呂玉偉,呂亞維,楊澤熵,王睿劼,張雨靖,王英娟

(西北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院/西部資源生物與現(xiàn)代生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/生物技術(shù)省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 陜西 西安　710069)

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·生命科學(xué)·

貽貝蛋白Mgfp-5的原核表達(dá)與純化

呂玉偉,呂亞維,楊澤熵,王睿劼,張雨靖,王英娟

(西北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院/西部資源生物與現(xiàn)代生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/生物技術(shù)省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 陜西 西安710069)

貽貝(Mytilus galloprovincialis) 足絲中黏附蛋白，是一種黏合強(qiáng)度高、生物相容性好、優(yōu)質(zhì)的生物黏合劑,可以應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、表面化學(xué)、海洋工程等領(lǐng)域,其中富含DOPA(多巴,3,4-二羥基苯丙氨酸)的貽貝足絲蛋白5(Mytilus galloprovincialis foot protein type 5, Mgfp-5)顯著表現(xiàn)出此特性。天然獲取Mgfp-5含量低,易固化,純化困難,越來(lái)越多學(xué)者嘗試基因工程獲得黏蛋白。文中構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28a-mgfp,在大腸桿菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中誘導(dǎo)表達(dá)出重組蛋白Mgfp-5。為得到高質(zhì)量的Mgfp-5蛋白,優(yōu)化了Mgfp-5蛋白誘導(dǎo)表達(dá)參數(shù):菌液OD600=0.8,誘導(dǎo)劑異丙基-β-D巰基半乳糖苷(IPTG)0.8 mmol/L,37℃,誘導(dǎo)8h;優(yōu)化鎳離子親和層析純化蛋白Mgfp-5最佳條件為:Elution Buffer的pH為7.0,500 mmol/L咪唑。Western Blot鑒定到重組Mgfp-5可以特異性表達(dá)。該研究為得到大量Mgfp-5蛋白奠定了基礎(chǔ),為加速黏蛋白的黏附機(jī)理及生物醫(yī)學(xué)黏合劑的開(kāi)發(fā)提供參考。

貽貝;mgfp-5基因;原核表達(dá);優(yōu)化;純化

雙殼類軟體動(dòng)物貽貝(Mytilusgalloprovincialis)足腺分泌的黏性蛋白質(zhì),亦稱貽貝黏蛋白、多酚蛋白質(zhì)或貽貝足絲蛋白(Mytilusgalloprovincialisfoot protein,Mgfp)[1-3],富含酪氨酸經(jīng)羥基化修飾后的DOPA(多巴,3,4-二羥基苯丙氨酸)殘基[4-6]。DOPA殘基強(qiáng)的金屬螯合能力和強(qiáng)氫鍵的能力,利于Mgfp在任何環(huán)境尤其在潮濕性環(huán)境中,牢固黏附于不同材料表面[7-8]。Mgfp生物相容性好、無(wú)免疫原性,具有生物降解性[9-10],是一種優(yōu)質(zhì)的生物黏合劑,應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)[11-13]、表面化學(xué)及海洋工程領(lǐng)域[14-16]。Mgfp是由多種黏蛋白組成的復(fù)合體,目前已鑒定主要有Mgfp-1～Mgfp-6 6種類型黏附蛋白以及3種膠原蛋白質(zhì)前體(precollagen,preCoI)preCoI-D, preCoI-P,preCoI-NG。其中，Mgfp-5每4個(gè)氨基酸中就會(huì)有超過(guò)1個(gè)的DOPA,總含量高達(dá)25%～30%[17],具有強(qiáng)黏合力,是發(fā)揮黏附功能的主要蛋白分子,分布于貽貝足基底面及與外界接觸界面。

天然狀態(tài)下,從貽貝足部提取獲得的液態(tài)蛋白量極少,容易固化,而且提取成本很高。近年來(lái)有用大腸桿菌及酵母基因工程手段表達(dá)貽貝黏合蛋白的研究[18-20],但是效率極低,基因工程表達(dá)和純化仍然是制約貽貝黏合蛋白基因工程獲取的瓶頸。本研究通過(guò)構(gòu)建含有mgfp-5基因的原核表達(dá)載體,在E.coliBL21(DE3)中誘導(dǎo)Mgfp-5蛋白表達(dá),優(yōu)化Mgfp-5的誘導(dǎo)表達(dá)、純化條件,以期提高M(jìn)gfp-5蛋白的表達(dá)量，奠定大量獲得Mgfp-5蛋白的基礎(chǔ),為加速黏蛋白的黏附機(jī)理及生物醫(yī)學(xué)黏合劑的開(kāi)發(fā)提供參考。

1　材料和方法

1.1菌株與載體

大腸桿菌(Escherichiacoli,E.coli)BL21(DE3)及質(zhì)粒pET-28a由西北大學(xué)付愛(ài)根教授饋贈(zèng)。

1.2主要試劑與儀器

質(zhì)粒DNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒購(gòu)自天根生化生物公司;DNA Marker、限制性內(nèi)切酶、連接酶等購(gòu)自Takara公司;Protein Marker、ECL發(fā)光液購(gòu)自Thermo;Ni-NTA Agarose購(gòu)自Qiagen公司;一抗購(gòu)自Vazyme公司、二抗購(gòu)自北京中杉金橋生物有限公司;引物合成、測(cè)序于上海生工生物有限公司,其余化學(xué)試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3mgfp-5基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)貽貝Mgfp-5的cDNA mgfp-5(GenBank:AY521220.1)基因序列構(gòu)建含有目的基因mgfp-5的pUC57的克隆載體(本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存),以mgfp-5基因和pET-28a載體設(shè)計(jì)引物,PCR擴(kuò)增。正向引物(NdeI酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基):mgfp-5-F(5′-GGAATTCCATATGAGTTCTGAAGAAT);反向引物(EcoRI酶切位點(diǎn)保護(hù)堿基):mgfp-5-R(5′-CGGAATTCCTAACTGCTACCACCT)。PCR擴(kuò)增程序:94℃預(yù)變性5min;94℃變性30s;55℃退火30s;72℃延伸45s,循環(huán)34次,72℃延伸10min;凝膠電泳鑒定。

試劑盒回收的PCR產(chǎn)物和載體pET-28a,經(jīng)NdeI和EcoRI雙酶切,回收,T4DNA連接酶4℃連接16 h,轉(zhuǎn)化E.coliBL21,50 mg/L卡那霉素(Kan.)的LB固體篩選培養(yǎng)。挑取單克隆進(jìn)行菌落PCR和雙酶切驗(yàn)證,陽(yáng)性克隆測(cè)序,測(cè)序正確的質(zhì)粒命名為pET28a-mgfp。

1.4重組Mgfp-5蛋白的表達(dá)

1.4.1重組Mgfp-5的IPTG誘導(dǎo)pET28a-mgfp單克隆在含50 mg/L的LB液體培養(yǎng)基中，37℃，180 r/min過(guò)夜培養(yǎng)。同時(shí)設(shè)不含pET28a-mgfp的BL21為陰性對(duì)照。按體積比1∶100的比例擴(kuò)大培養(yǎng),37℃，180 r/min培養(yǎng)至菌液OD600為0.6～0.8,取1.0 mL為對(duì)照,其余菌液中加IPTG至終濃度1.0 mmol/L,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,取1.0 mL為誘導(dǎo)后樣品。12 000 r/min,2 min,PBS沖洗菌體沉淀2次,加上樣緩沖液,98℃,10 min,冰上冷卻,12 000 r/min,10 min,15% SDS-PAGE電泳分析Mgfp-5蛋白的表達(dá)。

1.4.2重組Mgfp-5的Western Blot用Western Blot鑒定E.coliBL21/pET28a-mgfp未誘導(dǎo)和誘導(dǎo)后的總蛋白:SDS-PAGE凝膠電泳電轉(zhuǎn)(濕轉(zhuǎn))到0.22 μm的PVDF膜上,轉(zhuǎn)化完全的膜,用TBST(20 mmol/L Tris-HCl,pH 7.5,150 mmol/L NaCl，體積分?jǐn)?shù)0.05% Tween 20)沖洗干凈;0.05g/mLTBST-脫脂奶粉封閉1.5～2h,TBST洗滌4次,每次8 min;加入抗His一抗(體積比1∶2 000,鼠單抗),4℃過(guò)夜孵育,TBST洗滌4次,每次8 min;加入二抗(體積比1∶5 000),常溫孵育3～4 h,TBST洗滌4次,每次8 min;ECL化學(xué)發(fā)光顯影。

1.5重組Mgfp-5表達(dá)形式的確定

設(shè)E.coliBL21(DE3)空載體菌落作為陰性對(duì)照,培養(yǎng)陽(yáng)性單克隆BL21/pET28a-mgfp至OD600為0.6～0.8時(shí),加入IPTG至終濃度1.0 mmol/L，4 h。收集1.0 mL菌液細(xì)胞,裂解液重懸沉淀,冰上超聲,4℃，12 000 r/min，15 min,取上清;沉淀用相同量裂解液重懸,SDS-PAGE分析Mgfp-5蛋白的表達(dá)形式。

1.6重組Mgfp-5表達(dá)條件優(yōu)化

誘導(dǎo)前菌體生物量:培養(yǎng)過(guò)程中,培養(yǎng)至不同OD600(0.4，0.6，0.8和1.0)菌液,同時(shí)加入IPTG誘導(dǎo)劑至終濃度為1.0 mmol/L,37℃，200 r/min，4 h誘導(dǎo)培養(yǎng);誘導(dǎo)溫度:菌液OD600=0.8,IPTG終濃度1.0 mmol/L,不同溫度(25，30，37℃),200 r/min，4 h誘導(dǎo)培養(yǎng);誘導(dǎo)時(shí)間:菌液OD600=0.8,IPTG終濃度1.0 mmol/L,37℃,200r/min,不同時(shí)間(0，2，4，6，8，10，12，16h)誘導(dǎo)培養(yǎng);IPTG濃度:菌液OD600=0.8,不同IPTG終濃度(0，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 mmol/L),37℃,200 r/min，4 h誘導(dǎo)培養(yǎng)。取誘導(dǎo)及未誘導(dǎo)菌液1.0 mL,冰上超聲裂解,離心后取上清,分析上述因素對(duì)蛋白Mgfp-5表達(dá)的影響。

1.7Mgfp-5的純化及條件的優(yōu)化

用優(yōu)化后的最佳表達(dá)條件進(jìn)行誘導(dǎo)、 培養(yǎng)、 收集菌體, PBS洗滌2次, 菌體用Binding Buffer(50 mmol/L NaH2PO4, 300 mmol/L NaCl,10 mmol/L咪唑, pH 8.0)重懸沉淀, 超聲破碎菌體細(xì)胞, 12 000 r/min離心20 min,0.45 μm過(guò)濾上清,濾液與Binding Buffer預(yù)處理的Ni2+柱結(jié)合;Wash Buffer (50 mmol/L,NaH2PO4,300 mmol/L NaCl,100 mmol/L咪唑,pH 8.0)沖洗3次;收集Elution Buffer洗脫液。以Elution Buffer洗脫液進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析,依次優(yōu)化Elution Buffer中的咪唑濃度(250，375，500，625 mmol/L;pH 8.0)及適合咪唑濃度條件下的最適pH(8.0，7.5，7.0，6.5)。

1.8Mgfp-5的Western Blot鑒定

方法同1.4.2,Western Blot分析重組菌株的未誘導(dǎo)及誘導(dǎo)后總蛋白、純化后的蛋白。

1.9蛋白量的檢測(cè)方法

灰度掃描SDS-PAGE凝膠并運(yùn)用軟件分析目的蛋白含量,以15kD左右特異性條帶為目標(biāo),計(jì)算Mgfp-5蛋白在可溶性蛋白中的含量。利用Bradford法檢測(cè)Mgfp-5蛋白濃度。

2　結(jié)果與分析

2.1原核表達(dá)載體pET28a-mgfp的構(gòu)建

以克隆載體pUC57-mgfp為模板,用1.3中的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增mgfp-5目的基因,擴(kuò)增的產(chǎn)物在預(yù)期的250bp附近出現(xiàn)條帶(圖1)。菌落PCR顯示(圖2)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子中有約250bp的目的條帶,而陰性對(duì)照菌落未見(jiàn)此條帶;在雙酶切鑒定結(jié)果(圖3)中,均出現(xiàn)了2條帶,其中可見(jiàn)大小約250bp的目的條帶,與mgfp-5基因預(yù)期大小一致;陽(yáng)性菌測(cè)序結(jié)果與GenBank中的mgfp-5基因序列比對(duì)100%相同,且插入位點(diǎn)正確(圖4),表明mgfp-5基因已經(jīng)成功嵌入表達(dá)載體pET-28a。

M DL15000 DNA Marker; 1-5 PCR擴(kuò)增的mgfp-5基因片段; 6 空白對(duì)照?qǐng)D1　貽貝mgfp-5 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳圖Fig.1　Agarose gel electrophoresis of the mgfp-5 PCR products

M DL2000 DNA Marker; 1-6 單克隆菌體; 7 陰性對(duì)照?qǐng)D2　重組表達(dá)質(zhì)粒的菌落PCR電泳圖Fig.2　Colony PCR identification of recombiannt expression vector

M DL15000 DNA Marker; 1-2 重組質(zhì)粒雙酶產(chǎn)物圖3　重組質(zhì)粒pET28a-mgfp的雙酶切鑒定Fig.3　Restriction enzyme digestion of the pET28a-mgfp prokaryotic expression plasmid by Nde I and EcoR I

圖4　DNA序列比對(duì)結(jié)果Fig.4　Result of DNA sequence alignment

2.2重組Mgfp-5蛋白的表達(dá)

2.2.1重組Mgfp-5的IPTG誘導(dǎo)pET28a-mgfp重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后經(jīng)過(guò)IPTG誘導(dǎo)(圖5), 重組Mgfp-5的SDS-PAGE分析符合預(yù)期,目的條帶出現(xiàn)在15kD附近,而陰性對(duì)照沒(méi)有，說(shuō)明Mgfp-5蛋白可以原核表達(dá)。重組Mgfp-5分子量約11.4kD,但是電泳條帶顯示目標(biāo)蛋白分子量大于11.4kD,分析可能是由于Mgfp-5蛋白的等電點(diǎn)(9.3左右)所致,高等電點(diǎn)的蛋白更易于結(jié)合SDS,從而增加了重組Mgfp-5蛋白的SDS-PAGE分子量[21]。

M Marker; 1-2 重組誘導(dǎo)，未誘導(dǎo); 3-4 空載誘導(dǎo)，未誘導(dǎo)圖5　融合蛋白的表達(dá)分析Fig.5　Expression analysis of Mgfp-5 fusion protein

2.2.2重組Mgfp-5的Western Blot利用pET28a-mgfp載體的mgfp-5基因序列的上游含有的組氨酸標(biāo)簽(His-tag),進(jìn)行重組Mgfp-5的Western Blot(圖6),可見(jiàn)誘導(dǎo)后的蛋白陽(yáng)性反應(yīng)帶,而未誘導(dǎo)蛋白無(wú)任何特異性的反應(yīng)條帶,證明Mgfp-5蛋白在E.coliBL21中已成功的表達(dá)。

1-2 未誘導(dǎo); 3-4 誘導(dǎo)圖6　Mgfp-5融合蛋白的Western Blot分析Fig.6　Western Blot analysis of Mgfp-5 fusion protein

2.3Mgfp-5蛋白存在形式的確定

IPTG誘導(dǎo)后分析上清和沉淀(圖7),陽(yáng)性重組BL21/pET28a-mgfp菌的上清液在約15kD處出現(xiàn)明顯的高水平表達(dá)的外源蛋白條帶,而在沉淀里沒(méi)有,說(shuō)明Mgfp-5蛋白主要以可溶性的形式存在,這與Hwang等在對(duì)重組Mgfp-5以可溶形式存在的研究相似[21]。

M Marker; 1-2空載上清，沉淀; 3-4 重組菌上清，沉淀圖7　融合蛋白Mgfp-5誘導(dǎo)表達(dá)的可溶性分析Fig.7　Soluble analysis of Mgfp-5 fusion protein

2.4誘導(dǎo)條件的優(yōu)化

2.4.1誘導(dǎo)前菌體生物量外源蛋白的表達(dá)會(huì)因細(xì)菌的生長(zhǎng)速率的變化而變化, 因此需要優(yōu)化菌液濃度?；叶葤呙桦娪緱l帶分析(圖8), Mgfp-5的表達(dá)量開(kāi)始時(shí)隨著菌液OD600值的增加而增加,在0.8時(shí)最高,為10.7%,當(dāng)OD600>0.8時(shí)表達(dá)量隨OD值增加而減少。這可能是細(xì)菌已處于過(guò)度生長(zhǎng)狀態(tài),細(xì)菌活力下降,死亡菌體數(shù)量增加,Mgfp-5的表達(dá)量隨之減少。選定蛋白表達(dá)量最高時(shí)的OD600=0.8,作為誘導(dǎo)前實(shí)驗(yàn)所選的最佳菌體培養(yǎng)生物量標(biāo)準(zhǔn)。

A SDS-PAGE結(jié)果　　　　　B 蛋白含量M Marker; 1-4 OD600依次為1.0, 0.8, 0.6, 0.4; 5 未誘導(dǎo)(OD600為0.6)圖8　誘導(dǎo)前菌體生物量對(duì)重組蛋白Mgfp-5表達(dá)的影響Fig.8　Optimization of for bacteria biomass inducing recombinant protein Mgfp-5 expression

2.4.2誘導(dǎo)溫度的確定誘導(dǎo)溫度不僅影響菌體的生長(zhǎng),也影響著外源蛋白的表達(dá)以及蛋白的可溶性,被認(rèn)為是表達(dá)外源蛋白時(shí)最大的影響因素[22]?；叶葤呙桦娪緱l帶,分析不同培養(yǎng)溫度對(duì)Mgfp-5蛋白表達(dá)量的影響(圖9),在37℃誘導(dǎo)重組蛋白Mgfp-5時(shí),可溶性形式存在的重組蛋白Mgfp-5表達(dá)量(12.3%)明顯優(yōu)于其他溫度的誘導(dǎo)。通常較高溫度誘導(dǎo)蛋白表達(dá)時(shí)容易出現(xiàn)錯(cuò)誤性折疊，形成包涵體而沉淀,而低溫誘導(dǎo)可以有助于蛋白的可溶性表達(dá)[23],與本實(shí)驗(yàn)嘗試的較高溫度誘導(dǎo)可溶性表達(dá)有異。

A SDS-PAGE結(jié)果　　　　　B 蛋白含量M Marke; 1 未誘導(dǎo); 2-4 依次為25, 30, 37℃誘導(dǎo)上清圖9　Mgfp-5蛋白的誘導(dǎo)溫度優(yōu)化Fig.9　Optimization of temperature for inducing recombinant protein Mgfp-5 expression

2.4.3誘導(dǎo)時(shí)間的優(yōu)化選擇不同時(shí)間誘導(dǎo)培養(yǎng)(圖10), Mgfp-5的表達(dá)量在8h之內(nèi)呈上升趨勢(shì), 8h后下降, 可能是隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng), Mgfp-5蛋白自身不穩(wěn)定或者被菌體內(nèi)源酶解所致;當(dāng)誘導(dǎo)8h時(shí),Mgfp-5的表達(dá)量最大(11.2%)。8h為最佳誘導(dǎo)時(shí)間。

2.4.4誘導(dǎo)劑IPTG濃度的優(yōu)化常采用誘導(dǎo)劑IPTG,誘導(dǎo)表達(dá)型工程菌的重組蛋白高效表達(dá)[24]。不同濃度IPTG誘導(dǎo)(圖11)Mgfp-5蛋白表達(dá),當(dāng)IPTG<0.8 mmol/L時(shí)，表達(dá)量與IPTG濃度呈正相關(guān),IPTG>0.8 mmol/L時(shí)蛋白的表達(dá)量與誘導(dǎo)劑濃度出現(xiàn)負(fù)相關(guān)。推測(cè)IPTG作為誘導(dǎo)劑時(shí),高濃度對(duì)菌株本身有一定的毒害作用,抑制菌株生長(zhǎng)[25],從而造成目標(biāo)蛋白的表達(dá)量的下降。0.8 mmol/L IPTG誘導(dǎo)時(shí),Mgfp-5表達(dá)量最高(16.7%),選定誘導(dǎo)最佳濃度為0.8 mmol/L。

A SDS-PAGE結(jié)果　　　　　B 蛋白含量M Marker; 1-8 誘導(dǎo)時(shí)間依次為0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 16 h圖10　Mgfp-5 蛋白的誘導(dǎo)時(shí)間優(yōu)化Fig.10　Optimization of time for inducing recombinant protein Mgfp-5 expression

A SDS-PAGE結(jié)果　　　　　B 蛋白含量M Marker; 1-5 IPTG濃度依次為1.2, 1.0, 0.8, 0.6, 0.4mmol/L; 6 未誘導(dǎo)圖11　Mgfp-5蛋白的IPTG誘導(dǎo)濃度優(yōu)化Fig.11　Optimization of IPTG concentration for inducing recombinant protein Mgfp-5

2.5重組蛋白純化條件的優(yōu)化

在Ni2+親和層析時(shí),咪唑起最關(guān)鍵的作用,Binding Buffer和Wash Buffer中低濃度的咪唑能夠有效的降低雜蛋白與Ni2+柱的結(jié)合,可減少純化步驟。Elution Buffer中高濃度的咪唑與His競(jìng)爭(zhēng)Ni2+有利于洗脫蛋白。pH的降低會(huì)使His殘基質(zhì)子化,減弱重組蛋白與樹(shù)脂結(jié)合位點(diǎn)的作用,使標(biāo)簽蛋白中的His不能夠與Ni2+結(jié)合,蛋白易被洗脫。

Ni2+柱純化的蛋白Mgfp-5,SDS-PAGE分析呈現(xiàn)單一條帶;Elution Buffer咪唑濃度為500 mmol/L時(shí)效果最好,繼續(xù)提高濃度洗脫效果變化不明顯(圖12)。在500 mmol/L咪唑時(shí)優(yōu)化洗脫pH,洗脫效果(圖13)隨著pH的降低而逐漸提高,當(dāng)pH降至7.0和6.5時(shí)洗脫效果相差不大?？紤]到較低的pH會(huì)降低蛋白活性[26],最終確定洗脫液pH為7.0。

M Marker; 1-4 咪唑濃度依次為625, 500, 375 , 250 mmol/L; 5 全蛋白圖12　不同咪唑?qū)χ亟M蛋白純化的影響Fig.12　Influence of different imidazole concentration on the Mgfp-5 purification

M Marker; 1-4 pH分別為8.0, 7.5, 7.0 , 6.5; 5 全蛋白圖13　不同pH對(duì)重組蛋白純化的影響Fig.13　Influence of different pH on the Mgfp-5 purification

2.6純化后Mgfp-5蛋白的鑒定

分別取重組菌株未誘導(dǎo)及誘導(dǎo)總蛋白,純化重組蛋白,Western Blot鑒定,結(jié)果顯示(圖14)純化蛋白與全菌液上清蛋白的顯色條帶與電泳中的條帶位置一致,為預(yù)期的重組蛋白Mgfp-5。

1 未誘導(dǎo); 2 誘導(dǎo); 3 純化的Mgfp-5圖14　Mgfp-5蛋白Western blot分析Fig.14　Western blot analysis of Mgfp-5

3　討論與結(jié)論

貽貝足絲蛋白組分中,Mgfp-5蛋白分子量最小,但多巴(DOPA)含量最高，為25%～30%[17],是開(kāi)發(fā)新型防水和生物醫(yī)療黏合劑的主要候選分子之一。20世紀(jì)80年代,人們開(kāi)始關(guān)注貽貝足絲蛋白及其基因的結(jié)構(gòu)、功能和相關(guān)黏附機(jī)制,但是其研究瓶頸一直是沒(méi)有足夠量的純品Mgfp-5蛋白?，F(xiàn)有的Mgfp-5蛋白主要靠天然獲取,然而其易固化、純化難、獲取量低,使得越來(lái)越多研究者嘗試基因工程解決此問(wèn)題。目前僅有Hwang等[21]在大腸桿菌中的表達(dá)地中海貽貝Mgfp-5蛋白,試圖得到重組蛋白,但是表達(dá)的重組蛋白在變性條件下,純化率低,蛋白量極少。資料少有通過(guò)探討不同誘導(dǎo)表達(dá)條件,來(lái)有效誘導(dǎo)Mgfp-5重組蛋白表達(dá)的研究。本文從Mgfp-5的高效表達(dá)入手,優(yōu)化了重組蛋白Mgfp-5誘導(dǎo)及純化條件。

His-tag是由6個(gè)組氨酸組成的短肽,目的蛋白與標(biāo)簽一起表達(dá)可以增加蛋白的可溶性,組氨酸短肽對(duì)重組蛋白的大小、功能以及免疫原性的影響都相對(duì)較低,且純化的蛋白可以直接制備抗體[27],本實(shí)驗(yàn)擇其優(yōu)點(diǎn)選取His-tag純化Mgfp-5蛋白。

重組蛋白原核表達(dá)系統(tǒng)中的菌液OD、誘導(dǎo)溫度、時(shí)間及誘導(dǎo)劑等,都影響到蛋白的表達(dá)量[22-26],優(yōu)化合適的工程菌株表達(dá)條件可以提高重組蛋白的產(chǎn)量。E.coliBL21/pET28a-mgfp在37℃,OD600=0.8,IPTG濃度為0.8 mmol/L誘導(dǎo)8h,可有效得到可溶性表達(dá)的目的蛋白Mgfp-5。在Ni2+柱的純化中,選擇合適的咪唑濃度和洗脫液的pH有助于獲得較高純度和較好功能的重組蛋白[26]。在Elution Buffer pH7.0時(shí),用500 mmol/L咪唑洗脫,可以純化得到Mgfp-5蛋白,SDS-PAGE灰度掃描分析純度達(dá)到96%。

本研究構(gòu)建了pET28a-mgfp表達(dá)載體并在E.coliBL21成功表達(dá)Mgfp-5,使用Ni2+柱層析純化、Western Blot鑒定重組的Mgfp-5。純化的蛋白Mgfp-5特異性條帶,比預(yù)估的11.4kD目標(biāo)條帶稍大一些,可能與蛋白本身攜帶電荷、高等電點(diǎn)更易結(jié)合SDS,造成電泳條帶有了一定的遷移[21]。在蛋白能夠表達(dá)的同時(shí)優(yōu)化了Mgfp-5蛋白在E.coliBL21中的表達(dá)及純化條件,獲得重組蛋白Mgfp-5,濃度為4.32 mg/mL,純化率為8.3%。本工作為后續(xù)單克隆抗體的制備、黏蛋白黏附機(jī)理研究及生物醫(yī)用黏合劑的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。

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(編輯陳鐿文)

Prokaryotic expression and purification ofMytilusgalloprovincialisfoot protein-5

Lü Yu-wei, Lü Ya-wei, YANG Ze-shang, WANG Rui-jie, ZHANG Yu-jing, WANG Ying-juan

(College of Life Science, Key Laboratory of Resource Biology and Biotechnology in Western China, Ministry of Education/Provincial Key Laboratory of Biotechnology, Northwestern University， Xi′an 710069， China)

The byssus ofMytilusgalloprovincialisproduce and secrete specialized adhesivesMytilusgalloprovincialisfoot protein type 5 (Mgfp-5) which has significant adhesive ability and biocompatibility and which is rich in high DOPA. It can be widely used in medical, chemical surface and ocean engineering or other fields. But the natural extraction of Mgfp-5 resulted in very little purified protein since this process is labor-intensive and inefficient, and these issues restrict its application. To obtain enough Mgfp-5 for the further study, gene fragments mgfp-5 were amplified and cloned it into the prokaryotic expression vector pET28a, then transformed it intoEscherichiacoli(E.coli) BL21(DE3) expression system. The expression of Mgfp-5 protein was induced by isopropyl-β-d-thiogalactoside (IPTG) and SDS-PAGE was used to identify Mgfp-5. The recombinant plasmid pET28a-mgfp was constructed correctly and the recombinant protein was expressed successfully. The factors including bacteria biomass, temperature, time and concentration of IPTG were optimized before induction. Recombinant protein was purified using Ni-NTA Purification System under native conditions. The optimum conditions for the induced expression of recombinant protein were determined as follows: the OD600of bacterial before induction with 0.8, the IPTG concentration of 0.8 mmol/L, the induction temperature of 37℃ and the induction time of 8 h. Recombinant protein was eluted with Native Elution Buffer (pH 7.0) containing 500 mmol/L imidazole. The specificity of the recombinant protein was confirmed using western blots. It can provide the basis for the Mgfp-5 manufacture, in-depth theoretical research and practical application. It can also provide a new way to develop a bioadhesive in medical or underwater environments.

Mytilusgalloprovincialis; mgfp-5 gene; prokaryotic expression; purification; optimization

2015-12-28

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31270411;31572665);陜西省教育廳社會(huì)發(fā)展攻關(guān)計(jì)劃基金資助項(xiàng)目(2012K120102);陜西省教育廳專項(xiàng)基金資助項(xiàng)目(12JK0827;12JS105)

呂玉偉,女,山東新泰人,從事轉(zhuǎn)基因及蛋白提取方面的研究。

王英娟,女,陜西西安人,西北大學(xué)副教授,博士,從事生物技術(shù)及細(xì)胞工程研究。

Q78

A

10.16152/j.cnki.xdxbzr.2016-03-016