李　軍　羅麗敏　樊　勇　張勇剛　黨書(shū)毅　丁文惠.北京大學(xué)第一醫(yī)院心內(nèi)科，北京　000；.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院心內(nèi)科，湖北十堰　00；.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科，遼寧沈陽(yáng)　0；.北京大學(xué)第一醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，北京　000；.汕頭大學(xué)第二附屬醫(yī)院心內(nèi)科，廣東汕頭　0

兩種血管外膜成纖維細(xì)胞培養(yǎng)方法的比較與經(jīng)驗(yàn)總結(jié)

李軍1，2羅麗敏3樊勇4張勇剛5黨書(shū)毅2丁文惠1
1.北京大學(xué)第一醫(yī)院心內(nèi)科，北京100034；2.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院心內(nèi)科，湖北十堰442005；3.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科，遼寧沈陽(yáng)110122；4.北京大學(xué)第一醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，北京100034；5.汕頭大學(xué)第二附屬醫(yī)院心內(nèi)科，廣東汕頭515041

目的比較兩種血管外膜成纖維細(xì)胞（AFs）培養(yǎng)方法的差異并總結(jié)經(jīng)驗(yàn)。方法 獲取大鼠主動(dòng)脈血管外膜組織，切成小塊，一部分采用組織貼塊法進(jìn)行原代培養(yǎng)，另一部分使用消化酶消化獲取細(xì)胞，使用相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)、免疫組化鑒定細(xì)胞內(nèi)特定蛋白表達(dá)、細(xì)胞計(jì)數(shù)計(jì)算生長(zhǎng)曲線等實(shí)驗(yàn)手段，并比較兩種方法之間的差異。結(jié)果 貼塊法和消化法均能成功獲得AFs；經(jīng)免疫組化檢測(cè)，兩種方法所獲的細(xì)胞波形蛋白（Vimentin）表達(dá)陽(yáng)性/a-平滑肌肌動(dòng)蛋白（a-SMA）表達(dá)陰性，證實(shí)培養(yǎng)的細(xì)胞為AFs。兩種方法獲得的細(xì)胞在細(xì)胞增殖期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期和平臺(tái)期的時(shí)間大致相同，二者的生長(zhǎng)、增殖比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論 貼塊法和消化法均能成功培養(yǎng)AFs，所獲得的細(xì)胞性狀穩(wěn)定、存活率高，可在體外穩(wěn)定地傳代培養(yǎng)，在血管重構(gòu)研究領(lǐng)域具有應(yīng)用價(jià)值。

血管外膜成纖維細(xì)胞；組織貼塊法；消化法；經(jīng)驗(yàn)總結(jié)

［Abstract］Objective To compare the differences of two methods in adventitial fibroblasts culture and summarize the experience.Methods Aortic vascular adventitia were separated from 6 specific pathogen free wistar rats，and cut into small pieces.Half of adventitial fibroblasts were isolated and cultured using tissue explants adherent method，others by digestion method.Phase contrast microscope was used to observe the cell morphology，immunohistochemistry was used to identify the expression of vimentin and a-smooth muscle actin，and cell counts to determine rate of cell growth and proliferation.The differences between two groups were compared.Results Massive adventitial fibroblasts were obtained successfully by both tissue explant adherent method and digestion method.All of them were confirmed to be Vimentin（+）/a-SMA（-）cells by immunohistochemistry，which represented adventitial fibroblasts.The rate of cell growth and proliferation were comparable between two groups and showed no statistically significant difference（P＞0.05）.Conclusion Adventitial fibroblasts can be obtained and cultured successfully both by tissue explants adherent method and digestion method.Stability and high survival rate of adventitial fibroblasts gained from both two methods make it valuable in the future study of vascular remodeling.

［Key words］Adventitial fibroblasts；Tissue explants adherent method；Digestion method；Experience summary

血管外膜在血管重構(gòu)的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起到了重要的作用，是多種心血管疾病發(fā)病的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，針對(duì)血管外膜的研究是當(dāng)前心血管領(lǐng)域研究熱點(diǎn)之一［1-2］。AFs是血管外膜的主要組成部分，它在體內(nèi)血管活性物質(zhì)作用下，通過(guò)分泌活性因子，參與細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化、增殖、凋亡、遷移及膠原的合成和分泌，從而參與血管的功能調(diào)節(jié)和修復(fù)過(guò)程［3-5］，AFs已成為治療心血管疾病的新靶點(diǎn)［6-8］。選擇合適的方法獲得AFs對(duì)于開(kāi)展血管重構(gòu)研究領(lǐng)域具有重要意義，本項(xiàng)目組在前期試驗(yàn)中［9-11］，通過(guò)組織貼塊法和消化法均能在短期內(nèi)獲得大量純度較高、生長(zhǎng)狀態(tài)良好的AFs，現(xiàn)在對(duì)兩種方法進(jìn)行比較并總結(jié)經(jīng)驗(yàn)。

1　材料與方法

1.1一般材料

4～6周齡（120～150 g，SPF級(jí)，屏障環(huán)境中飼養(yǎng)，普通飲食）健康雄性Sprague-Dawley大鼠由北京大學(xué)第一醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SYXK（京）2016-0001；DMEM/F12培養(yǎng)基、I型膠原酶和木瓜蛋白酶購(gòu)自Gibco公司；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購(gòu)自Hyclone公司；免疫組化用小鼠抗大鼠α-SMA和Vimentin單克隆抗體購(gòu)自武漢博士德公司，辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）和異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）標(biāo)記的二抗購(gòu)自碧云天公司，胰酶細(xì)胞消化液購(gòu)自北京普利萊公司；超凈工作臺(tái)為Thermo公司產(chǎn)品（Heraguard ECO 1.5）、倒置相差顯微鏡為日本Olympus公司出品（BIO500-PH）、CO2培養(yǎng)箱為日本SANYO公司產(chǎn)品（MCO-18AC）、熒光顯微鏡為 Leica公司產(chǎn)品（AF6000）。

1.2大鼠AFs的原代培養(yǎng)

1.2.1大鼠血管外膜的獲取取雄性Sprague-Dawley大鼠，麻醉后斷頸處死，立刻浸泡于75%酒精中，5 min后轉(zhuǎn)移至無(wú)菌手術(shù)臺(tái)上，沿正中線剪開(kāi)大鼠胸腔和腹腔，可見(jiàn)胸腹主動(dòng)脈沿脊柱左側(cè)緣走形，剪取胸腹主動(dòng)脈，浸泡于Hanks緩沖液中，無(wú)菌條件下轉(zhuǎn)移至超凈工作臺(tái)。先用含青鏈霉素的滅菌磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS）沖洗血管內(nèi)外殘留的血液，鈍性分離血管周圍的結(jié)締組織，然后用眼科剪將血管縱向剖開(kāi)，使內(nèi)膜面向上，用眼科彎鑷自上而下輕輕刮除內(nèi)膜后，再小心撕下近內(nèi)膜面的中膜平滑肌層，剩余的絮狀乳白色組織即為血管外膜［3，12-13］。

1.2.2貼塊法獲得Afs 將血管外膜組織用眼科剪剪成大小約1 mm×1 mm×1 mm的組織塊，均勻平鋪在25 cm2培養(yǎng)瓶的底部。輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶使瓶底面向上，向培養(yǎng)瓶中加入約6 mL含20%FBS的DMEM/ F12培養(yǎng)基，務(wù)必不要將組織塊沖掉。將培養(yǎng)瓶置入37℃、含5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中直立靜置2～4 h后，慢慢翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使培養(yǎng)液緩慢覆蓋組織塊，繼續(xù)培養(yǎng)約72 h后，可見(jiàn)AFs自組織塊周圍爬出。此時(shí)，不常規(guī)換液，僅向培養(yǎng)瓶中補(bǔ)加3 mL含 20%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基，既保證細(xì)胞生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)成分，又不會(huì)對(duì)培養(yǎng)液的PH值、溫度等造成大的影響。4～6 d后，待細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到70%～80%融合狀態(tài)時(shí)即可按1∶4傳代，取2～3代細(xì)胞進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)［14］。

1.2.3消化法獲得Afs取血管外膜組織，剪成小塊后，加入 1 mL消化液（消化液配方［15-16］：I型膠原酶0.5%、木瓜蛋白酶0.05%、牛血清白蛋白0.2%、二硫蘇糖醇1 mmol/L，使用不含氯化鈣的Hanks平衡鹽溶液溶解），37℃水浴15～30 min，然后經(jīng)200目不銹鋼濾網(wǎng)過(guò)濾消化液，加入2 mL培養(yǎng)液終止消化，1000 r/min離心2 min，棄掉上清液，加入5 mL含20%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基重懸，將細(xì)胞接種于60 mm的培養(yǎng)皿中，置于37℃、含5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后換液。此后每隔48 h換液一次，直至消化傳代。

1.3AFs的鑒定

蓋玻片泡酸并高壓消毒滅菌后，置于培養(yǎng)皿中，將AFs懸液種植于培養(yǎng)皿，待細(xì)胞生長(zhǎng)至50%融合狀態(tài)時(shí)，倒掉培養(yǎng)液，PBS沖洗，4%多聚甲醛固定20min，用含0.3%Triton X-100、1%牛血清白蛋白的PBS透化處理，加封閉血清室溫封閉60 min后，倒掉封閉血清，加小鼠抗大鼠α-SMA抗體及Vimentin抗體，37℃孵育2 h，PBS沖洗3 min×3次。免疫熒光法：滴加FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗，避光孵育60 min，倒置熒光顯微鏡下觀察結(jié)果，拍片。二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色法：滴加HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗，室溫孵育60 min后，PBS沖洗3 min×3次，滴加DAB顯色液，在顯微鏡下觀察控制反應(yīng)速速，1～5 min即可，自來(lái)水充分沖洗，蘇木素復(fù)染，鹽酸酒精溶液浸泡返藍(lán)，中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察結(jié)果，拍片。

1.4細(xì)胞生長(zhǎng)曲線測(cè)定

分別將貼塊法和消化法兩種培養(yǎng)方法獲得的第2代AFs消化，細(xì)胞計(jì)數(shù)后，用含10%FBS的DMEM/ F12培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為2×104個(gè)/mL，每孔1 mL接種于12孔培養(yǎng)板，放置培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每隔24 h收集每組3孔細(xì)胞并計(jì)數(shù)，取平均值，連續(xù)計(jì)數(shù)7 d后繪制生長(zhǎng)曲線［17］。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 5.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組之間均數(shù)的比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較用方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1AFs的原代培養(yǎng)

血管外膜組織塊在培養(yǎng)72 h后，可見(jiàn)少量成纖維細(xì)胞自組織塊邊緣爬出，漸向外生長(zhǎng)形成細(xì)胞暈，進(jìn)而形成細(xì)胞簇（圖1a）。剛長(zhǎng)出的細(xì)胞呈圓形，后變?yōu)闄E圓形，隨后細(xì)胞逐漸展開(kāi)，伸出偽足，形態(tài)多樣，呈梭形、多角形、星形或不規(guī)則形，大小略有差異（圖1b）。細(xì)胞逐漸圍繞組織塊呈放射性生長(zhǎng)，聚集成片（圖1c），傳代后80%～90%的細(xì)胞可重新貼壁生長(zhǎng)，其生長(zhǎng)方式及形態(tài)特點(diǎn)同前一致。消化法得到的細(xì)胞散在、成片分布，細(xì)胞形態(tài)和貼塊法一致（圖1d）。

2.2AFs的鑒定

取第2代AFs進(jìn)行鑒定，待細(xì)胞長(zhǎng)至50%融合狀態(tài)時(shí)，固定細(xì)胞，加入α-SMA及Vimentin一抗抗體孵育后，再滴加FITC/HRP標(biāo)記的二抗，顯微鏡下觀察、拍片。可見(jiàn)α-SMA在細(xì)胞中基本沒(méi)有表達(dá)（圖2a、2c），而Vimentin在AFs中高表達(dá)（圖2b、2d），證實(shí)培養(yǎng)的細(xì)胞為典型的AFs。

圖1　原代培養(yǎng)的AFs形態(tài)圖

圖2　鑒定體外培養(yǎng)的AFs

2.3兩種方法獲得的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線比較

傳代后AFs懸浮于培養(yǎng)液中，在重力的作用下逐漸下沉至培養(yǎng)板底，散在分布于培養(yǎng)板中，初始形態(tài)為圓形，后逐漸變成紡錘形、梭型、不規(guī)則性，細(xì)胞逐漸增大，3～6 h即完全貼壁，細(xì)胞伸出偽足并相互交織成網(wǎng)，逐漸形成細(xì)胞單層，鋪滿瓶底。AFs的倍增時(shí)間較短，在一段時(shí)間內(nèi)AFs數(shù)量與時(shí)間呈正相關(guān)，1～3 d為細(xì)胞增殖期、3～6 d為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、6～7 d為平臺(tái)期，與人皮膚成纖維細(xì)胞類似［17］。本項(xiàng)目中貼塊法和消化法所得細(xì)胞在細(xì)胞增殖期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期和平臺(tái)期的時(shí)間大致相同，二者的生長(zhǎng)、增殖比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖3　第二代貼塊法和消化法培養(yǎng)的AFs生長(zhǎng)曲線

3　討論

貼塊法是將組織剪成小塊，貼附在培養(yǎng)瓶上，加入培養(yǎng)液浸沒(méi)組織塊，讓細(xì)胞從組織塊中爬出的一種方法，其優(yōu)點(diǎn)在于操作簡(jiǎn)單、步驟少、成本低、影響因素少、細(xì)胞爬出時(shí)間固定，便于實(shí)驗(yàn)者把控時(shí)間［3］；缺點(diǎn)在于部分組織細(xì)胞爬出慢、耗時(shí)長(zhǎng)。消化法常采用膠原酶、胰酶、彈力酶、透明質(zhì)酸酶及鏈霉蛋白酶等酶將組織消化分散，使細(xì)胞從組織中脫落出來(lái)。優(yōu)點(diǎn)在于培養(yǎng)時(shí)間短，短期內(nèi)可以獲得大量細(xì)胞；缺點(diǎn)在于操作復(fù)雜、不同組織消化時(shí)間長(zhǎng)短不固定、不同種類的消化酶對(duì)細(xì)胞狀態(tài)影響較大、步驟繁瑣帶來(lái)污染概率增加，且消化酶昂貴，因而消化法的應(yīng)用受到一定限制。本項(xiàng)目參考北京大學(xué)第一醫(yī)院風(fēng)濕免疫科博士生高蘭、樊勇等人的經(jīng)驗(yàn)［15-16］，采用組合酶消化法，消化時(shí)間控制在0.5 h以內(nèi)，可以短時(shí)間內(nèi)獲得大量活細(xì)胞。一般而言，貼塊法從獲取組織到細(xì)胞傳代需要7～10 d，而消化法只需要5～6 d。細(xì)胞在傳代以后，兩種方法獲得AFs在增殖期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期和平臺(tái)期的時(shí)間大致相同，因而兩種培養(yǎng)方法在這一階段相比沒(méi)有差異。

AFs原代培養(yǎng)時(shí)難免混雜少量的其他細(xì)胞，包括平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等，利用AFs生長(zhǎng)速度快、數(shù)優(yōu)的特點(diǎn)，在傳代培養(yǎng)過(guò)程中能排斥其他細(xì)胞而優(yōu)先增殖，經(jīng)過(guò)幾代的傳代生長(zhǎng)后，能達(dá)到自然純化的效果，得到較高純度的AFs［18］。Vimentin是細(xì)胞骨架中間纖維家族成員，主要在成纖維細(xì)胞中表達(dá)；α-SMA主要表達(dá)于平滑肌細(xì)胞，所以可根據(jù)Vimentin表達(dá)陽(yáng)性/a-SMA表達(dá)陰性來(lái)鑒定成纖維細(xì)胞。本項(xiàng)目中兩種方法培養(yǎng)的細(xì)胞，使用免疫組化方法鑒定，可見(jiàn)Vimentin表達(dá)陽(yáng)性/a-SMA表達(dá)陰性，故而可以確定所培養(yǎng)的細(xì)胞為AFs。

原代培養(yǎng)第一次傳代時(shí)機(jī)的掌握非常重要，一般認(rèn)為選取細(xì)胞接近或完全融合成片時(shí)進(jìn)行傳代。貼塊法原代培養(yǎng)時(shí)由于組織塊的分布不均勻，且活性不一，導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)也不均勻，經(jīng)常是一些區(qū)域已長(zhǎng)成致密細(xì)胞層，一些區(qū)域仍未見(jiàn)細(xì)胞爬出，這種情況下，當(dāng)整瓶細(xì)胞達(dá)亞融合時(shí)，致密細(xì)胞層已“老化”，功能狀態(tài)不佳。所以可根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)狀況在細(xì)胞未達(dá)80%融合時(shí)進(jìn)行“原瓶”傳代，使細(xì)胞能均勻貼壁生長(zhǎng)及避免局部細(xì)胞“老化”。在細(xì)胞傳代消化以細(xì)胞成片收縮、變圓變亮、細(xì)胞間隙增大時(shí)為宜，若消化過(guò)度、時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，易嚴(yán)重?fù)p傷細(xì)胞膜，細(xì)胞難以貼壁成活，影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)，經(jīng)驗(yàn)是胰酶定量、時(shí)間固定、操作迅速、動(dòng)作輕柔、及時(shí)終止消化。

綜上所述，組織貼塊法和消化法均能成功培養(yǎng)AFs，兩種方法獲得的細(xì)胞性狀穩(wěn)定、存活率高，為從細(xì)胞水平研究血管重構(gòu)性疾病的發(fā)病機(jī)制提供了可靠的模型。

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Comparison and experience of two methods for the culture of adventitial fibroblasts

LI Jun1，2LUO Limin3FAN Yong4ZHANG Yonggang5DANG Shuyi2DING Wenhui1
1.Department of Cardiology，Peking University First Hospital，Beijing100034，China；2.Department of Cardiology，Taihe Hospital，Hubei University of Medicine，Hubei Province，Shigyan442005，China；3.Department of Dermatology，the First Affiliated Hospital of China Medical University，Liaoning Province，Shenyang110122，China；4.Department of Rheumatology and Clinical Immunology，Peking University First Hospital，Beijing100034，China；5.Department of Cardiology，the Second Affiliated Hospital，Shantou University Medical College，Guangdong Province，Shantou 515041，China

R322.1

A

1674-4721（2016）08（b）-0004-05

2016-04-20本文編輯：趙魯楓）

湖北省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2011CDC049）；太和醫(yī)院2014年國(guó)家級(jí)科研項(xiàng)目培育基金計(jì)劃（2014PY03）。

李軍（1981.9-），男，博士；研究方向：血管活性物質(zhì)在血管穩(wěn)態(tài)和重構(gòu)中的作用機(jī)制。

丁文惠（1954.4-），女，教授，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師；研究方向：血管重構(gòu)與心衰。