李玉珍 肖懷秋

(湖南化工職業(yè)技術(shù)學院制藥與生物工程學院，湖南 株洲　412000)

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秈碎米蛋白質(zhì)堿法提取工藝的優(yōu)化

李玉珍 肖懷秋

(湖南化工職業(yè)技術(shù)學院制藥與生物工程學院，湖南 株洲412000)

為提高秈碎米蛋白質(zhì)堿法提取效率，在Min-Run Res IV析因設計和爬陡坡試驗的基礎(chǔ)上，利用二次旋轉(zhuǎn)中心組合響應面優(yōu)化方法研究堿液濃度、秈碎米粒度、固液比對大米蛋白質(zhì)提取的影響規(guī)律，并優(yōu)化其提取工藝條件。結(jié)果表明，秈碎米蛋白質(zhì)最優(yōu)堿法提取工藝為堿液濃度0.09 mol/L，秈碎米粒度80目，固液比1∶13.5(g/mL)，堿提溫度50 ℃，堿提時間120 min。該條件下蛋白質(zhì)提取率為(82.25±2.53)%，大米蛋白質(zhì)產(chǎn)物純度為(91.68±1.26)%。

秈碎米；蛋白質(zhì)；堿法提取

由于現(xiàn)有碾米技術(shù)的限制，在大米加工中約產(chǎn)生10%～15%的碎米[1]，特別是秈米，由于其細胞結(jié)構(gòu)的特殊性，加工過程中碎米率更高[2]。近幾年，隨著人們對大米優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)資源研究的深入和對大米蛋白低過敏性的認同，大米蛋白質(zhì)逐漸成為研究的新熱點[3]。大米蛋白氨基酸配比合理，生物效價高，特別是賴氨酸含量是谷物中最高的，而且是唯一可免于過敏試驗的谷物蛋白[4-5]，可作為嬰幼兒食品的蛋白質(zhì)營養(yǎng)基料[6]，具有良好的應用價值和市場前景。大米蛋白質(zhì)主要為堿溶性的米谷蛋白，其在胚乳中與淀粉結(jié)合緊密，較難溶出。由于堿液能降低大米蛋白質(zhì)與淀粉的結(jié)合作用力，使極性基團發(fā)生解離，并使大米蛋白質(zhì)分子表面帶負電荷，從而起到增溶作用，同時，也促使淀粉與蛋白質(zhì)的有效分離，因此堿法提取適合于秈米及碎米中蛋白質(zhì)的提取[7]。孫慶杰等[8]以0.09 mol/L NaOH為堿提溶劑進行了大米中堿溶性米谷蛋白的堿法提取，優(yōu)化條件下蛋白質(zhì)提取率和純度分別為80.16%和90.10%；萬娟等[9]以秈碎米為原料，采用傳統(tǒng)堿法提取大米蛋白并優(yōu)化了大米堿溶性米谷蛋白提取工藝，優(yōu)化條件下蛋白提取率和純度分別為77.3%和80.5%；王威等[10]以質(zhì)量分數(shù)為0.35%的NaOH進行堿法提取大米蛋白，并對提取參數(shù)進行了優(yōu)化分析，優(yōu)化條件下蛋白質(zhì)提取率為80.4%。目前來看，有部分學者進行了堿法提取米谷蛋白的試驗研究，但局限于以單因素試驗與正交試驗進行提取工藝參數(shù)的優(yōu)化，由于單因素與正交試驗優(yōu)化方法本身的不足，因素間交互作用考慮較少，而析因設計和響應面優(yōu)化設計可以較好考慮各因素及因素間交互作用對響應值的影響。響應面優(yōu)化是一種尋找多因素系統(tǒng)中最優(yōu)條件的試驗設計方法，主要用于受多個變量影響的復雜灰色體系的優(yōu)化分析，可用于多變量非線性復雜體系的優(yōu)化和考察交互作用影響，通過構(gòu)建全局函數(shù)關(guān)系可實現(xiàn)快速建模和縮短優(yōu)化時間并能提高應用可信度，二次旋轉(zhuǎn)中心組合設計是響應面優(yōu)化方法的一種，具有試驗次數(shù)少、計算簡便、回歸系數(shù)間無相關(guān)性的優(yōu)點，并可利用旋轉(zhuǎn)性克服預測值方差對試驗點在因子空間位置的依賴性[11]，廣泛應用于試驗條件的優(yōu)化[12]。雖然堿提工藝會對大米蛋白氨基酸及提取設備造成一定的影響，但該法提取效率高、成本低且適宜于工業(yè)化生產(chǎn)[13]。因此，本試驗以秈碎米為研究對象，以低濃度堿液作為提取溶劑，在析因設計和爬陡坡試驗基礎(chǔ)上采用響應面試驗優(yōu)化秈碎米蛋白質(zhì)的堿法提取工藝，旨在為秈碎米蛋白質(zhì)資源的綜合利用提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

1.1.1材料與試劑

秈碎米：市售；其它試劑均為分析純。

1.1.2主要儀器設備

冷凍干燥儀：LABCONCO型，美國labconco公司；

冷凍離心機：HERMLE Z323K型，德國Hermle公司；

電熱恒溫水浴箱：DK-98-11A型，天津市泰斯特儀器有限公司；

紫外可見分光度計：752型，上海舜宇恒平儀器有限公司。

1.2方法

1.2.1秈碎米常規(guī)組分的分析蛋白質(zhì)測定采取凱氏定氮法、脂肪測定采取索氏抽提法、水分測定采取直接干燥法、灰分測定采取灼燒法進行含量測定[14]。

1.2.2秈碎米蛋白質(zhì)堿法提取工藝

秈碎米→烘干(50 ℃恒溫鼓風干燥24 h)→粉碎→堿提→過濾→離心(4 000 r/min，20 min)→上清液→調(diào)pH(用0.1 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH至5.2)→離心(4 000 r/min，20 min)→沉淀→水洗→調(diào)節(jié)沉淀pH至中性(用0.1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至7.0左右)→離心(4 000 r/min，20 min)→冷凍干燥(-83 ℃預冷，-53 ℃下冷凍干燥48 h)→大米蛋白質(zhì)

1.2.3秈碎米蛋白質(zhì)堿法提取工藝的優(yōu)化

(1) Min-Run Res IV析因設計：在預試驗基礎(chǔ)上擬考察堿液濃度、堿提溫度、堿提時間、秈碎米粒度和固液比對秈碎米蛋白質(zhì)提取的影響，因素編碼水平與實際水平見表1。

表1　析因設計編碼與實際水平

(2) 爬陡坡試驗：由于響應面優(yōu)化需在響應值最優(yōu)鄰域才能充分近似真實條件[15]，因此，各因素同時逼近其最優(yōu)鄰域時可表征各因素的真實影響。同時，基于析因設計方差分析與因素顯著性分析設置因素變化方向及步長。

(3) 響應面優(yōu)化：采用二次旋轉(zhuǎn)中心組合響應面優(yōu)化設計分析堿液濃度、秈碎米粒度和固液比對秈碎米蛋白質(zhì)提取的影響。利用Design Expert 8.0.6進行三因素五水平旋轉(zhuǎn)中心組合設計，共17次試驗(中心點重復試驗點為3個)。

1.2.4蛋白質(zhì)提取率與蛋白質(zhì)純度的測定固體蛋白質(zhì)含量采用凱氏定氮法測定(轉(zhuǎn)換系數(shù)為5.95[13])，溶液蛋白質(zhì)含量采用考馬氏亮蘭法[16]測定。蛋白質(zhì)提取率與蛋白質(zhì)純度分別按式(1)和(2)計算：

(1)

(2)

2　結(jié)果與分析

2.1秈碎米常規(guī)組分分析結(jié)果

對秈碎米的主要組分含量進行了測定，結(jié)果見表2。

表2　秈碎米主要常規(guī)成分含量

2.2Min-Run Res IV析因設計

堿液濃度、堿提溫度、堿提時間、秈碎米粒度和固液比對秈碎米蛋白質(zhì)提取率的影響見表3。

利用Design expert 8.0.6對表3進行線性回歸擬合得到回歸方程為：

y=27.02+2.65X1+0.90X2+1.40X3+7.35X4+15.67X5。

(3)

對表3數(shù)據(jù)進行方差分析與因素顯著性分析，結(jié)果見表4。

由表4可知，模型顯著性分析為顯著(P<0.05)，模型信噪比(signal to noise ratio，SNR)為6.795(>4)，說明模型精度符合要求。當模型存在因素間交互作用時，不能用回歸系數(shù)絕對值進行主效因素的篩選，宜用因子百分貢獻率進行比較[17]，其中X1、X4和X5百分貢獻率分別為1.54%，11.88%，50.70%，三因素累積貢獻率之和為64.12%，為主效因子且均為正效應，應進一步增加這些因素的取值水平。

表3　析因設計因素水平與結(jié)果

表4　析因設計方差分析與因素顯著性分析?

?**表示影響極顯著(P<0.01)；*表示影響顯著(P<0.05)；ns表示影響不顯著(P>0.05)。

2.3爬陡坡試驗

基于析因設計結(jié)果設定因素爬坡方向及步長，見表5。

由表5可知，鄰優(yōu)區(qū)域在2號，提取率最高。因此，以該條件為中心組合設計中心點。

2.4響應面優(yōu)化結(jié)果與分析

對堿液濃度、秈碎米粒度和固液比進行中心組合響應面優(yōu)化設計，因素編碼與實際水平見表6。

響應面優(yōu)化試驗方案與結(jié)果見表7。為減少試驗誤差，試驗隨機安排。

表5　爬陡坡試驗設計與結(jié)果?

?ΔX1=+0.02 mol/L；ΔX2=20目；ΔX3=1∶2(g/mL)。

2.4.1模型序貫分析與數(shù)學模型的構(gòu)建模型序貫分析(model sequential analysis，MSA)是響應面模型構(gòu)建的重要依據(jù)，各階模型序貫分析結(jié)果見表8。

由表8可知，一階線性模型顯著性分析為不顯著(P>0.05)，失擬項極顯著(P<0.01)。失擬項顯著表示此階數(shù)值模型數(shù)據(jù)擬合效果較差，需用更高階模型對數(shù)據(jù)進行擬合[18]；二因素交互關(guān)系模型失擬項極顯著(P<0.01)，也不宜對數(shù)據(jù)進行擬合；二階模型顯著性分析為極顯著(P<0.01)，R2= 0.960 7，Adj.R2=0.910 3，失擬項不顯著(P>0.05)，因此，用二階模型對數(shù)據(jù)進行擬合其精度是符合要求的。三階模型的模型顯著性分析和失擬項顯著性分析均不顯著(P>0.05)，不宜對數(shù)據(jù)進行擬合，而且所擬合回歸方程相對復雜，應用不便，因此，本試驗宜用二階模型對數(shù)據(jù)進行回歸擬合。擬合回歸方程為：

表6　響應面優(yōu)化因素編碼與實際水平

表7　響應面優(yōu)化設計與試驗結(jié)果

表8　響應面模型構(gòu)建序貫分析?

?**表示影響極顯著(P<0.01)；*表示影響顯著(P <0.05)；ns表示影響不顯著(P >0.05)。

(4)

2.4.2模型方差分析與回歸分析從模型方差分析和回歸分析結(jié)果(表9)可看出，回歸模型極顯著(P<0.01)，R2=0.960 7，Adj.R2= 0.910 3，說明該模型能解釋總變異的91.03%。模型失擬項不顯著(P>0.5)表明用該模型對數(shù)據(jù)進行預測不會造成數(shù)值失真。變異系數(shù)(CV)是衡量模型精密度和可靠性的重要評價指標，數(shù)值越小，模型越可靠[18]，模型CV為8.53%。模型SNR為14.107(>4)，說明該模型可很好的應用于數(shù)據(jù)分析和結(jié)果預測。

2.4.3模型降維分析(交互作用分析)當其它因素為零水平時，可觀察某兩個因素對響應值的影響并得到交互作用項的響應面圖和等高線圖(圖1)。響應曲面坡度比較平緩時表明交互作用對響應值影響不大，若非常陡，則表明交互作用對響應值影響顯著。等高線圖呈橢圓形且排列致密說明交互作用項對響應值影響顯著，若呈圓形則此時交互效應可忽略[9]。由圖1可知，交互作用項X1X2和X1X3對響應值影響較弱，而交互項X2X3影響則較強。

表9　回歸模型方差分析與回歸分析?

?**表示影響極顯著(P <0.01)；*表示影響顯著(P<0.05)；ns表示影響不顯著(P>0.05)；模型確定系數(shù)R2=0.960 7，模型調(diào)整確定系數(shù)Adj.R2=0.910 3。

圖1　因素交互作用響應曲面圖和等高線圖

2.4.4模型最優(yōu)解及驗證實驗響應變量分別對各自變量求偏導并令結(jié)果為零，聯(lián)立得到三元一次方程組，解逆矩陣得到響應面函數(shù)駐點(最優(yōu)解)，即X1=0.085 8 mol/L，X2=78.8目，X3=1∶13.32(g/mL)。為操作方便，將結(jié)果修約為堿液濃度0.09 mol/L，秈碎米粒度80目，固液比為1∶13.5(g/mL)，優(yōu)化條件下大米蛋白質(zhì)提取率為(82.25±2.53)%(n=3)，比表7中第2組試驗結(jié)果稍低，可能是試驗誤差造成的，比模型預測值84.655 1%稍低，偏差為-0.48%。制備得到的大米蛋白純度為(91.68±1.26)%(n=3)。

3　結(jié)論

因大米蛋白堿提效率受堿液濃度、堿提溫度、堿提時間、秈碎米粒度和固液比等多因素綜合影響，是一個復雜的灰色體系，為解析各因素的影響規(guī)律，本試驗在析因設計和爬陡坡試驗的基礎(chǔ)上應用二次旋轉(zhuǎn)中心組合響應面優(yōu)化方法研究了堿液濃度、秈碎米粒度和固液比的影響規(guī)律并獲得優(yōu)化條件，即堿液濃度0.09 mol/L，秈碎米粒度80目，固液比1∶13.5(g/mL)，堿提溫度50 ℃，堿提時間120 min。優(yōu)化條件下大米蛋白質(zhì)提取率和純度分別為82.25%和91.68%。結(jié)果表明，析因設計與響應面優(yōu)化技術(shù)聯(lián)用可很好用于秈碎米蛋白質(zhì)堿法提取工藝的優(yōu)化分析。

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Optimizating the alkaline extraction technology of broken long-grain rice protein

LI Yu-ZhenXIAOHuai-Qiu

(PharmaceuticalandBioengineeringSchool,HunanVocationalTechnicalCollegeofChemicalandIndustrialTechnology,Zhuzhou,Hunan412000,China)

To improve the efficiency of protein extraction from broken long-grain rice, a quadratic rotatable central composite response surface methodology (qrCCD-RSM) was utilized to investigate the affecting mechanism of alkali concentrations, broken long-grain rice particle sizes and solid-liquid ratios (SLR), based on the results of Min-Run Res IV factorial design and steep accent experiments (SAE). The optimal extraction condition was obtained, i.e. 80 mesh of broken long-grain rice was used to extrat proteins, soluting in 0.09 mol/L of NaOH buffer, with the SLR 1 g∶13.5 mL at 50 ℃ for 120 min. Under this optimized condition, the protein extraction rate and its purity was found to be (82.25±2.53)% and (91.68±1.26)%, respectively.

broken long-grain rice; protein; alkaline extraction

湖南省高?？蒲许椖?編號：12C1049)；國家自然科學基金(編號：31050012)；湖南化工職業(yè)技術(shù)學院院級課題(編號：HNHY2015002)

李玉珍，女，湖南化工職業(yè)技術(shù)學院講師，碩士。

肖懷秋(1981—)，男，湖南化工職業(yè)技術(shù)學院副教授，碩士。E-mail:xiaohuaiqiu@163.com

2015—12—06

10.13652/j.issn.1003-5788.2016.08.042