韓德忞　劉原志　朱均昊　李莉　章強(qiáng)強(qiáng)

(復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院皮膚科真菌室，上海 200040)

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·技術(shù)與方法·

熒光染色法與KOH濕片法在真菌直接鏡檢中的應(yīng)用比較

韓德忞劉原志朱均昊李莉章強(qiáng)強(qiáng)

(復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院皮膚科真菌室，上海 200040)

目的探索一種結(jié)果更可靠的真菌直接鏡檢方法。方法對(duì)600例臨床高度疑似真菌感染的標(biāo)本分別采用熒光染色法和KOH濕片法進(jìn)行真菌直接鏡檢。結(jié)果熒光染色法和KOH濕片法的真菌檢出率分別為97%和88.5%。結(jié)論 熒光染色法是一種適合臨床的、快速有效的真菌鏡檢方法。

KOH濕片法；真菌直接鏡檢；真菌熒光染色法；真菌感染

[Chin J Mycol，2016，11(4):240-242]

直接鏡檢法旨在通過顯微鏡和簡(jiǎn)單的試劑(通常1種)的幫助觀察標(biāo)本中的真菌結(jié)構(gòu)。在真菌實(shí)驗(yàn)室中常規(guī)采用KOH濕片法觀察標(biāo)本中有無真菌有形成分，本實(shí)驗(yàn)采用熒光染色法與KOH濕片法分別對(duì)同一標(biāo)本同時(shí)作鏡檢，比較兩種方法在鏡下的真菌形態(tài)的辨別清晰度與敏感性。

1　材料和方法

1.1熒光染色液的成分與染色原理

熒光染色液的成分我們采用的萊芙特敏真菌熒光染色液配有熒光染色A液及染色B液。其中熒光染色A液是一種含有特殊熒光素標(biāo)聯(lián)的幾丁質(zhì)酶的復(fù)合溶液，其中添加了濃度為10%的氫氧化鉀有助于溶解皮屑及甲屑標(biāo)本中的角質(zhì)細(xì)胞。染色B液是一種含有伊文思藍(lán)染料的溶液，用于去除視野中雜質(zhì)熒光的干擾。

染色原理一般細(xì)胞熒光素會(huì)與各類標(biāo)本中真菌細(xì)胞壁的(1,3)-β-D葡聚糖結(jié)合，從而通過熒光標(biāo)記進(jìn)行真菌檢測(cè)。本法利用一種重組幾丁質(zhì)酶來檢測(cè)人體組織內(nèi)是否存在真菌感染的方法。幾丁質(zhì)存在于絕大多數(shù)真菌的細(xì)胞壁中，它是一種(1，4)-N-乙酰氨基葡萄糖均聚物。真菌熒光染色液中的重組幾丁質(zhì)酶克隆自副溶血性弧菌，該重組酶可特異性地緊密結(jié)合到幾丁質(zhì)上。特殊熒光素標(biāo)聯(lián)的真菌酶可以作為組織化學(xué)標(biāo)記物，在熒光顯微鏡下用來檢測(cè)各種組織樣本中的真菌細(xì)胞壁。特殊熒光素標(biāo)聯(lián)的幾丁質(zhì)酶可以高親和力與真菌細(xì)胞壁上的幾丁質(zhì)結(jié)合，在一般的實(shí)驗(yàn)條件下，不會(huì)被破壞。

1.2真菌熒光染色的適用范圍及存儲(chǔ)

該熒光染色液能夠與各類真菌(霉菌及酵母)細(xì)胞壁中的幾丁質(zhì)結(jié)合從而產(chǎn)生熒光標(biāo)記，包含皮膚癬菌、馬拉色菌、念珠菌、曲霉及各類變異的菌絲結(jié)構(gòu)。適用于皮屑、甲屑、毛發(fā)、痰液、肺泡灌洗液、尿液、胸水等各種標(biāo)本。熒光染色液可以室溫避光保存。

1.3標(biāo)本來源

標(biāo)本來自于華山醫(yī)院皮膚科門診及病房住院患者，臨床高度疑似真菌感染，共600例。其中皮屑標(biāo)本中手足部位262份，體股部位52份，甲屑標(biāo)本76份，毛發(fā)標(biāo)本10份，深部標(biāo)本包括痰液112份，尿液64份，胸水及其他體液標(biāo)本24份。同時(shí)用2種方法檢測(cè)。

1.4方法

取材①深部標(biāo)本：a.痰液標(biāo)本取自患者清晨漱口后的第1口晨痰，標(biāo)本存入無菌痰液容器中保存。b.尿液標(biāo)本取自患者的早上的第1次清潔尿，使用無菌容器收集保存，離心后取沉渣作鏡檢。c.胸水及其他體液標(biāo)本需要無菌采集于無菌試管中，離心后取沉渣作鏡檢。②淺部標(biāo)本：a.皮屑：75%乙醇消毒患者皮損部位，使用鈍頭刀片刮取皮損炎性活動(dòng)性邊緣的鱗屑，將標(biāo)本直接置于載玻片上。b.毛發(fā)：75%乙醇消毒局部，使用鑷子拔取病發(fā)直接置于載玻片上。c.甲屑：75%乙醇消毒后，刮取甲下碎屑，直接置于載玻片上。

KOH濕片法采集各種標(biāo)本于載波片上，滴加10%KOH溶液1滴，覆上蓋玻片，微加熱后輕壓蓋玻片使標(biāo)本溶解后，置顯微鏡下觀察。尿液及胸水不加KOH。

熒光染色法將各種標(biāo)本采集后置載玻片上，滴加1滴熒光染色A液，使標(biāo)本與染液充分混勻作用1 min，甲屑標(biāo)本需要延長(zhǎng)至3 min，使其完全溶解，再滴加1滴染色B液，可使用竹簽混勻兩液，復(fù)染1 min后覆上蓋玻片，用濾紙吸取多余溢出的染液，輕壓蓋玻片后在熒光顯微鏡(型號(hào)Mshot SHHW-001)下低倍鏡觀察，查見熒光標(biāo)記的菌絲或孢子后作高倍鏡證實(shí)。

2　結(jié)　　果

對(duì)600例患者的標(biāo)本分別同時(shí)采用熒光染色法和KOH濕片法檢測(cè)，結(jié)果顯示熒光染色法對(duì)各種標(biāo)本中的皮膚癬菌、念珠菌及馬拉色菌的熒光標(biāo)記非常清晰(見圖1～4)，易于識(shí)別。熒光染色法與KOH濕片法的陽(yáng)性率分別為97%及88.5%，統(tǒng)計(jì)學(xué)卡方檢測(cè)顯示x2=8.67，P<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，對(duì)比試驗(yàn)顯示同一標(biāo)本采用熒光染色法較KOH濕片法陽(yáng)性率為高。具體結(jié)果見表1。

圖1痰標(biāo)本：熒光染色，念珠菌孢子出芽(×400)圖2皮屑標(biāo)本：熒光染色，大量的皮膚癬菌細(xì)長(zhǎng)菌絲(×400)圖3皮屑標(biāo)本：熒光染色，馬拉色菌短粗菌絲(×400)圖4皮屑標(biāo)本：熒光染色，念珠菌菌絲(×400)

Fig.1Sputum sample:fluorescent staining,Candida spore germination(×400)Fig.2Dander sample:fluorescent staining,a large number of elongated dermatophytes hyphae(×400)Fig.3 Dander sample:fluorescent staining,Malassezia tubby hyphae(×400)Fig.4Dander sample:fluorescent staining,Candida hyphae(×400)

3　討　　論

KOH濕片法制作方法簡(jiǎn)單便捷，成本低廉，不需要特殊的儀器設(shè)備，但非常依賴于檢驗(yàn)人員的經(jīng)驗(yàn)與技術(shù)水平，且由于標(biāo)本中常含有各種雜質(zhì)導(dǎo)致視野背景較雜亂，影響真菌的檢出，其中甲屑標(biāo)本最為明顯，KOH濕片法短時(shí)間無法溶解標(biāo)本中的雜質(zhì)，一定程度上干擾了真菌檢出，導(dǎo)致陽(yáng)性率不高。

真菌熒光染色法通過特殊熒光素標(biāo)聯(lián)的幾丁質(zhì)酶與真菌細(xì)胞壁中的幾丁質(zhì)產(chǎn)生特異性的結(jié)合，并吸收紫外光(波長(zhǎng)340～380 nm)，使菌絲及孢子發(fā)出明亮的藍(lán)色熒光，在熒光顯微鏡下真菌輪廓和黑暗背景可形成明顯反差，易于在鏡下尋找及識(shí)別，其真菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)相對(duì)于KOH濕片法更為清晰，真菌熒光染色液A液中含有10%的KOH成分，能夠溶解皮屑、甲屑標(biāo)本中的角質(zhì)細(xì)胞及其他雜質(zhì)。真菌熒光染色可通過反復(fù)染色使因放置時(shí)間過長(zhǎng)而使熒光減少的樣本恢復(fù)熒光，也可通過重復(fù)染色步驟大幅減少背景熒光，使菌絲與孢子更為明顯。相對(duì)于KOH濕片法，雖然熒光染色法的操作需要增加一步染色步驟，且需要熒光顯微鏡，但其對(duì)于標(biāo)本中菌絲、孢子由于熒光的標(biāo)記使得尋找相對(duì)容易，也便于識(shí)別，真菌菌絲、孢子清晰顯現(xiàn)，檢測(cè)靈敏度大幅提高。特別是在KOH濕片法中孢子與脂肪滴有時(shí)很難鑒別，而熒光染色法對(duì)脂肪滴不產(chǎn)生標(biāo)記，易于鑒別，且特異性高，其能使少量真菌著染，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)的KOH濕片法在真菌數(shù)量少時(shí)檢出率不高的不足，并且染色時(shí)間短，只需2 min，結(jié)果直觀。根據(jù)我們的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與經(jīng)驗(yàn)，熒光染色法在淺部標(biāo)本與深部標(biāo)本的檢測(cè)中，與KOH濕片法比較具有較大的優(yōu)勢(shì)，KOH濕片法因片中雜質(zhì)多，背景雜亂，標(biāo)本中的散在菌絲或孢子難以尋找辨認(rèn)，存在著主觀判斷的誤差，易漏檢的局限性，而使用熒光染色能快速有效的找到標(biāo)本中的菌絲或孢子，并且結(jié)構(gòu)清晰，明顯地提高了標(biāo)本的陽(yáng)性率。以往的文獻(xiàn)[1-7]已證實(shí)熒光染色法在真菌檢測(cè)中較傳統(tǒng)的KOH濕片法具有敏感性強(qiáng)，陽(yáng)性率高的特點(diǎn)。

表1各種標(biāo)本熒光染色法與KOH濕片法檢測(cè)真菌的陽(yáng)性率比較

Tab.1Comparison of the positive rates of various specimens in fungal detection between fluorescent staining and KOH

標(biāo)本來源(例)熒光染色法KOH濕片法陽(yáng)性(%)陰性(%)陽(yáng)性(%)陰性(%)皮屑(314)318(98.09%)6(1.91%)283(90.13%)31(9.87%)甲屑(76)69(90.79%)7(9.21%)57(75%)19(25%)毛發(fā)(10)10(100%)0(0%)7(70%)3(30%)痰(112)107(96.42%)5(3.58%)102(91%)10(9%)尿(64)63(98.4%)1(1.6%)61(95.31%)3(4.69%)胸水及其他體液(24)24(100%)0(0%)21(87.5%)3(12.5%)合計(jì)(600)581(97%)19(3%)531(88.5%)69(11.5%)

所以，熒光染色法不失為一種快速有效檢測(cè)真菌的新方法。萊芙特敏熒光染色液性質(zhì)穩(wěn)定，常溫下可保存2 a以上，但應(yīng)避光保存，否則影響染色效果。

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[本文編輯]衛(wèi)鳳蓮

Comparison of novel fluorescent staining and KOH microscopic examination in fungal measured by direct microscopy

HAN De-min,LIU Yuan-zhi,ZHU Jun-hao,LI Li,ZHANG Qiang-qiang

(The Lab of Medical Mycology,Department of Dermatology,Huashan Hospital,Fudan University,Shanghai 200040)

ObjectiveTo explore a reliable and rapid method in direct microscopic examination for fungi using novel fungal fluorescent staining.MethodsSamples from 600 clinically suspected cases of fungal infection were screened by fluorescent staining and KOH microscopic examination.ResultsFungal elements were detected in 97% of the cases by fluorescent staining and 88.5% by KOH.ConclusionsFluorescent staining is a reliable and effective method for fungi microscopic examination.

KOH；fungal direct microscopy；fungal fluorescent staining；fungal infections

國(guó)家自然科學(xué)基金(81573056)

韓德忞，男(漢族)，大專，技師.E-mail:sarekes@126.com

章強(qiáng)強(qiáng),E-mail:zhangqq8@163.com

R 446.5

A

1673-3827(2016)11-0240-03

2015-07-27