(shuō)是個(gè)損傷性刺激[3]，可使胰島β細(xì)胞發(fā)生凋亡，其發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，目前尚未完全闡明，且僅有一些少量文獻(xiàn)中提到與NADPH氧化酶信號(hào)通路之間的相關(guān)性報(bào)道[5-8]。

基于此，本研究擬評(píng)價(jià)不同高脂刺激對(duì)MIN6胰島β細(xì)胞的NADPH氧化酶體系及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，本研究首次較全面地分析了高脂刺激誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞的損傷或凋亡與NADPH氧化應(yīng)激通路之間的相關(guān)性，將為脂毒性胰島損傷的防治提供新的思路。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1細(xì)胞系MIN6胰島β細(xì)胞購(gòu)自上海通派生物有限公司。

1.1.2主要試劑p22phox(sc-271968)、p47phox(sc-17844)、p67phox(sc-374510)以及gp91phox(sc-130543)抗體均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；Bcl-2(#15071)及Bax(#2772)抗體均購(gòu)自美國(guó)CST公司；細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)高糖DMEM培養(yǎng)基(12100-046)及胎牛血清(16000-044)均購(gòu)自美國(guó) Gibco 公司。

1.1.3主要設(shè)備主要設(shè)備包括：超凈工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)公司) 、二氧化碳培養(yǎng)箱(德國(guó)賀利氏公司)、倒置相差顯微鏡(日本奧林帕斯公司)、紫外分光光度計(jì)(美國(guó)貝克曼公司)、多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)寶特公司)、高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Sigma公司)、電泳槽(美國(guó)伯樂(lè)公司)、電轉(zhuǎn)膜儀(美國(guó)伯樂(lè)公司)、化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)(英國(guó)Syngene公司)等。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1游離脂肪酸的配制用0.1 mol·L-1的NaOH溶液在70℃水浴中溶解一定量的棕櫚酸(palmitic acid，PA)，振蕩混勻10 min，然后過(guò)濾，配成100 mmol·L-1的PA儲(chǔ)存液。在55℃水浴中用去離子水配50 g·L-1的BSA溶液，過(guò)濾。然后將上述的PA溶液和BSA溶液按1 ∶19的體積比混合配成PA/BSA復(fù)合液，在水浴中振蕩10 s后繼續(xù)水浴10 min，取出后冷卻至室溫，過(guò)濾。然后將上述復(fù)合液分別用高糖DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)MIN6細(xì)胞培養(yǎng)于高糖DMEM培養(yǎng)基(含有25 mmol·L-1葡萄糖, 10 mmol·L-1的丙酮酸鈉，10 mmol·L-1的HEPES，2 mmol·L-1的L-谷氨酰胺，及55 μmol·L-1的β巰基乙醇，10 mL·L-1Antibiotic antimycotic)中，在37℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)接近70%融合時(shí)，0.25% EDTA-胰酶消化、傳代培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.3實(shí)驗(yàn)分組① MIN6細(xì)胞分為:對(duì)照組(使用不含棕櫚酸的高糖DMEM培養(yǎng)基)，含0.1、0.3、0.5、0.8 mmol·L-1棕櫚酸的高糖DMEM培養(yǎng)基刺激48 h組；② MIN6細(xì)胞分為:對(duì)照組(使用不含棕櫚酸的高糖DMEM培養(yǎng)基)、含0.5 mmol·L-1棕櫚酸的高糖DMEM培養(yǎng)基刺激24、48、72、96 h 組；③ MIN6細(xì)胞分為:對(duì)照組(使用不含棕櫚酸的高糖DMEM培養(yǎng)基)、含0.5 mmol·L-1棕櫚酸的高糖DMEM培養(yǎng)基刺激48 h組、NADPH氧化酶抑制劑diphenyliodonium(DPI)10 μmol·L-1預(yù)處理后用0.5 mmol·L-1棕櫚酸刺激48 h組。

1.3檢測(cè)指標(biāo)

1.3.1MTT檢測(cè)胰島β細(xì)胞增殖率在96孔板中接種MIN6細(xì)胞懸液(每孔1×106cells，每孔100 μL)。將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)(在37℃，5% CO2的條件下)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后棄上清液，向每孔加入20 μL的MTT溶液(5 g·L-1)，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定在570 nm處的吸光度，設(shè)6個(gè)復(fù)孔。

1.3.2免疫印跡法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)水平各組胰島細(xì)胞在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后，棄上清，PBS清洗細(xì)胞。每組加入80 μL細(xì)胞裂解液，冰上震蕩裂解30 min后，采取重復(fù)刮動(dòng)板底方法，將細(xì)胞刮凈，收集到離心管中，進(jìn)行離心(13 000 r·min-1，15 min)，BCA法進(jìn)行蛋白定量，取一定量的總蛋白于10%～12% SDS-PAGE凝膠上進(jìn)行電泳分離，轉(zhuǎn)膜后，經(jīng)5%脫脂牛奶封閉1 h，根據(jù)不同抗體的效價(jià)，加入用TBST適當(dāng)稀釋的一抗4℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜，二抗37℃孵育1 h，加入ECL熒光顯影液，用化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)p22phox、p47phox、p67phox以及gp91phox等NADPH 氧化酶亞基的表達(dá)水平及凋亡相關(guān)蛋白(Bcl-2及Bax)的表達(dá)水平。

2　結(jié)果

2.1高脂刺激對(duì)MIN6胰島β細(xì)胞增殖率的影響Fig 1A結(jié)果說(shuō)明，含0.1、0.3、0.5、0.8 mmol·L-1棕櫚酸的高糖DMEM培養(yǎng)基刺激48 h后，高脂所致的胰島細(xì)胞增殖率呈現(xiàn)濃度依賴性降低趨勢(shì)，棕櫚酸濃度在0.5 mmol·L-1時(shí)，開(kāi)始明顯降低(P<0.05)，與棕櫚酸濃度在0.8 mmol·L-1時(shí)，差異無(wú)顯著性(P>0.05)。Fig 1B結(jié)果說(shuō)明，含0.5 mmol·L-1棕櫚酸的高糖DMEM培養(yǎng)基刺激24、48、72、96 h 后，高脂所致的胰島細(xì)胞增殖率呈現(xiàn)時(shí)間依賴性降低趨勢(shì)，刺激時(shí)間在48 h時(shí)，開(kāi)始明顯降低(P<0.05)，刺激時(shí)間在72 h及96 h時(shí)，差異無(wú)顯著性(P>0.05)。

Fig 1　Influence of high palmitic acid on

*P<0.05vs0.1 mmol·L-1group (A) or 24 h group (B)

2.2高脂刺激時(shí)MIN6胰島β細(xì)胞NADPH氧化酶亞基表達(dá)的變化Fig 2結(jié)果說(shuō)明，用含0.5 mmol·L-1棕櫚酸的高糖DMEM培養(yǎng)基刺激24、48、72、96 h 后，p22phox、p47phox、p67phox以及gp91phox等NADPH氧化酶亞基的表達(dá)在高脂刺激48 h后出現(xiàn)持續(xù)高水平，均高于正常對(duì)照組(P<0.05)，而48、72、96 h之間均無(wú)明顯差異(P>0.05)。

2.3高脂刺激時(shí)MIN6胰島β細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的變化Fig 3結(jié)果說(shuō)明，用含0.5 mmol·L-1棕櫚酸的高糖DMEM培養(yǎng)基刺激24、48、72、96 h后，Bcl-2表達(dá)在高脂刺激48 h后出現(xiàn)持續(xù)低水平，Bax表達(dá)在高脂刺激48 h后出現(xiàn)持續(xù)高水平，與正常對(duì)照組相比，差異均有顯著性(P<0.05)；而48、72、96 h之間Bcl-2及Bax表達(dá)差異均無(wú)顯著性(P>0.05)。

Fig 2　Influence of high palmitic acid on expression

*P<0.05vs0 h group

Fig 3　Influence of high palmitic acid on expression of

*P<0.05vs0 h group

2.4NADPH氧化酶抑制劑對(duì)高脂刺激下MIN6胰島β細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig 4結(jié)果說(shuō)明，用含0.5 mmol·L-1棕櫚酸的高糖DMEM培養(yǎng)基刺激48 h后，棕櫚酸刺激組Bcl-2表達(dá)出現(xiàn)明顯低水平，Bax表達(dá)出現(xiàn)明顯高水平，與正常對(duì)照組相比，差異均有顯著性(P<0.05)；而棕櫚酸+DPI組Bcl-2表達(dá)明顯增高，與對(duì)照組差異無(wú)顯著性(P>0.05)，Bax表達(dá)明顯降低，與對(duì)照組相比，差異無(wú)顯著性(P>0.05)。

Fig 4　Influence of NADPH oxidase inhibitor(diphenyliodonium,DPI) on expression of Bcl-2 and Bax in MIN6 islet β cells exposed

*P<0.05vscontrol group

3　討論

糖脂毒性在2型糖尿病發(fā)展中起著關(guān)鍵性的作用[9]。尤其近年來(lái)，諸多研究證實(shí)了脂毒性能導(dǎo)致胰島β細(xì)胞的功能受損甚至凋亡，同時(shí)可引起外周組織的胰島素抵抗，最終發(fā)展為糖尿病。脂毒性也會(huì)促進(jìn)如視網(wǎng)膜病變、糖尿病神經(jīng)病變、糖尿病腎病、大血管病變等糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生[10]。關(guān)于脂毒性潛在機(jī)制，目前認(rèn)為脂肪細(xì)胞分化功能障礙是主要問(wèn)題，因?yàn)橐坏┲炯?xì)胞無(wú)法增生分化成新的脂肪細(xì)胞，營(yíng)養(yǎng)過(guò)量便只能引起脂肪細(xì)胞體積的代償性增大，從而對(duì)抗胰島素的抗脂解作用，導(dǎo)致甘油三酯在脂肪細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)嚴(yán)重水解，血漿中游離脂肪酸(FFA)濃度明顯升高。同時(shí)，增大的脂肪細(xì)胞使脂肪的儲(chǔ)備功能受到了阻礙，使多余的脂肪不得不流入胰腺、肌肉及肝臟等器官，出現(xiàn)脂毒性。

據(jù)報(bào)道，長(zhǎng)時(shí)間的高脂喂養(yǎng)大鼠氧化應(yīng)激水平會(huì)普遍增高[11-12]，導(dǎo)致胰島出現(xiàn)氧化/抗氧化功能失調(diào)，出現(xiàn)胰島β細(xì)胞凋亡增多。當(dāng)一些有害因素刺激機(jī)體時(shí)，機(jī)體的活性氧(ROS)等氧化應(yīng)激產(chǎn)物會(huì)增多并累積在體內(nèi)得不到及時(shí)清除，使氧化/抗氧化系統(tǒng)平衡受到破壞，最終使機(jī)體機(jī)能受到損傷，也稱氧化應(yīng)激性損傷。而ROS在機(jī)體內(nèi)主要是來(lái)源于NADPH氧化酶及線粒體呼吸鏈復(fù)合體[13]。NADPH 氧化酶的底物為NAD(P)H，脂毒性刺激可增加胞質(zhì)戊糖途徑產(chǎn)生的NADPH及線粒體的NADH，激活NADPH氧化酶，過(guò)多的電子傳遞將促進(jìn)NADPH源性ROS的生成，最終導(dǎo)致氧化應(yīng)激體系的失衡及胰島細(xì)胞的損傷。NADPH氧化酶是由p22phox、p47phox、p67phox、gp91phox、p40phox和Rac1等6種亞單位組成的復(fù)合體[14]。本研究結(jié)果顯示，高脂刺激MIN6胰島β細(xì)胞48 h后p22phox、p47phox、p67phox、gp91phox等NADPH氧化酶亞基表達(dá)明顯增高，提示NADPH氧化酶的激活及其亞單位的表達(dá)調(diào)控可成為高脂所致胰島細(xì)胞損傷的機(jī)制之一。

作為一類獨(dú)立危險(xiǎn)因素，脂毒性刺激對(duì)胰島β細(xì)胞是一種直接性損害，可導(dǎo)致胰島β細(xì)胞在數(shù)目及功能方面均受到影響，增加胰島β細(xì)胞的凋亡，最終使胰島分泌功能受到損傷。也就是說(shuō)胰島β細(xì)胞凋亡是胰島分泌功能下降的主要因素，而目前為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有多種基因參與細(xì)胞凋亡的調(diào)控，其中Bcl-2家族是近年來(lái)細(xì)胞凋亡研究中受到矚目的關(guān)鍵調(diào)控因子，它憑借著促凋亡及抗凋亡的協(xié)同作用，在細(xì)胞凋亡調(diào)控中發(fā)揮開(kāi)關(guān)的作用。例如Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，Bax是一種促凋亡蛋白，正常情況下，抗細(xì)胞凋亡蛋白Bcl-2與促細(xì)胞凋亡蛋白 Bax維持動(dòng)態(tài)平衡，維持細(xì)胞正常的生理過(guò)程。當(dāng) Bcl-2表達(dá)增多，Bax表達(dá)減少，細(xì)胞凋亡減少，反之凋亡增多。本研究結(jié)果顯示，用含0.5 mmol·L-1棕櫚酸的高糖DMEM培養(yǎng)基刺激24、48、72、96 h后，Bcl-2表達(dá)在高脂刺激48 h后出現(xiàn)明顯降低，Bax表達(dá)在高脂刺激48 h后出現(xiàn)明顯升高。本研究另一組數(shù)據(jù)表明，與高脂刺激48 h組相比，高脂+NADPH氧化酶抑制劑DPI組Bcl-2表達(dá)明顯增高，Bax表達(dá)明顯降低，提示胰島β細(xì)胞損傷或凋亡可以排除棕櫚酸對(duì)細(xì)胞的直接作用，也表明NADPH氧化酶途徑是高脂刺激導(dǎo)致胰島損傷的關(guān)鍵機(jī)制。

綜上所述，高脂刺激可抑制MIN6胰島β細(xì)胞的增殖，升高NADPH氧化酶亞基的表達(dá)水平，同時(shí)降低抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)、升高促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，并成功被NADPH氧化酶抑制劑所阻斷。這說(shuō)明，調(diào)控NADPH依賴性氧化應(yīng)激所致的細(xì)胞凋亡對(duì)脂毒性胰島損傷的防治有指導(dǎo)意義。

(致謝:本文實(shí)驗(yàn)在湖北科技學(xué)院糖尿病心腦血管病變湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成，感謝參與人員鮑翠玉教授、陳丹碩士生及周宇碩士生對(duì)本實(shí)驗(yàn)的幫助與指導(dǎo)。)

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Role of NADPH oxidase in high fat-induced injury in MIN6 islet β cells

LI Jing1，CHEN Dan1，ZHOU Yu2，BAO Cui-yu2

(1.HubeiProvinceKeyLaboratoryonCardiovascular，Cerebrovascular，andMetabolicDisorders，2.NursingCollege，HubeiUniversityofScienceandTechnology，XianningHubei437100，China)

AimTo explore the role of nicotinamide adenine dinucleotide phosphate(NADPH) oxidase in high fat-induced injury in MIN6 islet β cells.MethodsMIN6 islet β cells were exposed to different concentrations of palmitic acid(0.1,0.3,0.5,0.8 mmol·L-1) for 48 h and different time points of 0.5 mmol·L-1palmitic acid(24,48,72,96 h). Cell viability was measured by MTT，the protein expression of NADPH oxidase subunits such as p22phox,p47phox,p67phoxand gp91phoxand apoptosis related proteins such as Bcl-2 and Bax were determined by Western blot.ResultsMIN6 islet cells exposed to palmitic acid at 0.5 mmol·L-1for 48 h showed a decrease in their viability and an increase in the expression of NADPH oxidase subunits(p22phox、p47phox、p67phoxand gp91phox) and Bax(P<0.05), while Bcl-2 expression was significantly reduced. the pretreat with NADPH oxidase inhibitor diphenyliodonium(DPI，10 μmol·L-1)significantly inhibited high fat-induced Bcl-2 and Bax expression(P<0.05 ).ConclusionActivated NADPH oxidase might play an important role in the treatment of high fat-induced injury in MIN6 islet cells.

NADPH oxidase；high fat；MIN6；islet β cells；Bcl-2；Bax

2016-05-16,

2016-06-26

湖北省教育廳科學(xué)研究計(jì)劃項(xiàng)目(No B2016197)；湖北省自然科學(xué)基金計(jì)劃項(xiàng)目(No 2015CFC773)

李晶(1979-)，女，博士，講師，研究方向：糖尿病心腦血管病變，E-mail：lijing790629@:163.com；

鮑翠玉(1969-)，女，博士，教授，研究方向：糖尿病心肌缺血的防治，通訊作者，E-mail：bcy_tiaopi@126.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.09.025

A

1001-1978(2016)09-1317-05

R322.57；R329.24；R345.4；R587.1；R977.3；R977.6

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-8-23 14:29:00網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160823.1429.050.html