紀(jì)子騰， 陳慧珍， 孫　勇， 李清斌， 卓　洋， 李愛民

(徐州醫(yī)學(xué)院附屬連云港醫(yī)院 神經(jīng)外科， 江蘇 連云港　222002)

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大鼠面神經(jīng)干缺血后面運(yùn)動(dòng)核團(tuán)中嗅覺受體基因的表達(dá)*

紀(jì)子騰， 陳慧珍， 孫勇， 李清斌， 卓洋， 李愛民*

(徐州醫(yī)學(xué)院附屬連云港醫(yī)院 神經(jīng)外科， 江蘇 連云港222002)

目的： 分析大鼠面神經(jīng)干缺血缺氧對嗅覺受體(OR)基因表達(dá)水平的影響。方法： 手術(shù)阻斷大鼠鼓室段的巖動(dòng)脈復(fù)制大鼠單側(cè)面神經(jīng)缺血模型，將手術(shù)側(cè)作為觀察組，對側(cè)作為對照組，分別于術(shù)后第1、7及14天取大鼠雙側(cè)面運(yùn)動(dòng)神經(jīng)核團(tuán)，采用基因芯片篩選出觀察組表達(dá)量高于對照組3倍以上的OR基因，采用RT-PCR法進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果： 基因芯片掃描篩選出觀察組面神經(jīng)運(yùn)動(dòng)核團(tuán)中表達(dá)量高于對照組3倍以上的OR基因?yàn)镺lr400、Olr358、Olr757、Olr1689及Olr550，術(shù)后第1天及第7天，觀察組Olr400、Olr757及Olr358的表達(dá)量均顯著高于對照組，Olr550、Olr1689表達(dá)量顯著低于對照組(P<0.01)；術(shù)后第14天，兩組Olr400、Olr757、Olr358、Olr550及Olr1689表達(dá)量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；經(jīng)過RT-PCR法驗(yàn)證，上述5個(gè)OR基因在兩組面神經(jīng)運(yùn)動(dòng)核團(tuán)的表達(dá)水平與基因芯片檢測結(jié)果完全一致。結(jié)論：OR基因可能參與了面神經(jīng)損傷的早期修復(fù)過程。

面神經(jīng)損傷； 面神經(jīng)運(yùn)動(dòng)核團(tuán)； 嗅覺受體基因； 基因芯片； 缺血性損傷； 大鼠，Sprague-Dawley

面神經(jīng)損傷(facial nerve injury)是神經(jīng)外科較為常見的疾病之一，可導(dǎo)致?lián)p傷區(qū)域出現(xiàn)癱瘓癥狀或面癱，多由顱腦創(chuàng)傷或醫(yī)源性損傷引起[1-2]。嗅覺受體(Olfactory Receptor, OR)屬于G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptor, GPCR)家族，是一種細(xì)胞表面受體[3]。哺乳動(dòng)物的OR一般在鼻腔內(nèi)嗅覺上皮神經(jīng)元表面表達(dá)，但有研究發(fā)現(xiàn)，OR還在特定的非嗅覺組織中表達(dá)，因此認(rèn)為 OR除氣味識(shí)別功能外，可能還存在更多的生物學(xué)功能[1]。OR在人的中樞神經(jīng)系統(tǒng)表達(dá)廣泛，人的大腦皮層、丘腦、小腦的浦肯野細(xì)胞等部位均有OR表達(dá)[4]。但關(guān)于OR基因在面神經(jīng)的表達(dá)尚未見報(bào)道，本研究通過手術(shù)阻斷大鼠鼓室段的巖動(dòng)脈復(fù)制大鼠單側(cè)面神經(jīng)缺血模型，觀察手術(shù)前后OR基因表達(dá)水平的改變。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑

18只7～8周齡雄性SD大鼠(徐州醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供)，體質(zhì)量260～290 g，飼養(yǎng)于SPF環(huán)境下，每日光照12 h，自由飲水?？俁NA提取試劑為RNAiso Plus#9109(TAKARA)、RNA試劑為RNeasy micro kit (Cat#74004、 QIAGEN、 GmBH及Germany)和RNase-Free DNase Set (Cat#79254、 QIAGEN、GmBH及 Germany)，OR基因芯片Agilent Whole Rat Genome Oligo Microarray(4×44K,上海伯豪生物科技有限公司)，M-MLV試劑盒(凱基生物，南京)。

1.2方法

1.2.1單側(cè)面神經(jīng)缺血模型的建立及分組SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，參照文獻(xiàn)[5]復(fù)制大鼠單側(cè)面神經(jīng)缺血模型，采用10%的水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，常規(guī)消毒，沿耳廓外上緣做弧形切口，在顯微鏡下阻斷大鼠鼓室段的巖動(dòng)脈血流，局部采用生理鹽水沖洗，徹底止血后縫合手術(shù)切口。于術(shù)后第1、7及14天時(shí)分別處死大鼠，取雙側(cè)面神經(jīng)運(yùn)動(dòng)核團(tuán)，以手術(shù)側(cè)(缺血側(cè))面神經(jīng)運(yùn)動(dòng)核團(tuán)作為觀察組，以對側(cè)作為對照組。

1.2.2OR基因的表達(dá)采用基因芯片檢測，使用RNAiso Plus#9109提取面神經(jīng)運(yùn)動(dòng)核團(tuán)的總RNA，采用RNeasy micro kit和RNase-Free DNase Set純化RNA；應(yīng)用Agilent Whole Rat Genome Oligo Microarray基因芯片檢測OR基因表達(dá)，對芯片進(jìn)行掃描，所得數(shù)據(jù)采用GeneSpring Software GX 12.6.1 (Agilent technologies, Santa Clara, CA, US)軟件分析，篩選出觀察組表達(dá)量高于對照組3倍以上的OR基因，分別為Olr400、Olr358、Olr757、Olr1689及Olr550；采用RT-PCR法進(jìn)行驗(yàn)證。

1.2.3基因芯片檢測結(jié)果的驗(yàn)證采用RT-PCR法，使用1.2.2提取的總RNA，采用一步法進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，實(shí)驗(yàn)步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。RT-PCR的引物序列見表1。PCR反應(yīng)按照各自最適的條件進(jìn)行擴(kuò)增，以GAPDH作為內(nèi)參，檢測OR基因在面神經(jīng)運(yùn)動(dòng)核團(tuán)中的表達(dá)。

表1　OR基因引物序列

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2　結(jié)果

基因芯片掃描篩選出觀察組面神經(jīng)運(yùn)動(dòng)核團(tuán)中表達(dá)量高于對照組3倍以上的OR基因?yàn)镺lr400、Olr358、Olr757、Olr1689及Olr550；術(shù)后第1天及第7天，觀察組Olr400、Olr757及Olr358的表達(dá)量均顯著高于對照組，Olr550、Olr1689表達(dá)量顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；術(shù)后第14天，兩組Olr400、Olr757、Olr358、Olr550及Olr1689表達(dá)量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖1。經(jīng)過RT-PCR法驗(yàn)證，上述5個(gè)OR基因在2組面神經(jīng)運(yùn)動(dòng)核團(tuán)的表達(dá)水平與基因芯片檢測結(jié)果完全一致。見圖2。

注：A為術(shù)后第1天，B為術(shù)后第7天，C為術(shù)后第14天；(1)與對照組比較， P<0.01圖1　基因芯片檢測兩組面神經(jīng)運(yùn)動(dòng)核OR基因表達(dá)Fig.1　Gene chip detection of OR gene expression in facial nerve motor nucleus of two groups

注：A為術(shù)后第1天，B為術(shù)后第7天，C為術(shù)后第14天；(1)與對照組比較， P<0.01圖2　RT-PCR驗(yàn)證OR基因表達(dá)Fig.2　The expression of OR gene verified by RT-PCR

3　討論

面神經(jīng)損傷作為臨床較為常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，可顯著影響患者正常生活。神經(jīng)損傷后伴隨著一系列復(fù)雜的修復(fù)及代償過程，但機(jī)制尚未明確[6]。分析面神經(jīng)損傷修復(fù)過程中基因表達(dá)的改變有望為該疾病的診療提供新的思路。OR屬于G蛋白偶聯(lián)受體(G-protein coupied receptor)家族，哺乳動(dòng)物的OR主要分布在鼻腔后上部的嗅覺神經(jīng)元的嗅纖毛，發(fā)揮識(shí)別氣味分子的功能。研究發(fā)現(xiàn)，OR基因除在人的中樞神經(jīng)系統(tǒng)表達(dá)廣泛外，還存在于哺乳動(dòng)物的其他組織，如睪丸、前列腺、腸道、心臟、皮膚等[7-8]。目前，人們對于OR在非嗅覺組織中所發(fā)揮的功能尚不明確，但其廣泛的生物學(xué)功能提示該基因可能具有多重生物學(xué)功能。本研究嘗試分析面神經(jīng)損傷后，OR基因家族在面神經(jīng)運(yùn)動(dòng)核團(tuán)中的表達(dá)改變，以期深入認(rèn)識(shí)OR基因在面神經(jīng)損傷修復(fù)中的作用。

本研究首先建立面神經(jīng)缺血損傷的大鼠模型，采用單側(cè)手術(shù)對側(cè)對照的比較方式，采用兩種獨(dú)立的檢查方法分析面神經(jīng)損傷后OR基因家族在面神經(jīng)運(yùn)動(dòng)核團(tuán)中的表達(dá)改變?；蛐酒瑨呙韬Y選出觀察組面神經(jīng)運(yùn)動(dòng)核團(tuán)中表達(dá)量高于對照組3倍以上的OR基因?yàn)镺lr400、Olr358、Olr757、Olr1689及Olr550，術(shù)后第1天及第7天，觀察組Olr400、Olr757及Olr358的表達(dá)量均顯著高于對照組，Olr550、Olr1689表達(dá)量顯著低于對照組(P<0.01)；術(shù)后第14天，兩組Olr400、Olr757、Olr358、Olr550及Olr1689表達(dá)量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。經(jīng)過RT-PCR法驗(yàn)證，上述5個(gè)OR基因在2組面神經(jīng)運(yùn)動(dòng)核團(tuán)的表達(dá)水平與基因芯片檢測結(jié)果完全一致。提示OR基因在面神經(jīng)損傷后2周內(nèi)可能參與面神經(jīng)運(yùn)動(dòng)核團(tuán)內(nèi)的病理生理改變，但其具體發(fā)揮的功能及相關(guān)機(jī)制尚需進(jìn)一步探索以明確。既往研究顯示大鼠面神經(jīng)缺血性損傷模型動(dòng)物在術(shù)后2～3周即可出現(xiàn)面神經(jīng)功能的部分恢復(fù)[9]。面神經(jīng)并不參與嗅覺傳導(dǎo)通路，已有的研究也并未發(fā)現(xiàn)面癱大鼠伴有明顯的嗅覺缺失，這些表達(dá)差異性的OR基因在面神經(jīng)中的具體功能還有待蛋白水平上的進(jìn)一步研究[10]。但這提示OR基因可能參與面神經(jīng)損傷后的早期神經(jīng)修復(fù)過程，但具體機(jī)制不詳。OR基因的多功能性越來越受到關(guān)注。研究這些OR具體功能的難點(diǎn)在于目前可使用的特異性的OR抗原較少，它們在非嗅覺組織中所對應(yīng)的配體也難以確定。在基因水平上，非嗅覺組織表達(dá)的OR基因正陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)，但對于這些OR基因的調(diào)控方式尚有待研究。OR基因在嗅上皮表達(dá)的特點(diǎn)是單個(gè)嗅覺神經(jīng)元在接受氣味信號(hào)后僅表達(dá)一個(gè)OR基因；當(dāng)一種OR基因開始表達(dá)其他的OR基因立即會(huì)被沉默[11]。但人們在睪丸和肌肉等組織中發(fā)現(xiàn)單一細(xì)胞表達(dá)多種OR基因的現(xiàn)象，說明這種“One neuron-one receptor”原則在嗅覺系統(tǒng)以外的組織中可能并不適用[12]。深入對OR基因的研究有望給神經(jīng)損傷修復(fù)的治療帶來新的靶點(diǎn)。

綜上，面神經(jīng)缺血后OR基因在面神經(jīng)運(yùn)動(dòng)核團(tuán)中發(fā)生表達(dá)改變，且在術(shù)后2周內(nèi)恢復(fù)，提示OR基因可能參與了面神經(jīng)損傷的早期修復(fù)過程。

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(2016-05-25收稿，2016-08-30修回)

中文編輯： 吳昌學(xué)； 英文編輯： 劉華

Expression of Olfactory Receptors in Facial Motor Nucleus in Rats' Facial Nerve Ischemia

JI Ziteng, CHEN Huizheng, SUN Yong, LI Qingbin, ZHUO Yang, LI Aiming

(DepartmentofNeurosurgery,theLianyungangAffiliatedHospitalofXuzhouMedicalCollege,Lianyungang222002,Jiangsu,China)

Objective: To analyze the effect of facial nerve ischemia and hypoxia on expression of olfactory receptors(OR). Methods: The rats model of single side nerve ischemia was established by surgical interruption of rock artery in tympanic segment. The operation side was adopted as observation group and the other side as control group. Bilateral motor nuclei of the rat were taken at the 1st, the 7thand the 14thday after operation, respectively. The gene chip was adopted to scan and screen theORgene whose expression level of observation group was 3 times higher than that of control group, and RT-PCR method was used to verify theORgene. Results: TheORgene whose expression level of observation group was 3 times higher than that of control group in face nerve motor nuclei were Olr400, Olr358, Olr757, Olr1689 and Olr550. At the 1st and the 7th day after operation, the expression level of Olr400, Olr757 and Olr358 in observation was significantly higher than that of control group while the expression level of Olr1689 and Olr550 was significantly lower that that of control group (P<0.01). At the 14thday, there was no statistically significant difference in the expression level of Olr400, Olr358, Olr757 and Olr1689 (P>0.05). RT-PCR result showed that the expression level of the 5ORgene in in face nerve motor nuclei of the two groups was completely consistent with the gene chip detection results. Conclusion:ORgene may be involved in the early repair of facial nerve injury.

facial nerve injury; facial nerve motor nucleus; olfactory receptor; microarray; ischemic injury; rats,Sprague-Dawley

E-mail:liaimin6529@hotmail.com

R741

A

1000-2707(2016)09-1053-04

10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.09.014

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-09-13網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160913.2240.038.html